Yöntem makalesi

Bir Well-established organel izolasyon Kit kullanarak hızlı Lipid damlacık yalıtım Protokolü

DOI:

10.3791/59290

⸱

19 Nisan 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Gastroenterology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı bir roman yöntemi lipid damlacık tecrit ve arıtma fare karaciğer, bir iyi kurulmuş endoplazmik retikulum izolasyon kit kullanarak üzerinden kurar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipid damlacıkları (LDs) biyoaktif organelleri en ökaryotik ve bazı prokaryotik hücreler sitozol içinde bulundu vardır. LDs nötr lipitler fosfolipitler ve proteinler monolayer ile kaplı oluşur. Seramidler ve proteinlerinin hepatik LD lipidler hepatik yağlanma neden çeşitli hastalıklarda karıştığı. Önceki yöntemler LD yalıtım için kurulmuş olsa da, onlar reaktifler zaman alıcı bir hazırlık gerektirir ve birden çok hücre altı bölmeleri yalıtım için tasarlanmamıştır. Yalıtım LDs, endoplazmik retikulum (ER) ve organellerin tek fare karaciğer üzerinden etkinleştirmek için yeni bir iletişim kuralı kurmak istedi.

Ayrıca, tüm reaktifler burada sunulan protokolünde kullanılan piyasada bulunan ve LD saflık ödün vermeden en az reaktif hazırlık gerektirir. Burada veri standart Sükroz degrade iletişim kuralı, bu yeni iletişim kuralına karşılaştırma karşılaştırılabilir saflık, morfoloji ve verim gösteren mevcut. Ayrıca, biz ER ve aynı örnek kullanarak organellerin oluşumu ve lipidler ve onların ilişkili proteinler hücre içi akı gösteren ayrıntılı bilgilere sağlayan ortadan kaldırabilirsiniz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LDs sitozol en ökaryotik hücre ve bazı prokaryotik hücreler1,2,3biyoaktif organelleri vardır. LD çekirdek Trigliserid (TG) ve kolesterol esterleri gibi nötr lipitler oluşur. Ayrıca Seramidler, biyoaktif lipidler hücresel sinyal yolları4,5' te yer alan içerirler. LDs Fosfolipid monolayer tarafından çevrili ve perilipin protein perilipin 2 (PLIN2) ve 3 (PLIN3)1,5,6dahil olmak üzere proteinler ile kaplı. Ayrıca lipogenic enzimler, lipaz ve alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı, alkolik karaciğer hastalığı ve hepatit C3,5 de dahil olmak üzere birkaç hepatik steatotic hastalıklar için bağlı membran kaçakçılığı proteinler mevcuttur ,6,7,8,9,10.

LDs acil servis dış membran form ve serbest yağ asitleri ER elde edilen11' den kaynaklı yeni sentezlenmiş TG içeren düşünülmektedir. Havuza alınan lipidler bud, ancak, bilinmeyen kalır bağlı kalan veya ER6,11yalıtım LDS teknik olarak zor ER ücretsiz yapma, güvenliğe. Serbest yağ asidi LDS'den enerji üretim veya membran sentezi için sağlamak için yüzey lipazlar eylem tarafından özgür olmak. Ayrıca, LDs lipophagy bir düzenleyici mekanizma olarak ve serbest yağ asitleri12üretmek için düşebilir.

ER ve organellerin yanı sıra, diğer organelleri vardır — mitokondri, endosomes, tanımladıkları ve plazma zarı gibi — LDs11yakın ilişki içinde bulunur. Bu sıkı çok eşlilik bir saf LD çekimi gerçekleştirmek zorlaştırır. Ancak, nötr lipitler doğuştan gelen düşük yoğunluklu Santrifüjü5üzerinden avantaj alınabilir.

Geleneksel olarak, LDs Sükroz yoğunluk gradient1,5,13kullanarak izole edilmiştir. Ancak, bu yöntemleri diğer organelleri yalıtmak için tasarlanmış değil. Ayrıca, onlar reaktifler zaman alıcı hazırlık gerektirir. Bu iletişim kuralı bir piyasada bulunan ER yalıtım adapte LD yalıtım için izin vermek için (bkz. Tablo reçetesi) kit. Biz paketi tarafından sağlanan ayıklama arabellek LD yalıtım adım ekleme kullanın. Ayrıca, protokol ER ve LDs yaşam döngüsünün daha kapsamlı bir resim için izin aynı örnekleri kullanarak lizozomal yalıtım için de kullanılabilir. Bu yeni yöntem doğrulamak için LD verim, Morfoloji, boyutu ve saflık tahlil. Biz burada sunulan bu LD yalıtım için Sükroz degrade kullanan yaygın olarak kullanılan bir iletişim kuralı ile elde edilen sonuçlar karşılaştırın.

Biz bir 10 - için 12-hafta-yaşlı kullanılan, su ücretsiz erişim ile 16 h (5 Açıkhava 9: sabah LD yalıtım kez gıda kaldırmayı) için 20 g kadın C57BL/6 fare oruç tuttum. TG için tipik verim 0.6 mg/g karaciğer için LD protein, 0.25 mg/g karaciğer mi var... Bu ~ 10 immunoblots tarafından SDS sayfası için yeterli malzeme sağlar. Ayrıntılar kullanılan reaktifler aşağıda Protokolü ve bir tek 1 g karaciğer için uygun bir protokol. Sükroz degrade yalıtım Protokolü Sato14 ve Wu15uyarlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneyler ile kişisel koruyucu ekipman için biyogüvenlik düzeyi 1, önlük, eldiven ve koruyucu gözlük gibi uygun bir laboratuvar tezgah üzerinde yapılmıştır. Deneyler kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Pennsylvania Üniversitesi tarafından onaylanmış protokolleri göre yapıldı. Tüm çabaları hayvan rahatsızlık en aza indirmek için yapılmış ve hayvanlar ile insana ilişkin bakım tedavi edildi.

1. bir ER izolasyon kit kullanarak LD yalıtım

  1. Hazırlık
    Not: Listelenen tutarları tek 1 g fare karaciğer için uygundur.
    1. 10 mL 1 x izotonik ayıklama arabelleği (IE arabellek, ER izolasyon Kit) 5 x IE arabellek 2 mL 8 mL ultrasaf su ile sulandrarak hazırlayın. Arabellek buza yerleştirerek serin.
    2. 100 mL 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x 10 x PBS ultrasaf su 90 ml 10 mL sulandrarak hazırlayın. Buzda yerleştirerek sakin ol.
    3. 10 mL % 5 polietilen glikol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-fenil eter (PGPE) 9.5 mL ultrasaf su 500 µL sulandrarak, PGPE hazırlayın. 1 mL şırınga viskoz olduğu gibi PGPE ölçmek için kullanın. Buzda yerleştirerek sakin ol.
    4. Buzda yerleştirerek tüm tüpler cool: 1.7 mL microcentrifuge tüpler, 15 mL santrifüj tüpleri, 50 mL yüksek hızlı santrifüj tüpleri ve 13 mL ultracentrifuge tüpleri.
    5. 4 gerekli tüm santrifüjler serin ° C: bir microcentrifuge 15 mL için yüksek kapasite santrifüj tüpü 50 mL tüpler ve bir ultracentrifuge için yüksek hızlı bir santrifüj.
    6. Forseps ve diseksiyon makası tarafından ısıyla sterilize.
  2. Doku hazırlık
    1. Fare servikal çıkığı gerçekleştirerek % 100 CO2 10 dk. Onayla ötenazi için dolu bir odaya yerleştirerek ötenazi.
    2. Steril forseps ve karaciğer ortaya çıkarmak için arka/ön ekseninde karın kas ve deri katmanları kesmek diseksiyon makası kullanarak.
    3. Diyafram ve bağırsak karaciğer bağlayan ligament kesti. Forseps bağırsak karaciğer ligament ortaya çıkarmak için arka doğru uzak çekmek için kullanın.
    4. Karaciğer ve dorsal göğüs kafesi arasında kesme, posterior anterior karaciğer kadar hareketli özgür oldu.
    5. Karaciğer soğuk 5 cm 10 mL soğuk 1 x PBS ile Petri kabına aktarın.
    6. Karaciğer 2 yıkama x 10 ml soğuk 1 x PBS 5 cm Petri kabına 4 ° C'de 5 min için sallanan bir platformda. 1 x PBS sonra son yıkama dökün.
    7. Bir boyut-10 steril cerrahi bıçak kullanın (5 cm Petri kabına (şekil 1A) 3-5 mm parçalara karaciğer zar için Malzemeler tablobkz:).
    8. Doğranmış karaciğer 2 yıkama x 10 mL soğuk 1 x 5 cm Petri kabına 4 ° C'de 5 min için PBS ile.
      Not: Lysosome yalıtımı, 0.5 g karaciğer temiz 45 mL homogenizer aktarmak ve lysosome çıkarma tarafından sağlanan yönergeleri izleyin ( Tablo reçetesigörmek) kit.
    9. 1 x PBS dikkatle boşaltmak ve doğranmış karaciğer adet soğuk 45 mL Dounce homogenizer için transfer. Tüm taşlarını homogenizer altındaki gidin emin olun.
    10. 7 mL soğuk 1 x IE arabelleğinden (ER izolasyon kit) ekleyin ve buz üzerinde havaneli 20 x yukarı ve aşağı hareket ettirerek homojenize. Havaneli her inme sırasında homogenizer altına gider emin olun.
    11. Homogenate (şekil 1B) soğuk 15 mL santrifüj tüpü aktarın.
    12. Durulama soğuk 1 IE arabelleğinden (ER izolasyon kit) x 1 mL ile homogenizer ve bu homogenate geri kalanına ekleyin.
  3. LD yalıtım
    1. Çekirdeklerin 4 ° c (şekil 1 c) 10 dk 1000 x g de yüksek kapasite santrifüj homogenate centrifuging tarafından kaldırın.
    2. Postnuclear süpernatant (PNS) yeni, soğuk 50 mL santrifüj tüpü aktarın. LD kaybını önlemek için 15 mL tüp başında toplanan herhangi bir lipid PNS aktarmadan önce resuspended emin olun.
    3. 100 µL PNS saflık analizi için aliquot alıp bir soğuk 1.7 mL microcentrifuge tüpü yerleştirin. Buza koyun.
    4. Mitokondri kaldırmak için PNS örnek, 12.000 x g de buzdolabında yüksek hızlı santrifüj 4 ° C'de 15 dakika içinde aliquot değil santrifüj kapasitesi
      1. İsteğe bağlı: için ham LD (CID) yalıtır (sitozol ve hücre zarının kirlenme) ile cam pipet kullanarak üst lipit katmanı toplamak ve 1.7 mL microcentrifuge tüp transferi. 1.4 Bölüm devam ediyor.
    5. Postmitochondrial süpernatant (PMS) bir ultracentrifuge tüp aktarın. LD kaybını önlemek için üst kısmında toplanan herhangi bir lipid PMS aktarmadan önce resuspended emin olun.
    6. 100 µL PMS saflık analizi için aliquot alıp bir soğuk 1.7 mL microcentrifuge tüpü yerleştirin. Buza koyun.
    7. Bir ultracentrifuge tüp ağzına kadar soğuk 1 tüp ultrasantrifüj sırasında çöken önlemek için IE arabellek x ile doldurun.
    8. Örnekleri denge ve onları bir ultracentrifuge 60 dk 4 ° c (şekil 1 d) için 100.000 x g de içinde santrifüj kapasitesi.
    9. LD katman kaldırmak için tüp 45 ° açıyla eğilme ve Aspire edin için cam pipet kullanın. Pelet soğuk 1.7 mL microcentrifuge tüp aktarın.
      Not: Pelet izole ER içerir. Bu kesir aşağı ER yalıtımı için kullanma.
    10. Post-ER süpernatant (PER) altında lipit katmanı saflık analizi için 100 µL toplamak.
  4. LD çamaşır
    1. 1 x PBS 1.3 mL toplam hacmiyle 1.7 microcentrifuge tüp içinde toplanan LD kesir ekleyin.
    2. Girdap örnek.
    3. Bir microcentrifuge 4 ° C'de herhangi bir hücre artıkları cips için 5 min için üst hızda santrifüj kapasitesi. Tüpü yavaşça elle LD katman resuspend yardımcı olmak için sıcak. Lipid katmana yeni bir 1,7 mL microcentrifuge tüp de dahil olmak üzere süpernatant, aktarın.
    4. Adımları 1.4.1–1.4.3 tekrar 2 x-3 x, pelet görünene kadar.
    5. 1 x PBS Pelet ücretsiz LD 1,5 mL nihai bir birime süpernatant ekleyin. Yıkama lipid kısmı bir microcentrifuge 4 ° C'de 5 min için üst hızda Santrifüjü tarafından
    6. 1 mL 1 x PBS (altında lipit katmanı) cam pipet ile lipit katmanı bozmadan kaldırın.
    7. 1.4.5 ve 1.4.6. adımları yineleyin 4 x x-5, 1 x PBS yok bulanıklık ile görsel olarak saydam olana.
    8. Tümünü Kaldır cam pipet (şekil 1E) kullanarak 1 x PBS lipid katmanın altında.
    9. Sonuç, saf LD kesir aşağı akım analizi için kullanın.
  5. LD protein Nefelometri bicinchoninic asit tahlil tarafından
    Not: LD Morfoloji değerlendirilmek için ise bir bicinchoninic asit tahlil (BCA) kullanmayın.
    1. LD % 5 PGPE 500 μL içinde resuspend.
    2. Örnekleri 95 ° C'de 5 dakika kaynatın girdap onları ve örnekleri soğuması 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.
    3. 1.5.2 ek 2 x arasındaki adımları yineleyin.
    4. Örnekleri ile bir 30 5 min için solüsyon içeren temizleyicide s açma/kapama döngüsü, Orta yoğunluk.
    5. Örnekleri BCA tahlil tarafından protein konsantrasyonu tüm saflık analizi örnekleri ve LD kesir ölçerek normalleştirmek.

2. Sükroz yoğunluk gradient kullanarak LD yalıtım

  1. Hazırlık
    1. TE arabellek (10 mM Tris-[pH 7.4], HCl 1 mM EDTA [pH 8.0]) 200 mL olun. Buzda yerleştirerek sakin ol.
    2. 100 mL % 60'ı (w/v) Sükroz çözeltisi TE arabellekte 60 g Sükroz son hacim için 100 mL getiren TE arabellekte çözülerek olun. Buzda yerleştirerek sakin ol.
    3. 6 mL % 40 (w/v) Sükroz çözeltisi % 60 Sükroz 4 mL 2 mL TE arabelleği ekleyerek olun. Buzda yerleştirerek sakin ol.
    4. 6 mL % 25 (w/v) Sükroz çözeltisi TE arabellek için 3,5 mL 2.5 mL % 60 Sükroz ekleyerek getirin. Buzda yerleştirerek sakin ol.
    5. 4 mL % 10 (w/v) Sükroz çözeltisi TE arabellek için 3,3 mL % 60 Sükroz 0.7 mL ekleyerek getirin. Buzda yerleştirerek sakin ol.
    6. Fosfataz ve proteaz inhibitörü çözüm 10 mL 10 mL TE arabelleği fosfataz ve proteaz inhibitörleri bir tablet ekleyerek getirin.
    7. Doku homogenate arabellek 4 mL fosfataz ve proteaz inhibitörü çözeltisi 50 mL % 60 Sükroz stok çözeltisi ekleyerek hazırlayın. Buzda yerleştirerek sakin ol.
    8. Bindirme arabellek TE arabellek için 50 mL 2 mL fosfataz ve proteaz inhibitörü çözeltisi ekleyerek hazırlayın. Buzda yerleştirerek sakin ol.
    9. 100 mL 1 x PBS 10 x PBS ultrasaf su 90 ml 10 mL sulandrarak hazırlayın. Buzda yerleştirerek sakin ol.
    10. 10 mL % 5'lik hazırlamak 9.5 mL ultrasaf su 500 µL sulandrarak, PGPE tarafından PGPE. 1 mL şırınga viskoz olduğu gibi PGPE ölçmek için kullanın. Buzda yerleştirerek sakin ol.
    11. Aşağıdaki santrifüj tüpleri buza yerleştirerek cool: 1.7 mL microcentrifuge tüpler, 15 mL santrifüj tüpleri, 50 mL yüksek hızlı santrifüj tüpleri ve 13 mL ultracentrifuge tüpleri.
    12. 4 gerekli santrifüjler serin ° c a microcentrifuge, yüksek kapasite santrifüj (15 mL tüpler için) (50 mL tüpler için) yüksek hızlı bir santrifüj ve bir ultracentrifuge.
  2. Doku hazırlık
    1. Doku homojenizasyon için hazırlamak için adımlar 1.2.1–1.2.9 kullanın.
    2. 7 mL soğuk doku homogenate arabellek ekleyin ve havaneli 20 x yukarı ve aşağı hareket ettirerek buza lunaparkçı. İlk beş vuruş sırasında havan tokmağı homogenizer altına gider emin olun.
    3. Homogenate soğuk 15 mL santrifüj tüpü aktarın.
    4. Homogenizer 1 mL soğuk doku homogenate arabelleği ile durulayın ve önceden kullanılan 15 mL santrifüj tüpü için transfer.
    5. Homogenate hacmi getirmek doku homogenate arabellek ile ilâ 10 mL.
    6. 1000 x g de yüksek kapasite santrifüj 4 ° C'de 10 dakika için örnekte santrifüj kapasitesi
    7. Transfer süpernatant 8 mL 50 mL santrifüj tüpü.
    8. Saflık analizi için PNS örnek olarak, kalan süpernatant 100 µL aktarın.
  3. Sükroz gradyan
    1. PNS 45 ° açıyla 8 mL içeren 50 mL santrifüj tüpü yatırmak. 6 mL % 40 Sükroz çözeltisi, iki aşamada ayrı kalmak sağlamak dikkatle ekleyin.
    2. Benzer şekilde, yavaş yavaş 6 mL % 25 Sükroz çözeltisi ekleyin; daha sonra 4 mL % 10 Sükroz çözeltisi ekleyin; son olarak, bindirme arabellek 8 mL ekleyin.
    3. 30 dk için yüksek hızlı bir santrifüj 30.000 x g 4 ° c de örnekte santrifüj kapasitesi.
    4. 1.7 mL microcentrifuge Tube LDs içeren üst tabaka aktarın.
    5. LD yıkanmasında 1.4 bölümündeki adımları izleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz LD yalıtım ER kiti ile yaklaşık 30 fareler üzerinde yapılan ve yaklaşık 40 fareler üzerinde Sükroz yalıtım Protokolü izleyenler ile sonuçları karşılaştırılır. Her iki protokoller için tipik bildirilen bulgulardir. Fareler gecede LD verimi artırmak için su, ücretsiz erişim ile oruç. Sükroz degrade kullanarak LD yalıtım ER kiti LD yalıtım protokolü ile paralel olarak çalıştırıldı. PNS, PMS, örnekleri başına, CLDs ve LDs ER kiti LD yalıtım Protokolü toplanan. İş akışı kısıtlaması nedeniy...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatik LD Biyoloji giderek kritik bir regülatör hepatosellüler Fizyoloji sağlığı ve hastalıkları olarak kabul. Olarak iyi niyetli organelleri, LDs dinamiktir, diğer Hücresel yapıları ile etkileşim ve biyoaktif bileşenler lipid ve glukoz homeostazı yer onları içinde içerir. Sükroz degrade LD yalıtım için rutin olarak kullanılan ve Müfettişler LD yapısı çalışma sağlar, ancak çok sayıda arabellekleri yapmak onlara gerektirir. Biz piyasada bulunan bir ER izolasyon kit kullanımı tandem yalıtım ER ve lysosome, ama sadece LD y...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Carr müdahale ilaç araştırma desteği alır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abramson aile Kanser Araştırma Enstitüsü teşekkür ediyoruz. Bu eser aşağıdaki hibe tarafından desteklenir: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Robert Wood Johnson Vakfı, Harold Amos Tıp Fakültesi geliştirme Ödülü, 7158, IDOM DRC Pilot Ödülü P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (JC). Bu eser kısmen NIH P30-DK050306 tarafından desteklendi ve çekirdek tesisleri (Moleküler Patoloji ve Imaging Core, moleküler biyoloji/gen ifade çekirdek ve hücre kültür Core) ve pilot program verin. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BioExpress Vorteks KarıştırıcıGeneMate S-3200-1Vorteks Karıştırıcı
Santrifüj 54242 REppendorf54242 R SoğutmalıSayaç Mikrosantrifüj
Rotor: FA-45-24-11
Santrifüj Sorvall RC6 +Thermo ScientificRC6 +Soğutmalı Yüksek Hızlı Santrifüj
Rotor: F21S-8x50y
Santrifüj Sorvall Legend RT +Thermo ScientificLegend RT +Soğutmalı Yüksek Kapasiteli Santrifüj
Rotor: 75006445 Kova: 75006441
cOmplete Proteaz İnhibitörü KokteylSigma Aldrich04 693 116 001Proteaz İnhibitör Tabletleri
Diagenode Bioruptur UCD-200DiagenodeUCD-200Sonication Sistemi
Dounce Doku Öğütücü (45 mL)Wheaton357546Gevşek havaneli kullanın
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu (1x)Corning21-031-CM
Endoplazmik Retikulum İzolasyon KitiSigma AldrichER0100ER kiti için Ekstraksiyon: < br / > İçindekiler: < br / > İzotonik Ekstraksiyon Tamponu 5X 100 mL < br / > Hipotonik Ekstraksiyon Tamponu 10 mL < br / > Kalsiyum klorür, 2.5 M çözelti 5 mL < br / > OptiPrep Yoğunluk Gradyan Ortamı 100 mL < br / > Künt Burunlu İğne 1 adet.
Floresan uyarım için harici ışık kaynağıLeicaLeica EL6000
Hidroklorik asitSigma AldrichH1758Hidroklorik Asit
ImageJGörüntü Analiz Yazılımı
Ters Modülasyonlu Kontrast MikroskobuLeica LeicaDM IRB
Dokular ve Kültürlenmiş Hücreler için Lizozom Zenginleştirme KitiThermo Fisher Lizozomİzolasyon Mikroskobu için89839
Kamera QimagingQICAM hızlı 1394
Optima XL-100K UltrasantrifüjBeckman-CoulterXL-100KUltrasantrifüj
Rotor: SW41Ti
Pastör PipetleriFisher Scientific22-042817
Pierce BCA Protein Test KitiThermo Fisher Scientific23225
PhosSTOPSigma Aldrich04 906 845 001Fosfataz İnhibior Tabletler
Steril Cerrahi Bıçak #10PioneerS2646
SükrozFisher ScientificS5-500Kristal/Sertifikalı ACS
Trigliserit LiquicolorKiti Stanbio 2200-225Kolorimetrik Trigliserit kiti
Tris BaseFisher ScientificBP152-1TE tamponu
için Triton X-100Fisher BioReagentsBP151-100%5, Polietilen glikol p- (1,1,3,3-tetrametilbutil) -fenil eter, Protein Lizis Reaktifi
UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0)TE tamponu içinThermo Fisher Scientific15575-038
Bilimsel Petri Kabı 5 cm Fisher Scientific FB0875713A

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).
  2. Ding, Y., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).
  3. Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49(2015).
  4. Correnti, J. M., et al. Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells. Scientific Reports. 8 (1), 12923(2018).
  5. Williams, B., et al. A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis. FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).
  6. Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
  7. Carr, R. M., et al. Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic. Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).
  8. Carr, R. M., et al. Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).
  9. Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice. PLoS One. 9 (5), e97118(2014).
  10. Tsai, T. H., et al. The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver. Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).
  11. Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).
  12. Liu, K., Czaja, M. J. Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).
  13. Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas. Journal of Visualized Experiments. (86), e509814(2014).
  14. Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).
  15. Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R. 3rd, McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).
  16. Zhang, S., et al. Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations. Scientific Reports. 6, 29539(2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Lipid Droplet IsolationEndoplasmic Reticulum IsolationLysosome IsolationOrganelle Isolation KitLiver Tissue PreparationDifferential CentrifugationUltracentrifugation ProtocolLipid Droplet Purity AnalysisPLIN2 Marker DetectionSEC61A Protein Assay

İlgili makaleler