Yöntem makalesi

Mitokondriyal solunum zinciri Süperkompleksleri ayrımı ve analizi için hibrid Clear/mavi yerli Elektroforez

15.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/59294

⸱

19 Mayıs 2019

 , 
1Interdisciplinary School of Health Science, Faculty of Health Sciences and Department of Cellular and Molecular Medicine, Faculty of Medicine, University of Ottawa

Bu makalede

Özet

Burada, deterjanlara ve Coomassie Blue 'ya maruz kalmayı en aza indiren mitokondrial süperkompleksleri ayıklamak, çözmek ve tanımlamak için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, çözünürlük ve enzim faaliyetlerinin korunması arasında optimum bir denge sunarken, labil protein-protein etkileşimlerini kaybetme riskini en aza indirir.

Özet

Oksidatif fosforilasyon makinelerinin kompleksleri, mitokondri için yapısal ve fonksiyonel avantajları yerine getireceği inanılan süperkompleks (SCs) adlı Supramoleküler protein düzenlemelerini oluşturmaktadır. SCs, mayadan memeliye kadar pek çok tür içinde tespit edilmiş ve artan sayıda çalışmada genetik ve elde edilen insan hastalıklarında örgütlerinin bozulması rapor edilmiştir. Sonuç olarak, laboratuarları artan sayıda, metodolojik olarak zor olabilir SCs analiz ilgilendi. Bu makalede, bir zaman etkin şekilde SCs çözümlemek ve çözümlemek için mavi ve Clear yerel PAGE yöntemlerinin avantajlarını birleştiren en iyi duruma getirilmiş bir protokol sunar. Bu hibrid CN/BN-PAGE yöntemi ile, hafif deterjan digitoninin optimum miktarlarda ayıklanan mitokondriyal SCs, diğer deterjanlara maruz kalmadan, Elektroforez başında anyonik boya Coomassie Blue (CB) kısaca maruz kalır. Bu kısa CB 'ye maruz kalma, SCS 'de yüksek CB düzeylerinin negatif etkisini kaçınarak ve SCS içindeki labil protein-protein etkileşimleri ile geleneksel bn-Page metotları gibi etkin bir şekilde ayrı ve çözülmesine olanak sağlar. Bu protokol ile, bu nedenle, tam ve hızlı jel aktivite ölçümlerini 2B Elektroforez, immüno-algılama ve/veya yüksek SCs analizi için proteomik içeren analitik tekniklerle birleştirmek mümkündür.

Giriş

Mitokondri Oksidatif fosforilasyon ile enerji üretmek, nerede solunum kompleksler ı-II-III-IV oksitler substratlar ve oksijen transfer elektronlar, ATP sentaz (CV) tarafından ADP fosforilasyon sağlayan bir gradyan üreten. Geçtiğimiz yıllarda, yoğun çalışmalar solunum zinciri kompleksleri sadece iç mitokondriyal membranın doğrusal bir şekilde dahil olmadığını göstermiştir, ancak aynı zamanda süperkompleksleri (SCs) düzenlemeleri1,2içine düzenlenir. Mammalin mitokondri olarak, SCs farklı stoichiometries var: CI/cııı2/civ1-4 (hangi RESPIRASOME adlı ve NADH yeteneğine sahiptir: O2 oxidoreduction ın VITRO)2, CI/cıii2, ve ciii2 /Civ1-23,4. Ayrıca, solunum kompleksler serbest form ve SCs düzenlemeleri arasında farklı oranlarda dağıtılır. Bu nedenle, bu tahmin edilmektedir 85%-100% CI, 55% – 65% cııı, ve 15%-25% CıV SCs bulunur4. Bu Supramoleküler yapıları ROS üretimini azaltmak için düşünülmesi, stabilize veya bireysel kompleksleri montaj yardımcı, solunum zinciri etkinliğini düzenleyen, ve protein zengin iç mitokondriyal membran protein toplama önlemek5 ,6,7,8. Çeşitli laboratuvarlarda enerji talep ve hastalıkların patogenezinde önemini varyasyon üzerine yeniden modelleme yeteneği araştırılıyor3,7,9,10, 11 ' i , 12 tane , 13 ' ü , 14. araştırmalar, SCs montajında patolojik değişikliklerin, kardiyolipin sentezi15' te genetik kusur, kalp yetmezliği16, dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çeşitli bozukluklarda mevcut olduğunu göstermiştir. iskemi-reperfüzyon17, diyabet12, ve yaşlanma18.

Yerli Elektroforez ve immünozansiyonun yaygın olarak kullanıldığı SCs çalışmalarda oxphos kompleksler dörernary düzenlemeleri çözmek için2,19,20,21. Yerli Elektroforez daha da özel ile kombine edilebilir jel aktivite deneyleri veya 2D-SDS çeşitli SCs montajları hassas moleküler belirlenmesi sağlamak için sayfa1,19. SCs çalışma yeteneği, ekstraksiyon koşullarına, kullanılan deterjan türü ve konsantrasyonu, iyonik mukavemet ve pH yanı sıra tampon bileşimi, CB varlığı, jel içeren elektroforetik göç koşullarında da dahil olmak üzere kritik olarak bağımlıdır. boyutu ve akrilamid yüzdesi2.

Protokoller ve SCs bant çözünürlüğü büyük ölçüde kağıt arasında farklılık gösterir, çalışmalar arasında karşılaştırma yapmak zor ve zorlu yöntemlerin adaptasyon22. Bu nedenle, bu yazıda Non-İyonik deterjan digitonin ile farklı kaynakların izole mitokondri gelen SCs ayıklamak için sağlam ve optimum protokol öneriyor, ve yüksek moleküler ağırlık SCs bantları çözmek için. Optimize edilmiş deterjan konsantrasyonu, ekstraksiyon tamponunun bileşimi ve numune preparasyonunda Coomassie Blue olmaması protein kompleksleri bozulması en aza indirmektir. Bu protokol (bkz. Şekil 1 ' e genel bakış için), CN-Page ve bn-Page ' i büyük jel üzerinde optimum SCs montajları çözünürlüğü ile birleştirir ve in-jel etkinliğiyle uyumludur, reaktif bantların daha iyi görselleştirilmesini sağlayan ayrıntılı bir analiz SCs düzenlemeleri ve bileşimi için bağışıklık algılama.

Protokol

1. SC ekstraksiyon

  1. Hazırlamak 100 mL ekstraksiyon tamponu (bkz. Tablo 2) EDTA suda çözünerek. Tamamen çözülmüş kadar KOH ile pH artırın, sonra HCl ile 7,5 pH ayarlayın. çözüme kalan bileşenleri ekleyin, su ile son hacmine doldurun ve buzda tutun. Bir tüpte,% 10 stok çözeltisi yapmak için ekstraksiyon tamponunun digitonini çözülür, tamamen çözülene kadar iyice girdap yapın ve buzun üzerine tutun.
    Not: ekstraksiyon tamponu önceden hazırlanabilir ve en fazla 2 ay boyunca 4 °C ' de tutulur. Eğer dalgalı bantları jel altında görünmeye başlar, bu ekstraksiyon tampon çok eski anlamına gelir. % 10 digitonin çözeltisi hazırlarken, fare karaciğeri mitokondri kullanıyorsanız, numune başına 500 μL sayma bir stok hacmi hazırlayın. Digitonin çözünürlüğü, madde ve ürün lot (bkz. malzeme tablosu) üzerine değişir.
  2. Hayvan dokusundan izole edilen mitokondri (fare kalbi, kas, karaciğer; sıçan kalbi) veya hücreler (Human fibroblast) standart protokolleri kullanarak23,24,25 SCs çıkarılması için kullanılabilir. Mitochondri elde edildikten sonra, üreticinin tavsiyelerine göre bikinkoninik asit tahlil kiti kullanarak protein içeriği ölçmek. Gerektiğinde bu adımda proteiler ve fosfatazlar inhibitörleri ile izole mitokondri takviyesi.
    Not: SCs ya taze veya çözülmüş mitokondri üzerinde ayıklanabilir. Aynı zamanda, aynı çözümleri ve aynı koşullar altında aynı toplu tedavi edilir emin olmak için, aynı anda tüm örneklerden SCs ayıklamak için tavsiye edilir.
  3. Elde edilen mitokondriyal protein konsantrasyonuna dayanarak, ve istenen son digitonin/protein oranı, Tablo 1başına olarak gerekli stok digitonin solüsyonu ve ekstraksiyon tamponunun hacmini hesaplayın. SC ekstraksiyon için, her 10 μg mitokondrial protein için digitonin içeren 1 μL ekstraksiyon tamponu (Tablo 2) ekleyin. Digitonin/protein oranı 2 ila 8 g/g arasında farklılık gösterebilir. Kullanılan her yeni örnek türü için digitonin titrasyonu her zaman yapılmalıdır (örnek için bkz . Şekil 2 ).
  4. Pellet mitokondri, bir 1,5 mL tüp santrifüjleme ile 16.000 x g 10 dk 4 °c ' de.
  5. Süpernatant atın ve digitonin içeren buz-soğuk ekstraksiyon tampon hesaplanan hacminde mitokondriyal Pelet yeniden askıya. Tüpleri Mini Tüp Rotator üzerine yerleştirin ve orta dönme hızında 4 °C ' de 30 dakika boyunca inküye yapın. Numunelerin düzgün karıştırıldığından emin olun.
  6. 4 °C ' de 45 dk için 20.400 x g 'de santrifüjlenmiş parçacıkları çıkarın.
  7. Buz üzerinde yeni bir tüp süpernatant aktarmak ve proteinleri ölçmek. Bu kesir solunum süper kompleksleri özü temsil eder. Aynı gün Elektroforez gerçekleştirilmez ise-80 °C ' de mağaza örnekleri.
    Not: 1) önlemek dondurmak/çözülme döngüleri, bu SCs. aliquot örnek daha yüksek moleküler düzenlemeler bozar gibi ilk donma/çözme döngüsü gerekirse önce. 2) standart bir BN-PAGE deneyi yapmak için, bu adımda SCs ekstresi için CB eklenmesi gerekir. CB, kullanılan deterjan miktarına göre 1G/8g oranında eklenmelidir.

2. degrade jel döküm ve Elektroforez

  1. Degrade jeli, aliquot ve-20 °C ' de saklamak için 3x degrade tampon ve akrilamid stokları hazırlayın (bkz. Tablo 3).
  2. Anot ve katot tamponları hazırlayın ve 4 °C ' de tutun (bkz. Tablo 5).
  3. Döküm bölmesini açın ve odaya bir dış cam plaka (20 cm x 22 cm) yerleştirin. Hizalama kartını kullanarak bir set mesafe tutucular (1,5 mm) konumlandırın ve odanın yan ve köşelerine sıkıca oturmasını sağlayın. Mesafe tutucular (Bu form jel sandviç) üzerine bir iç cam plaka (20 cm x 20 cm) yerleştirin ve cam plaka üstüne bir plastik ayırma levha koydu.
  4. İstenilen sayıda jelin ulaşılana kadar 2,3 adımı yineleyin. Bu protokol için 4 jeller kaslanmış. Kullandığınız döküm odası sistemi (bkz. malzeme tablosu) bir defada en fazla 10 jeller döküm sağlar. İlk olarak gerekli olarak birçok akrilik blokları ekleyerek odasında kalan alanı alın ve sonra cam plakaları gerekirse.
    Not: montaj sıkıca mühürlü olmalıdır; Oda içinde jel sandviç arasında boşluk olmamalıdır.
  5. Conta çentik sıkıca conta oturma önce oluk Parafilm bir şerit yerleştirin. Sızdırmazlık plakasını Odaya yerleştirin ve 6 vidayı sıkın. Döküm odasına hazır olun.
  6. "Işık" karıştırma odasında bir manyetik karıştırıcı ile bir mix plaka üzerinde degrade eski yerleştirin. Degrade eski döküm odası tüp bağlayın, peristaltik pompa kasasında boru güvenli ve degrade eski stopkoku kapalı olduğundan emin olun.
  7. 4 jeller cast için, hazırlamak 60 mL% 4 ve 60 mL 12% jel çözümleri ( Tablo 4) bir Erlenmeyer Flask ve girdap iyice karıştırın. Pour 60 mL 4% jel çözeltisi "ışık" karıştırma odası, ve 60 mL% 12 gradyan eski "ağır" rezervuar odasında. 350 RPM 'de karıştırma plakasının karıştırma hızını ayarlayın. Stopkoku açın ve 35 RPM 'de pompa açın.
  8. Işık fraksiyonu ağır fraksiyondan daha düşük bir kez, pompa duraklatın ve "ışık" ve "ağır" rezervuar arasında Vana kök açın, kesirler hacim equilibrate izin ve pompa yeniden başlatın.
    Not: hiçbir kabarcıklar sisteme girmek ve cam plakaları arasında sıkışıp almak önemlidir. Bu durumda, montaj, yıkama ve Yinele geri alın.
  9. Degrade jel tamamen döküldü sonra, pompa durdurun ve jel kurutma önlemek için her jel sandviç üzerinde (yaklaşık 1 mL) su bindirme. 2 h için polimerize edelim.
  10. Erlenmeyer 'de 25 mL istifleme jeli hazırlayın ve iyice karıştırın. Su çıkarın ve her jel sandviç 15 iyi taraklar takın. İstifleme jel dökün ve polimerize izin 2 h.
    Not: jeller 1 hafta boyunca 4 °C ' de tutulabilir.
  11. Sandviç kelepçeleri jel takın ve tarak çıkarın. Kısa cam plakalı aşağı bakacak şekilde, jel sandviçini soğutma çekirdeğine takın. Diğer tarafta tekrar edin ve çekirdeği Elektroforez tankına yerleştirin.
  12. Elektroforez tankının iç odasında 300 mL mavi katot tamponu dökün. Elektroforez tankının dış odasında 2 L anot tamponu dökün.
    Not: elektrot, yaklaşık 300 mL gerektiren katot tamponunun içinde daldırma olmalıdır.
  13. 75 μg ve 175 μg protein arasında her iyi yük. 1,5 h için 150 V 'de jel çalıştırın (veya numune tüm degrade jeli girinceye kadar) soğuk odada (4 °C).
    DIPNOT 1:1) içinde-jel aktivite bantları iyi çözünürlüğü için en az 75 μg iyi gereklidir. 175 üzerinden yükleme μg protein aşırı enzim aktivitesi nedeniyle net bantları kaybına yol açacaktır. 2) numunenin çoğaltır içinde-jel faaliyetleri ve OXPHOS kompleksleri immünoblot Analizi paralel belirlenmesi sağlamak için ayrı kuyular yüklenmelidir. CI, CII, CıV ve CV için IgA paralel belirlenmesi en az 300 μg gerektirir. CI, CII, CII, CıV ve CV 'nin paralel immünoblot analizi en az 375 μg gerektirir.
  14. Mavi katot tamponu pipet veya vakum ile çıkarın, 300 mL Coomassie mavi ücretsiz katot tamponu ile değiştirin ve 200 V 'de bir gecede (16 – 20 saat) soğuk odada (4 °C) jel çalıştırın. İn-jel aktivite ölçümü veya İmmünoblotting için adım 3 veya 4 ' e geçin.

3. ı, II, IV ve CV kompleksler için jel aktivitesi

  1. Elektroforez bitmeden önce, Tablo 6' ya göre jel aktivite tamponları HAZıRLAYıN ve RT. 20 ml in-jel aktivite tamponunda karanlıkta tutun 3 örnek şerit için yeterlidir.
    Not: Bu CV-jel aktivite tahlil ATPsynthase ters aktivite dayanmaktadır (yani, ATP hidroliz), ve bir ortak faktör olarak kalsiyum kullanır, hangi jel çökelir. Kalsiyum diğer protokollerde kullanılan kurşun daha az zararlı. Ayrıca, bu protokolün kullanımı, jel23ön aktivasyon/Klima gerektirmez.
  2. Elektroforezi durdurun ve jeli alın. Kesme şeritleri, gerekirse ve plastik torbalarda jel şeritleri transfer (3 taraf kesilmiş, ve plastik torba bir kitap gibi açıldı). 3 tarafın 2 ' sini bir ısı mühürleyici ile mühürleyin.
    Not: Deneysel gruplar arasında SC bantları bileşimi karşılaştırmak Için aynı jel üzerinde çoğaltır aynı örnekleri çalıştırmak için tavsiye edilir. Farklı jel aktivite tamponları (CI, II, IV, V) her çoğaltır kulvarmak için kesme şeritleri. Özgüllüğü onaylamak için, ek çoğaltır özel solunum zinciri inhibitörleri varlığında jel etkinliklerinde çalışacak şekilde hazırlanabilir.
  3. 3 deneysel numune (i.e. 3 kuyular) için, 20 mL in-jel aktivite tampon eklemek, kabarcıklar kaldırmak ve plastik torba 4TH tarafı mühür.
    Not: gerçekleştirildiğinde negatif kontrol deneylerinde inhibitörler ekleyin: CI: Rotenone 1 μM; CII: Sodyum MALONATE 10 mM; Cııı: Antimicin-A 8 μM; CıV: KCN 0,6 mM; CV: Oligomisin 0,5 μM.
  4. 37 °C ' de jel şeritleri karanlıkta ve her 15 dakikada bir kontrol edin. Kuluçdak süresi protein ve kompleksleri miktarına bağlı olarak değişir. CI, CıV veya CV 'den daha hızlı tepki verecektir. optimum boyama genellikle sonra oluşur 2 CI için h, 4 CıG için h ve 6 CII ve CV için h.
  5. Reaksiyonu durdurmak için su içinde jel şeritleri durulayın, ve CV için beyaz bir arka plan üzerinde görüntü, CII, CıV, veya özgeçmiş için siyah arka plan.
    Not: jeller birkaç ay boyunca RT veya 4 °C ' de plastik torbalarda tutulabilir.

4. İmmünoblotting

  1. Transfer arabelleğini Tablo 7' ye göre HAZıRLAYıN ve RT 'de tutun. Tbst 'i HAZıRLAYıN ve RT 'de tutun.
  2. Tüm jeli veya seçilen şeritleri bir konteynerin içine yerleştirin ve SDS ile tamamlayıcı transfer arabelleği ekleyin (% 0,25 transfer tamponunun Final). Rocker üzerinde konteyner yerleştirin ve 1 h için inkük.
  3. Cut PVDF membranı (jel boyutuna karşılık gelen boyut) ve 2 dakika boyunca ajitasyon altında 20 mL metanol içinde etkinleştirin. 20 mL transfer tampon ve 2 dakika boyunca ajitasyon altında yer değiştirin.
  4. Hazırlama transfer sandviç, aşağıdan üstüne, emin orada jel ve aktif PVDF membran arasında kabarcık yoktur: kaset/siyah sünger/Blot kağıt/membran/jel/Blot kağıt/siyah sünger/siyah yan kaset açık tarafı. Kaseti kapatıp kilitle.
  5. Transfer haznesine transfer sandviç yerleştirin, sandviçin net tarafı elektrot kırmızı tarafına bakmaktadır ve jeli karıştırmak için transfer tamponunu dökün. Soğutma sistemini transfer tankına bağlayın ve 4 °C ' de ayarlayın. 40 mA 'da ayarlanan güç kaynağına bağlanın ve 24 saat boyunca çalıştırın.
  6. Membran alın, TBST 'de% 5 BSA 'da 1 h için blok yapın ve 4 °C ' de gece TBST 'de% 5 BSA 'da hazırlanan primer antikor çözeltisi içinde inküye yapın.
    Not: bkz. Tablo 8 antikorlar için kullanılır.
  7. Her biri 10 dakika boyunca TBST 3x 'de membran durulayın.
  8. TBST 'de% 5 BSA 'da oda sıcaklığında 2 saat boyunca hazırlanan ikincil antikor çözeltileri içinde membranlara inküye yapın.
  9. Her biri 10 dakika boyunca TBST 3x 'de membran durulayın.
  10. Membranlar ve görüntü için kemiluminesans çözüm ekleyin.

5. analiz

  1. In-jel aktivite assay görüntüleri veya immünoblots SCs analiz etmek için kullanılabilir. Bantların bileşimi çözümlemek için çoğaltır hizalayın ve hangi karmaşık her verilen bant için olumlu tepki doğrular.
  2. Kompleksleri, çeşitli Supramoleküler Montajlarda, ımagej 'de açık görüntüleri analiz etmek ve jel analiz aracını kullanmak için (örneğin Şekil 5 ' e bakın).
    1. Dikdörtgen aracıyla şeritleri seçin ve şerit çizin.
    2. İlgi her bandın eğrisi altında alanı kapatmak için çizgiler çizin ve eğri değerleri altında alanı içeren bir tablo oluşturmak için Değnek aracı ile her alanı tıklayın.
    3. Karmaşık dağılımı hesaplamak için her bant için değerleri monomer göreli olarak rapor.

Sonuçlar

Şekil 2 , SCs 'nin çıkarılması için gerekli olan digitonin uygun miktarını belirlemeye yönelik digitonin titrasyon denemenin sonuçlarını gösterir. Bu tutar doku/hücre tipine ve numunenin dondurulmuş olup olmadığına bağlı olarak farklılık gösterecektir. Bu deney için, yeni fare karaciğer mitokondri izole SCs görselleştirme için bir CıV-jel aktivite gerçekleştirildi. 2/1 ila 10/1 g digitonin/g protein oranları test edildi. Bu örnek için digitonin en uygun miktarı 4 g/g, monomerik CıV iyi bir çözünürlük sağlar, ve yüksek moleküler ağırlık SCs. Daha düşük bir oranda, bantları açık değildir ve Elektroforez sırasında smear içine çözmek, digitonin daha yüksek oranda kullanımı yüksek moleküler ağırlık SC bozulması yol açar.

Şekil 3 ve Şekil 4 , 4 g digitonin/g protein ile çıkarılan fare karaciğer mitokondri hazırlanması üzerinde gerçekleştirilen tam bir deney sonuçlarını göster. Proteinler hibrid BN/CN-PAGE, standart BN-PAGE veya CN-PAGE kullanılarak ayrılır. Her üç jelin de aynı anda kazılmış ve şeritleri aynı numune çoğaltır ile yüklendi. Elektroforez aşağıdaki, bireysel şeritleri kesilmiş ve jel aktivite ölçümü için işlenmiş (CI, CII, CıV ve CV Şekil 3) ve İmmünoblotting (CI, CII, cııı, CIV, Şekil 4CV).

(Örneğin, hibrid CN/BN-PAGE) veya numune ve Elektroforez boyunca katot tampon (yani BN-PAGE), önemli ölçüde hareketlilik ve SC bantları çözünürlüğü geliştirir ve bireysel solunum kompleksler (örn ile karşılaştırıldığında CN-PAGE (Şekil 3). Gruplar kolayca hibrit tekniği veya BN-PAGE ile CıV için jel etkinliğinden sonra ayırt edilir, aynı örnekte CN-PAGE, SCs ve monomerik CıV reaktif bantları tarafından çözülmüş ise tespit edilemez.

Şekil 3 ve ŞEKIL 4 , oxphos monomerlerin ve Supramoleküler montajların çözünürlüğü ve bantlama DESENININ, hibrit CN/BN-PAGE ve bn-Page arasında niteliksel olarak karşılaştırılabilir olduğunu gösterir. Ancak, önemli farklar var. İlk olarak, OXPHOS kompleksinlerin elektroforetik hareketliliği, protein hibrid CN/BN-PAGE koşulları vs standart bn-Page kullanılarak ayrıldığı zaman biraz azalır, çünkü CB 'nin azaltılmış miktarı. Bu hareketlilik vardiya CıV monomerler için daha büyüktür, CV monomerleri tarafından takip, ve CI (Şekil 3 ve Şekil 4). İkincisi, mavi arka plan hibrid CN/BN-PAGE BN-PAGE (Şekil 3, sol şeritleri) ile karşılaştırıldığında daha düşüktür. Sonuç olarak, Bn-Page aşağıdaki yüksek arka plan seviyeleri tamamen CII için jel aktivite Boyama Maskeler ve CIV dimerleri aktivitesi ile ilişkili arka plan gürültüsünü geliştirir (Şekil 3). Üçüncü olarak, CV 'nin etkinliği, CV katalizör aktivitesine müdahale ettiği bilinen CB 'nin azaltılmış miktarı nedeniyle, numune hibrid CN/BN-PAGE koşullarında BN-PAGE (Şekil 3) ' e kıyasla çalıştırıldığında daha yüksektir. 26 CN/bn-Page Ayrıca CV Supramoleküler montajların daha iyi korunmasını sağlar, CV dimerleri ile ilişkili toplam CV aktivitesinin daha büyük bir oranı ile gösterildiği gibi (Şekil 3). Dahası, CV oligomerler CN/bn-Page altında görülebilir, onlar bn-Page koşulları altında tamamen Disosiye iken. İlginçtir, CV aktivite görüntüleyen ayrı bantları da CV monomerler ve dimers arasında gözlenen, örnekleri CN/BN-PAGE altında çalıştırıldığında (Şekil 2).

Şekil 5 , Supramoleküler montajlarda OXPHOS kompleks dağıtımının temsili bir analizini gösterir. Görüntü, 4 farklı sağlıklı fare karaciğer mitokondri preparatından elde edilen numunelerin jel aktivitesinde CI gösterir. Densitometri analizi, CI-reaktif bantları eğrisi altında alanı ölçmek ve monomerik (i1) ve Supramoleküler formları C1 aktivite göreli dağılımı sunmak için izin verir (ı1III2, ı1III2IV 1, ı1III2IVn). Benzer analiz immünoblot aşağıdaki gerçekleştirilebilir.

Protein saflaştırma işlemi; CN/BN-PAGE diyagramı; santrifüjleme, tampon resüspanit, elektroforez.
Şekil 1: tahlil iş akışı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Protein ayırma jeli, değişen digitonin oranları, elektroforez sonuçları, protein kompleksi analizi.
Şekil 2: Digitonin titrasyon taze fare karaciğer mitokondri gelen süperkompleksleri ayıklamak için. Bu örnek, solunum süper kompleksleri ayıklamak için digitonin artan miktarlarda tedavi edilen bir hayvandan izole fare karaciğer mitokondri plakaya gösterir. Örnekler daha sonra hibrid CN/BN PAGE ile çözüldü ve CıV-jel aktivitesi belirlendi. CıV1: kompleks IV monomerler; CıV2: kompleks IV dimers; SC: süperkompleksleri. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Hibrid ve BN-PAGE jel elektroforezi, protein kompleks analizi, enzim aktivitesi tespiti, diyagram.
Şekil 3: HIBRID CN/bn-Page, Bn-Page veya CN-Page aşağıdaki OXPHOS kompleksler içinde-jel aktivitesi. Bir fareyle izole edilen karaciğer mitokondri solunum süper kompleksleri ayıklamak için digitonin (4 g/g oranı digotonin/protein) ile tedavi edildi. Bu numunenin aliquots daha sonra üç farklı jelleri birden fazla kuyuları yüklendi ve CN/BN-PAGE, BN-PAGE veya CN-PAGE sundu. Her bir jel içinde çoğaltılan her şerit daha sonra kesilmiş ve hemen içinde-jel aktivite deneyleri için kullanılan (etiketli CI, CII, CIV ve CV). Bir şerit, Coomassie Blue ile arka plan (BG etiketli) boyama göstermek için kontrol olarak kullanılmıştır. OXPHOS kompleksler ve Supramoleküler montajlar, her OXPHOS kompleksinin moleküler stoichiometrisi gösteren indekslerde sayılar ile standart terminolojinin kullanılarak tanımlanır. Cııı içeren Supramoleküler montajların pozisyonunun, bu özel deneyde CıII için jel aktivitesinin gerçekleştirildiği için immünozizatörlere dayalı olduğu unutulmamalıdır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Hibrid CN/BN-PAGE immünoblot diyagramı, protein kompleks analizi, CI-VI yolakları, elektroforez sonuçları.
Şekil 4: HIBRID CN/bn-Page veya bn-Page aşağıdaki OXPHOS kompleksler Immünoblot analizi. Şekil 3 ' te açıklanan deneylerden çoğaltır, tek bir membran elektro-transfer edildi. Transferden sonra, bireysel şeritleri kesilmiş ve CI, CII, cııı, CıV, ve CV tanıyan spesifik antikorlar ile inkübe edildi. OXPHOS kompleksler ve Supramoleküler montajlar, standart terminolojinin kullanıldığı Her OXPHOS kompleksi moleküler stoichiometri. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

CI aktivite analizinin bir çubuk grafiği ile protein kompleksi oluşumunu gösteren elektroforez diyagramı.
Şekil 5: monomerik ve Supramoleküler montajlarda CI dağılımının ölçülmesini. (A) CI in-jel faaliyet belırlenen hibrid CN/bn-sayfa karaciğer MITOKONDRI SC özleri 4 fareler elde. (B) CI monomerlerin (i1) ve çeşitli CI içeren Supramoleküler kompleksleri (ı 1 III2, ı 1 III2IV1) karşılık gelen farklı zirveler gösteren ımagej jel Analiz Aracı kullanılarak elde edilen densitogram ve ben1III2IVn). (C) C1 aktivitesinin göreli dağılımının ölçülmesini. Veri ortalama ve SEM 4 fareler temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Digitonin/protein oranı (g/g)2 g/g4 g/g6 g/g8 g/g
Ekstraksiyon tampon hacmi (μL)400300200100
% 10 stok digitonin (μL) hacmi100200300400
Toplam çıkarma arabelleği hacmi (μL)500500500500

Tablo 1: çeşitli digitonin/protein oranları kullanılarak 5 mg mitokondriyal proteinlerden SCs çıkarmak için gerekli birimler.

BileşikSon konsantrasyon
EDTA, pH 7,51 mM 'Lik
HEPES30 mM 'Lik
Potasyum asetat150 mM
Gliserol12
6-aminocaproik asit2 mM 'Lik

Tablo 2: SC ekstraksiyon arabelleği (son konsantrasyonlar). En fazla 3 ay boyunca 4 °C ' de tutun.

BileşikSon konsantrasyon
3x jel tampon: Aliquot ve tutmak-20 °c, pH 7,5
İmidazol/HCl pH-7,075 mM
6-aminocaproik asit1,5 M
Akrilamid tampon: Aliquot ve tutmak-20 °c
Akrilamid99,5%
BIS-akrilamid3

Tablo 3: jel stok tamponları.

2 jeller için:% 4 (60 mL)% 12 (60 mL)İstifleme (% 4) (25 mL)
3X jel tampon19,8 mL19,8 mL8,25 mL
Akrilamid tampon4,8 mL14,4 mL2 mL 'Lik
H2O35 mL13,1 mL14,6 mL
Gliserol-12 mL 'Lik-
APS 10%360 (μL)60 (μL)150 (μL)
TEMED24 μL12 μL10 μL

Tablo 4:% 4 –% 12 gradyan jeli.

BileşikSon konsantrasyon
Anot tamponu: 4 °C ' de tutun, pH 7,5
İmidazol25mm
Katot tamponu: 4 °C ' de tutun, pH 7,5
Tricine50 mM
İmidazol7,5 mM
Coomassie mavi (G250) ile veya olmadan0,022%

Tablo 5: Elektroforez tamponları.

BileşikSon konsantrasyon
Kompleks ı aktivite tampon: 5 mM TRIS-HCl pH 7,4 taze hazırlayın
Nitrotetrazolyum mavisi3 mM 'Lik
NADH14 mM 'Lik
Kompleks II aktivite tampon: 5 mM TRIS-HCl pH 7,4 taze hazırlayın
Süksinat20 mM 'Lik
PMSF0,2 mM
Nitrotetrazolyum mavisi3 mM 'Lik
Kompleks IV aktivite tampon: hazırlamak taze 50 mM na-fosfat pH 7,2
Sitokrom C0,05 mM
Diaminobenzidin2,3 mM
ATPsynthase etkinlik tampon: su taze hazırlamak, Ko ile 8 pH ayarlamak
Glycine50 mM
MgCl2 5 mM 'Lik
HEPES50 mM
CaCl2 30 mM 'Lik
Atp5 mM 'Lik

Tablo 6: ın-jel aktivite assay tamponlar.

BileşikSon konsantrasyon
Aktarım arabelleği
Tris üssü25mm
Glycine192 mM
SDS4
Metan -ol20
(TBST adresinde)
Tris üssü20 mM 'Lik
Nacl137 mM
Ara 200,1%

Tablo 7: Immünoblotting tamponları.

KarmaşıkAltbirimKlon
ıNDUFA920C11B11B11
ııMEHMET mehmet2E3GC12FB2AE2
ıııUQCRC213G12AF12BB11
ıvCOX41D6E1A8
V(ATPB)3D5 sunumu

Tablo 8: solunum ZINCIRI SC algılamak için İmmünoblotting için kullanılan antikorlar. Şirketler ve lot numaraları için malzeme tablosunu görün.

Tartışma

Mitokondrial süperkompleksleri, fizyolojik rollerini ve birçok insan hastalığının patogenezindeki önemini, elde edildikleri veya genetik mitokondriyal hastalıklar için aktif olarak incelenmektedir3,7 , 9 , 10 ' dan fazla , 11 ' i , 12 tane , 13 ' ü , 14. güvenilir sonuçlar elde etmek için, çeşitli yönleri dikkate alınmalıdır. Bu protokol, fare karaciğer mitokondri ile test edilmiştir, fare iskelet kas mitokondri (sonuçlar gösterilmez), sıçan kalp mitokondri, ve insan fibroblast mitokondri (sonuçlar gösterilmez), ama kesinlikle diğer kaynaklara adapte edilebilir izole Mitokondri. Yöntem en iyi şekilde bir araya getiren bn ve CN-Page protokollerinin çeşitli yönlerini birleştirir, hangi deterjanlar ve anyonik bileşiklere maruz kalma azaltmak için izin yayımlanan protokollere kıyasla en az20,27,28.

Numune hazırlama

Numune hazırlama, SCs 'nin başarılı bir şekilde ayrılması için önemli bir adımı temsil eder. tampon bileşimi dikkatle proteinleri ve proteinler meclislerinin uygun çözünme elde etmek için seçilmiş olmalıdır, mümkün olduğu kadar koruyarak onların işlevsel ve yapısal bütünlük. İyonik mukavemet ve pH ekstraksiyon tamponu dikkate alınması gereken iki önemli faktördür. Çok düşük tuz konsantrasyonları (< 50 mM K-asetat veya NaCl) olmayan iyonik deterjanlar varlığında proteinlerin kötü çözünme neden olur, 500 mM yukarıda tuz konsantrasyonları protein istifleme/toplama teşvik edecek, ve CB ve yağış protein29. Bu nedenle SCs yakın fizyolojik iyonik mukavemet arabellekleri kullanılarak ayıklanmalıdır. PH açısından, yakın fizyolojik pH kullanımı önerilir.

Deterjan tipi ve deterjan/protein oranı da optimum SC ekstraksiyon için önemlidir. Yerli SCs 'nin maksimal korunması için digitonin tercih edilir26. Mevcut protokol ve diğer yayımlanan yöntemlerde gösterildiği gibi23,30,31,32, bu hafif deterjan, birden fazla SC montajının Supramoleküler bileşimi korur ve dimerik ve ATPsynthase Oligomerik yapısı (Şekil 3 ve Şekil 4). Çeşitli miktarlarda digitonin ile ilgili numunelerin titrasyonu, optimum çözünme sağlayan koşulları belirlemek için, enzim aktivitesini ve fizyolojik protein etkileşimlerini korurken önemlidir. Titrasyon 2 ile 8 g/g26arasında değişen oranlarla yapılmalıdır. Karaciğer, iskelet kası ve kardiyak mitokondri için optimum sonuçlar sırasıyla 4, 5 ve 6 g digitonin/g proteini ile elde edilir. Digitonin 'in, en uygun koşullarda digitonin2ile gözlenen benzer göç ve SC bileşimine neden olan triton X-100 tarafından değiştirileceği belirtilmelidir. Ancak bu deterjan, deterjan/protein oranındaki nispeten küçük bir artış (örn. 1 ' den 1,5 g/g 'ye kadar), SCs montajlarının tam bir dağılmasına neden olabilir, bu da deneysel tutarsızlıklaraneden olabilir. Ekstraksiyon sonra, örnekler geleneksel CN-sayfa20,26dışında, jel uygulandığında proteinleri bir ücret vermek için Coomassie mavi ile geleneksel olarak desteklenmektedir. Coomassie mavi ve potansiyel ayrışma labil proteinlerin protein maruz en aza indirmek için, numuneler Bu protokolde Coomassie mavi ile tamamlayıcı değildir.

Elektroforez

Hem CN-PAGE ve BN-PAGE mitokondriyal OXPHOS kompleksleri, her biri farklı avantajları ve sınırlamaları olan çalışma için kullanılmıştır. CN-Page (özellikle deterjan benzeri bir etkiye sahip olan CB 'nin yokluğunda) altında kullanılan daha hafif koşullar, ATP sentaz in-jel aktivitesinin daha iyi korunmasını sağlar ve yüksek molekül ağırlığı SCs ve ATP sentaz 'de labil proteinlerinin dağılmasına sınır verir Montaj26. Ancak, protein ekstresi ve Elektroforez tamponları anyonik boya CB yokluğunda proteinlerin kendi içsel şarj ve izoelektrik noktasına dayalı göç neden, jel içinde proteinlerin elektroforetik hareketlilik azaltır26. Dahası, CB yokluğunda, yetersiz negatif şarj proteinleri toplama eğilimindedir, böylece jel protein kompleksleri çözünürlüğünü azaltarak20,26. Bu sınırlamaları aşmak için, sözde yüksek çözünürlüklü CN-PAGE Wittig ve Schragger20tarafından geliştirilmiştir. Bu protokolde, sodyum deoksikolatın (doc) ve çeşitli hafif olmayan iyonik deterjanlar (DDM, Triton X100), membran proteinlerini çözünten tutmak için katot tamponunu eklenir ve proteinlere negatif bir şarj değişimi uygulayabilir, bu da önemli bir iyileşme elde edilir çözünürlüğü20.

Mevcut hibrit CN/BN protokolünün ayırt edici özelliği, bu deterjanlar olmadan karşılaştırılabilir bir çözünürlüğe ulaşılabilmektedir. Elektroforezinin başlangıcında CB 'nin katot tamponunun anlık olarak eklenmesi, protein toplamayı sınırlamak ve jel içinde hareketlilik geliştirmek için yeterlidir (Şekil 3 ve Şekil 4). Sonuç olarak, bu hibrid tekniği, farklı SC montajlarının mükemmel çözünürlüğünü ve çok düşük veya deterjanlara maruz kalmasını sağlar. CB düşük miktarlarda varlığı da CV aktivitesinin daha iyi korunması, dimerik ve Oligomerik CV meclisleri (Şekil 3 ve Wittig ve Schägger 200526) geliştirilmiş korunması ve mavi arka plan gürültüsünün azaltılması sağlar olabilir Özellikle CII ve CıV (Şekil 2) için jel faaliyetlerinin ölçülmesini engelleyebilir. Dahası, protein ekstresi içinde CB yokluğunda SCs içinde labil protein etkileşimlerin bozulması sınırlar. Örneğin, Ant ile ATP sentaz fiziksel Association synthasome 33 veya PTP açılış 34 düzenlemek için cyclophilin-D ile oluşturmak için daha iyi CB yokluğunda görülür. Elektroforez sırasında CB 'ye anlık maruz kalma sadece bu nedenle SCs içinde yeni protein etkileşimlerini ortaya çıkarmak için yararlı olabilir. genel olarak, bu hibrit CN/BN-PAGE protokolü, böylece hassas ve hızlı jel aktivite ölçümlerinde analitik ile birleştirmek için izin verir , SCs gelişmiş analizi için 2D Elektroforez, immüno-algılama ve/veya proteomik içeren teknikler. Bu SCs için büyüyen ilgi ile, çalışmalar artan sayıda yerel sayfa için küçük 10 x 10 cm jelleri kullanmak unutulmamalıdır. Bu yaklaşım bolluk SC montajlarında brüt değişiklikleri belirlemek için yeterli olabilir, ancak küçük jellerin düşük ayırma kapasitesi büyük olasılıkla ince yeniden düzenlemeleri çözmek veya proteomik analiz için farklı bantları kesmek için sınırlıdır. Dahası, daha küçük jelleri kullanarak çeşitli çalışmalar respirasome ATPsynthase dimer aynı boyutta göç olduğunu bildirdi, zor onları ayırmak için yapım22. Bu nedenle, büyük jeller kullanımı tercih edilmelidir.

Teşekkürler

Yazarlar teknik yardım için Jenna Rossi teşekkür etmek istiyorum, ve Dr Mireille Khacho, Dr David Patten ve Dr. Ujval anil kumar yararlı tartışma için bu yöntemi geliştirirken. Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) ve Ulusal Bilimler ve Kanada Mühendislik Konseyi (NSERC) tarafından finanse edilmiştir. AC doktora Ödülü alıcı-Frederick Banting ve Charles En Iyi Kanada lisansüstü Burslar (CIR).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
3,3'-Diaminobenzidin tetra-hidroklorür hidratSigmaD5637
6-amino kaproik asitsigmaA2504
AkrilamidSigmaA3553
Adenozin 5'-trifosfat disodyum tuzu hidratsigmaA3377
Anti-ATPB antikoru [3D5] - Mitokondriyal BelirteçAbcamab14730Lot numarası GR3174539-12, RRID AB_301438
Anti-SDHA antikoru [2E3GC12FB2AE2]Abcamab14715Lot numarası GR3235943-1, RRID AB_301433
Anti-UQCRC2 antikoru [13G12AF12BB11]Abcamab14745Lot numarası GR304308-3, RRID AB_2213640
Bis N,N'-Metilen-Bis-AkrilamidBiorad1610201
Brilliant Blue GSigma27815
COX4 Monoklonal Antikor (1D6E1A8)Invitrogen459600Lot numarası TI2637158, RRID AB_2532240
sigmasındanSitokrom cC7752
DigitoninSigmaD141
Fisherbrand FH100M Çok Kanallı Peristaltik PompalarThermo Fisher13-310-660
İmidazolSigmaI0250
İç cam plakalar. 2, 20 x 20 cm'lik paket, 20 cm PROTEAN II xi ve PROTEAN II XL elektroforez hücreleri için cam plakalar, dış plaka Biorad1651823
Model 485 Gradient former ile kullanım. 40-175 ml akrilamid gradyan şekillendirici, Mini-PROTEAN çok döküm hazne sistemleriyle kullanım için valf gövdesi ve boru kiti içerirBiorad1654120
NDUFA9 Monoklonal Antikor (20C11B11B11)İnvitrojen459100Lot numarası TD2536591, RRID AB_2532223
Nitrotetrazolium Mavi klorürSigmaN6639
Dış Cam Plakalar. 2, 22,3 x 20 cm'lik paket, 20 cm PROTEAN II xi ve PROTEAN II XL elektroforez hücreleri için cam plakalar, iç plakaBiorad1651824
Fenilmetansülfonil florürSigmaP7626
Powerpack 1000ile kullanın BioradSeri Numarası 286BR 07171
PROTEAN II Sandviç Kelepçeleri. 2'li paket, jelleri çalıştırmak için kelepçeler, 20 cm PROTEAN II xi elektroforez hücresi için, 1 sol ve 1 sağBiorad1651902
PROTEAN II xi Hücresi. Geniş formatlı dikey elektroforez hücresi, 16 x 20 cm jel boyutu, 4 jel kapasitesi, ara parçalar ve taraklarBiorad1651811
PROTEAN II xi Tarak. 1, 15 kuyulu, 1,5 mm'lik paket, PROTEAN II xi elektroforez hücresiBiorad1651873
PROTEAN II xi Çok Jelli Döküm Odası için tarak. Çok jelli döküm haznesi, 20 x 20 cm jel boyutu, on adede kadar 1,5 mm kalınlığında jel için, sızdırmazlık plakası, conta, ayırma levhaları, akrilik bloklar, PROTEAN II XL hizalama kartlarıBiorad1652025
PROTEAN II xi Ara Parçaları içerir. 4, 1,5 mm'lik paket, 20 cm için ara parçalar PROTEAN II xi elektroforez hücresiBiorad1651849
SCIENCEWARE Yardımcı Çantalar (10 x 12 inç), 4 mil, Bel-Art, 100VWR11215-388
Kalın Leke Kağıdı Kutusu. 25 yapraklık paket, 15 x 20 cm, emici filtre kağıdı, Trans-Blot kasetiBiorad1703956
Plaka Elektrotlu ve Süper Soğutma Bobinli Trans-Blot Hücresi ile kullanım için. Transfer hücresi ve soğutma bobini (# 170-3912), 2 jel tutucu kaset, tampon tankı, kablolu kapak, fiber pedler, 1 paket leke kağıdıBiorad1703939
At kalbi içerir

Kaynaklar

  1. Shagger, H. Respiratory Chain Supercomplexes. IUBMB Life. 52 (3-5), 119-128 (2001).
  2. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  3. Greggio, C., et al. Enhanced Respiratory Chain Supercomplex Formation in Response to Exercise in Human Skeletal Muscle. Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).
  4. Schagger, H., Pfeiffer, K. The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes. Journal of Biological Chemistry. 276 (41), 37861-37867 (2001).
  5. Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. The Enigma of the Respiratory Chain Supercomplex. Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).
  6. Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
  7. Vartak, R., Porras, C. A., Bai, Y. Respiratory supercomplexes: structure, function and assembly. Protein Cell. 4 (8), 582-590 (2013).
  8. Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex Assembly Determines Electron Flux in the Mitochondrial Electron Transport Chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
  9. Lazarou, M., Smith, S. M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T., McKenzie, M. Assembly of nuclear DNA-encoded subunits into mitochondrial complex IV, and their preferential integration into supercomplex forms in patient mitochondria. The FEBS Journal. 276 (22), 6701-6713 (2009).
  10. Sun, D., Li, B., Qiu, R., Fang, H., Lyu, J. Cell Type-Specific Modulation of Respiratory Chain Supercomplex Organization. International Journal of Molecular Sciences. 17 (6), (2016).
  11. D'Aurelio, M., Gajewski, C. D., Lenaz, G., Manfredi, G. Respiratory chain supercomplexes set the threshold for respiration defects in human mtDNA mutant cybrids. Human Molecular Genetics. 15 (13), 2157-2169 (2006).
  12. Antoun, G., et al. Impaired mitochondrial oxidative phosphorylation and supercomplex assembly in rectus abdominis muscle of diabetic obese individuals. Diabetologia. 58 (12), 2861-2866 (2015).
  13. Kanaan, G. N., Patten, D. A., Redpath, C. J., Harper, M. -E. Atrial Fibrillation Is Associated With Impaired Atrial Mitochondrial Energetics and Supercomplex Formation in Adults With Type 2 Diabetes. Canadian Journal of Diabetes. , (2018).
  14. Kuter, K., et al. Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson's disease. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).
  15. McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes Are Destabilized in Barth Syndrome Patients. Journal of Molecular Biology. 361 (3), 462-469 (2006).
  16. Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovascular Research. 80 (1), 30-39 (2008).
  17. Jang, S., et al. Elucidating Mitochondrial Electron Transport Chain Supercomplexes in the Heart During Ischemia-Reperfusion. Antioxidants & Redox Signaling. 27 (1), 57-69 (2017).
  18. Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex. Experimental Gerontology. 45 (7), 563-572 (2010).
  19. Krause, F. Detection and analysis of protein-protein interactions in organellar and prokaryotic proteomes by native gel electrophoresis: (Membrane) protein complexes and supercomplexes. Electrophoresis. 27 (13), 2759-2781 (2006).
  20. Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. Molecular Cell Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).
  21. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  22. Jang, S., Javadov, S. Current Challenges in Elucidating Respiratory Supercomplexes in Mitochondria: Methodological Obstacles. Frontiers in Physiology. 9, 238-238 (2018).
  23. Cuillerier, A., et al. Loss of hepatic LRPPRC alters mitochondrial bioenergetics, regulation of permeability transition and trans-membrane ROS diffusion. Human Molecular Genetics. 26 (16), 3186-3201 (2017).
  24. Pallotti, F., Lenaz, G. Methods in Cell Biology. 80, Academic Press. 3-44 (2007).
  25. Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nature Protocols. 4, 1582(2009).
  26. Wittig, I., Schägger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. PROTEOMICS. 5 (17), 4338-4346 (2005).
  27. Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes Using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
  28. Beutner, G., Porter, G. A. Jr Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution. Journal of Visualized Experiments. (124), e55738(2017).
  29. Von Hagen, J. Proteomics Sample Preperation. , Wiley InterScience. 485(2008).
  30. Couoh-Cardel, S. J., Uribe-Carvajal, S., Wilkens, S., García-Trejo, J. J. Structure of dimeric F1F0-ATP synthase. The Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36447-36455 (2010).
  31. Strauss, M., Hofhaus, G., Schröder, R. R., Kühlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. The EMBO Journal. 27 (7), 1154-1160 (2008).
  32. Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19 (8), 1777-1783 (2000).
  33. Wittig, I., Schägger, H. Structural organization of mitochondrial ATP synthase. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1777 (7), 592-598 (2008).
  34. Giorgio, V., et al. Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Stated of America. 110 (15), 5887(2013).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Hibrit Berrak Mavi Do al PAGES perkompleks Ay rma AnaliziDigitonin ile Mitokondri EkstraksiyonuGradyan Jel ElektroforeziJel i Aktivite AnalizleriCoomassie Blue BoyamaProtein Protein Etkile imleri2D Elektroforez Analizimm nodeteksiyon Proteomi i

İlgili makaleler