Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Drosophila pupa Retina diseksiyon immünhistokimya, Batı analiz ve RNA izolasyon için

8.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/59299

⸱

15 Mart 2019

 , 
1Department of Biology, Wesleyan University

Bu makalede

Özet

Bu kağıt doku immünhistokimya, Batı analiz ve RNA-ekstraksiyon için işlenmesi için protokolleri ile birlikte Drosophila pupa retina dissekan için cerrahi bir yöntem sunuyor.

Özet

Drosophila pupa retina bir mükemmel model sistemi geliştirme sırasında morfogenetik işlemler çalışma için sağlar. Bu yazıda, biz hassas Drosophila pupa retina diseksiyon için güvenilir bir iletişim kuralı mevcut. Bizim cerrahi yaklaşım pupa açmak ve tam olarak ayıklayın göz-beyin kompleksleri için gönüllülük elde edilebilir mikrodiseksiyon araçları kullanır. Bunlar sabit, immünhistokimya ve retina tabi o zaman mikroskop slaytlar monte edilebilir ve hedef hücre veya hücre altı yapıları algılamak için ise görüntüsü. Alternatif olarak, sabitlenmemiş retina olabilir beyin dokusundan izole, uygun arabellekleri lysed ve (protein veya gen ifadesi, sırasıyla değerlendirmek) protein Jel Elektroforez veya mRNA çıkarma için kullanılmaktadır. Önemli uygulama ve sabır açıklanan mikrodiseksiyon Protokolü master için gerekli olabilir, ama hakim sonra protokol çoğunlukla hasarsız retina nispeten hızlı yalıtım sağlar.

Giriş

Drosophila retina pigment hücreleri bir petek kafes1,2,3,4' te düzenlenen çevrili yaklaşık 750 ommatidia oluşur. Her ommatidium sekiz photoreceptor nöronlar, dört lens salgılayan koni hücreleri ve iki birincil pigment hücreleri içerir. Her ommatidium çevreleyen pigment üreten kafes hücreleri ve duyusal kıl grupları vardır. Onun sonrası Mitotik doğa ve klişeleşmiş altıgen düzenleme nedeniyle, Drosophila pupa retina morfogenetik süreçleri hücre adezyon5,6de dahil olmak üzere çalışma için bir mükemmel model sistemi sağlar, 7,8,9,10 ve Apoptozis11,12,13,14,15.

Birkaç yayımlanmış protokol hava basıncı Drosophila pupa16,17,18--dan göz-beyin kompleksleri ayıklamak için kullanmak. Açıklanan protokol burada yerine mikrodiseksiyon araçlar için dikkatli bir şekilde kullanır ve tam olarak göz-beyin kompleksleri hasarsız retina doku elde etme amacı ile izole. Bu retina için kullanılmak üzere iseniz çok önemlidir morfolojik, protein veya gen ekspresyonu inceliyor retina hasar hücresel stres veya hücresel fenotip veya gen ifade değişiklik olabilir ölüm neden olabilir beri. Ayrıca, antrenmandan sonra 6-10 göz-beyin kompleksleri 10-15 dk, yaş ve gelişim aşaması disseke göz dokusunun değişkenlik minimize amacı kolaylaştırmak izole.

Fiksasyon, immunostaining ve aşağıda açıklanan bütün Dağı Protokolü floresan mikroskopi Drosophila gözleri hazırlanması için uygundur. Retina protein ilgi hedefleme antikorlar ile inkübe. Örneğin, antikorlar adherens junction bileşenlerine hücrelerinin apikal circumferences böylece hücre türü de dahil olmak üzere özellikleri, şekil ve düzenleme biçilen19olabilir görselleştirmek için yararlı olabilir. Fiksasyon önce gözleri onun yerine--dan Batı analiz için protein veya RNA qRT-PCR kullanımda veya RNA-sıralama çekme amacıyla beyin i ciddi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. doku hazırlık

  1. Drosophila kurmak haçlar (20daha önce açıklandığı gibi) veya istenen genotip pupa elde etmek için belirli Drosophila suşları kültür. Emin olmak için çok sayıda pupa rastlantısal ortaya, bu sinek kültürler içinde yinelenen besin açısından zengin gıda medya veya standart gıda medya cömertçe Maya-yapıştır ile desteklenmiş kurarsınız.
  2. 25 ° C'de Drosophila kültürleri korumak UAS-GAL4 sistemi kullanan haçlar için GMR-GAL4 posterior morfogenetik karık ve pupa geliştirme21,22,23, boyunca larva göz disk hücrelerdeki ifade bir ideal sürücüsüdür 24. bu etkisiz ve endojen β-galaktozidaz protein ifade ediyor gibi ideal bir denetim olarak çapraz UAS lacZ X GMR-GAL4 hizmet vermektedir çapraz.
  3. Kullanım yavaşça beyaz ön pupa (şekil 1B) sağlıklı kültür tüpleri (şekil 1A) taraftan kaldırın ve 1.5 mL microcentrifuge tüp (şekil 1 c) içine yerleştirmek için distile su ile ıslak oldu bir 6" Bambu tahta ucu.
  4. Tüpler doku odası, Pupa kuruma (şekil 1 d) korumak için yeterli nem korumak için distile su batırılmış küçük bir parça ile birlikte plastik pipet ucu kutusunun içine koyun. Pupa 25 ° c kadar diseksiyon kuluçkaya.
  5. Yavaşça microcentrifuge tüp ve çanak dissekan siyah üzerine dışarı pupa itmek için bir kuru 6" Bambu tahta kullanın. Çift taraflı bant taze bir parçası uzak pupa diseksiyon çanak üzerine yatıyordu.
  6. Forseps bir çift kullanarak, dikkatli bir şekilde (yani, operculums şekil 1B, karşı karşıya) pupa dorsal tarafa teyp (şekil 2A) yerleştirin. Pupa teybe de uymasını sağlamak.
    Not: Nem pupa davasında güvenli yapışma teybe, bu durumda inhibe, Pupa çift taraflı bant koymadan önce kurumasını sağlar.

2. göz-beyin kompleksleri diseksiyon

  1. Forseps her pupa (şekil 2C) operculum kaldırmak için kullanın.
  2. Dilim veya her pupa pupa olgusu kesmek için mikrodiseksiyon makas kullanın. Flep baş, göğüs ve çift taraflı bant (şekil 2C) pupa çalışmasına kenarlarını güvenliğini sağlama ön karın segmentinde ortaya çıkarmak için pupa dava açın.
    Not: Tamamen pupa ortaya çıkarmak gerekli değildir.
  3. Hayvan, kavramak için keskin Forseps ile her pupa karın işlemek ve çıkarmak o kendi pupa halinde (şekil 2C).
  4. Pupa kaseti uzak siyah diseksiyon çanak üzerine yerleştirin ve buz gibi fosfat tamponlu-çözüm (PBS, pH 7,4) yaklaşık 400 µL ile kaplayın.
  5. Her pupa karın tarafından mikrodiseksiyon makas ve Forseps ile kavramak, pupa yarıda kesme tüm Toraks ile temiz kesitsel bir kesme yapmak (şekil 2B).
  6. PBS her karkas posterior kalıntısı çıkarın ve parçalara çanak üzerinde bir yana koymak (değil atmak, adım 3.2.1 bakınız).
  7. İki çift iyi forseps kullanarak, Toraks ve baş-in göz-beyin kompleksi (şekil 2E) ortaya çıkarmak için her pupa açın. Bunu yapmak için Toraks epitel kesim kenarlarını kavramak ve yavaş yavaş Toraks açın ve sonra kapsül, göz-beyin karmaşık ve çevresindeki yağ dokusu açığa kafa için gözyaşı.
  8. Doku açgözlü olmadan, forseps göz-beyin karmaşık baş kapsül kalıntıları uzak Kılavuzu veya yırtık-açık kafa Kapsül dan göz-beyin karmaşık Kepçe için kullanın.
    Not: Göz-beyin karmaşık dumbbell şeklinde, off-beyaz ve daha şeffaf çevreleyen krem rengi FAT (şekil 2B, E).
  9. Forseps ile dikkatlice göz doku dokunmadan göz-beyin kompleksleri ile ilişkili çoğu yağ çıkarmak.

3. doku ayirt için işlenmesi

  1. En az 6-10 pupa açıklanan (Adım 2,1 2,9) incelemek.
    Not: 3-4 bağımsız çoğaltır kandan her bir hipotezi test etmek için yeterli veri verim eğilimindedir.
  2. Çamaşır ve fiksasyon
    1. Bir P20 ucu veya P100 pipet ucu ~ 1 mm çapındaki ipucu açılışına artırmak ve PBS ve yukarı ve aşağı yağ karışımı pipetting tarafından yağlamak için temiz bir tıraş bıçağı ile kesti. Bu yağ adım 2.6 kaldırıldı karkas kalıntıları elde edilebilir.
    2. Göz-beyin kompleksleri ~ 400 µL PBS buzda bir 9-şey cam tabak, içine aktarın. Yağlanmış ipucu ve P20 veya P100 hava deplasman micropipette aktarmak için kullanın.
      Not: Göz-beyin kompleksleri pipetting sırasında unlubricated keyif-e doğru uymak ve bozulabilir veya kayıp.
    3. Yukarı ve aşağı yavaşça göz-beyin kompleksleri girdap PBS pipetting tarafından göz doku ile ilişkili kalan yağ çıkarmak. Bu kırılgan göz doku zarar bu ve tüm sonraki çamaşır adımları, doğrudan göz-beyin kompleksleri yukarı ve aşağı pipet değil.
    4. Asgari miktar göz-beyin kompleksleri transfer (< 20 µL), PBS sabitleştirici en az 250 µL içine. Yukarı ve aşağı belgili tanımlık eriyik pipetting tarafından karıştırın. Buz üzerinde 35 dk için kuluçkaya.
      Not: 3.1.1. adımda hazırlanan aynı yağlanmış ipucu bu transfer için kullanılabilir.
    5. Aynı pipet ucu ile göz-beyin kompleksleri PBS bir de içeren ~ 400 µL aktarın. Yukarı ve aşağı belgili tanımlık eriyik pipetting tarafından mix ve 5-10dk buzda yıkamak için kuluçkaya. En az iki kez çamaşır adımı yineleyin.
      Not: Göz-beyin kompleksleri birkaç saat son PBS yıkama, buz üzerinde veya adım 3.3.1 geçmeden önce 4 ° C'de muhafaza edilebilir.
  3. Antikor boyama
    1. Antikor çözümler maruz önce doku engellemek için göz-beyin kompleksleri PBT ~ 400 µL için transfer. Yağlanmış ipucu ve P20 veya P100 hava deplasman micropipette transferi için kullanın. 10-60 dakika, buz üzerinde kuluçkaya.
    2. Birincil antikor çözüm PBT uygun antikor sulandrarak hazırlayın. Göz-beyin kompleksleri antikor çözüm 10 µL aliquots içinde inkübe, hazırlanan birim bir çoğaltma 10 olacaktır.
    3. 72-şey microwell tepsi temiz bir kuyuya antikor çözümün aliquot 10 µL (konuya bakın).
    4. P10 pipet ucu ~0.5 mm çapındaki ipucu açılışına artırmak ve pipetting PBT tarafından yukarı ve aşağı yağlamak için temiz bir tıraş bıçağı ile ucu kesilmiş.
    5. Hayır daha--dan 5 göz-beyin kompleksleri, bir ses aktarım < PBS, 3 µL de antikor çözüm P10 hava deplasman micropipette ve yağlama ipucu kullanarak her 10 µL içine.
    6. Antikor çözüm çözüm yukarı ve aşağı pipetting tarafından lunaparkçı. Bu doku zarar verir gibi yukarı ve aşağı göz-beyin kompleksleri pipette değil.
    7. Antikor çözüm buharlaşma en aza indirmek için doku distile su içine microwell tepsi batırılmış küçük bir parça yer ve belgili tanımlık tepsi (sağlanan Örneğin, kapak ile) mühür. Gecede 4 ° C'de kuluçkaya
    8. Göz-beyin kompleksleri microwell tepsiden PBT 9 benzetti cam tabak yıkama ~ 400 µL aktarın. Bir P10 hava deplasman micropipette ve PBT yağlanır ipucu (3.3.4. adımda açıklandığı şekilde hazırlayın) kullanın. Yukarı ve aşağı belgili tanımlık eriyik pipetting tarafından karıştırın. 5-10 dakika buz üzerinde kuluçkaya.
    9. En az iki kez çamaşır adımı yineleyin. P20 veya P100 hava deplasman micropipette ve PBT yağlanır ipucu göz-beyin kompleksleri yıkama çözümleri arasında aktarmak için kullanın.
    10. İkincil antikor çözüm uygun fluorophore öğesini ikincil antikor PBT gerektiği gibi sulandrarak hazırlayın. İkincil antikor çözeltinin 100 µL 6-10 pupa toplu yeterlidir. Aliquot ikincil antikor çözüm 9 benzetti cam diseksiyon çanak içine.
    11. Göz-beyin kompleksleri ikincil antikor çözüm aktarın. P20 veya P100 hava deplasman micropipette ve ipucu PBT yağlanır transferi için kullanmak.
    12. 1-2 h oda sıcaklığında veya 4 ° C'de 3-5 h için ikincil antikor çözümde göz-beyin kompleksleri kuluçkaya Fluorophores ışık tarafından beyazlatma önlemek için hazırlık folyo ile kapak.
      Not: Kuluçka ikincil antikor çözümünde en uygun süresi kullanılan birincil ve ikincil antikorları göre farklı olabilir.
    13. Göz-beyin kompleksleri PBT bir 9-şey cam tabak yıkama ~ 400 µL aktarın. Yukarı ve aşağı belgili tanımlık eriyik pipetting tarafından karıştırın. 5-10 dakika buz üzerinde kuluçkaya. Bu çamaşır adım en az iki kez yinelenmelidir.
  4. İkincil fiksasyon
    1. İkincil bir fiksasyon için sabitleştirici en az 200 µL için göz-beyin kompleksleri aktarmak ve oda sıcaklığında veya 4 ° C'de 35 dk. 20 dk için kuluçkaya
      Not: İkincil fiksasyon montaj (Adım 3.5) AIDS göz doku stiffens.
    2. P20 veya P100 hava deplasman micropipette ve PBT yağlanır ipucu göz-beyin kompleksleri için 5 dk yıkamayı PBT buz üzerinde bir 9-şey cam tabak ~ 400 µL içine aktarmak için kullanın.
    3. En az bir kez yıkama adımı yineleyin.
    4. Kullanım bir P20 veya P100 hava deplasman micropipette ve göz-beyin kompleksleri için 1-2 dk. durulama için PBS buz üzerinde bir 9-şey cam tabak ~ 400 µL içine aktarmak için ipucu PBT yağlanır pipetting PBS yanında devinim dokusunda ama doku olmadığı tutmak , yukarı ve aşağı yerleşme ve cam yemek için PBS-durulama sırasında kalarak göz-beyin kompleksleri önlemek için.
  5. Montaj
    1. Göz-beyin kompleksleri medya montaj ~ 200 µL aktarın. P20 veya P100 hava deplasman micropipette ve PBT yağlanır ipucu göz-beyin kompleksleri aktarmak için kullanın. 1-2 h için ortam takma equilibrate doku sağlar.
    2. 5-8 µL damla taze montaj medya temiz mikroskop slayt üzerine yerleştirin.
    3. P10 ucu ile temiz jilet ~0.5 mm çapındaki ipucu açılışına artırmak ve bu ve bir P10 hava deplasman micropipette 5-8 µL ortam slayt üzerinde takma damla içine medya montaj göz-beyin kompleksleri aktarmak için kullanın kesin.
    4. İki tungsten iğneler gözleri optik loblar ayırmak için kullanın. Slayda bir göz-beyin karmaşık bir sağlam tungsten iğne ile pin ve onun ilişkili optik LOB uzak her gözün iyi tungsten iğne (şekil 2F) ile dilim.
    5. Her göz mikroskop slayt yüzeyine her göz için slayt bitişik Bazal yüzeyi ile manevra için iyi tungsten iğne kullanın. Yavaşça temiz kapak notu üzerinde doku düşürmek ve oje ile güvenli.
      Not: böylece onlar birbirlerine yakın veya bir çizgi vardır gözleri slayt üzerinde düzenleme sonraki mikroskobu kolaylaştıracaktır.
    6. Floresan veya confocal mikroskobu kullanılarak retina görüntü.
      Not: Slaytlar 4 ° C'de depolanan değilse hemen görüntüsü.

4. Western Blot hazırlığı Eye doku:

  1. 10-16 pupa (Adım 2.1-2,9) aşağıdaki değişiklikler ile incelemek: a) toplamak ve pupa 10-15 dk arayla iki gruplar halinde incelemek ve b) fosfataz ve proteaz inhibitörleri ile (PBS + pi) takıma PBS incelemek.
  2. Bir P20 kullanarak göz-beyin kompleksleri aktarmak veya P100 deplasman micropipette hava ve PBS + pi buz üzerinde bir 9-şey cam tabak kısaca durulama için ~ 400 µL (Adım 3.2.1 olduğu gibi hazır) ipucu yağlanır.
    Not: Sonraki adımlar 4.3 ve 4.4 yağlama bu uç kullanılabilir.
  3. Durulama adım iki kez tekrarlayın.
  4. Tüm göz-beyin kompleksleri ~ 400 µL buz soğuk PBS + pi temiz siyah bir diseksiyon yemek çıkarmak içine aktarın.
  5. Her gözün optik (sürekli göz-beyin kompleksi için) sağlam tungsten iğne kullanarak loblar kaldırmak ve bir güzel tıraş bıçağı veya mikrodiseksiyon temiz kesim her gözün optik LOB makas.
    Not: Gözleri bu aşamada 'yapışkan' olan ve hafifçe diseksiyon yemek için uygun. (Konuya bakın) optik loblar gözlerinden kaldırılması kolaylaştıracak yardımcı olabilir gibi avantajlıdır.
  6. 'Tüm gözler 'yığınına' Tarama' PBS + forseps iyi bir çifti bir bıçak kullanarak pi diseksiyon çanak üzerinde.
  7. P10 bahşiş ~0.5 mm çapındaki ipucu açılışına genişletmek ve yukarı ve aşağı uç-iç tarafından pipetting Western doku lizis arabellek (WTLB) yağlamak için temiz bir tıraş bıçağı ile kesti.
  8. PBS + pi 5 µL göz-beyin kompleksleri bir 500 µL microcentrifuge tüp içine aktarın. Bu yağlama uç ve P10 hava deplasman micropipette transferi tamamlamak için kullanın.
  9. Microcentrifuge tüp Buza koyun. 1 birim (5 µL) örnek, WTLB ve 2 x yoğun protein örnek arabelleği 10 µL (veya 5 x yoğun protein örnek arabelleği 2.5 µL) ekleyin. Dokunarak karıştırın.
  10. Girdap microcentrifuge kısaca tüp ve bir masaüstü Mini santrifüj kullanarak örnek spin.
  11. -20 ° C'de örnek analiz kadar saklayın. Standart protokolleri kullanarak analiz.

5. hazırlık göz dokusunun RNA çıkarılması için:

  1. Eldiven, temiz benchtop, mikroskop, diseksiyon araçları ve çanak ilk % 70 etanol ve ardından RNase dekontaminasyon reaktif dissekan siyah giyiyor. Kurumasını sağlar.
  2. 30-40 pupa gibi tarif (adımlar 2,1 2,9) aşağıdaki değişiklikler ile incelemek: bir) toplamak ve incelemek 6-8 pupa gruplar halinde, 15-20 dk ayrı; b) teşrih nükleaz ücretsiz PBS ve c) ayrı ayrı her toplu göz izole ama tüm retina doku aynı microcentrifuge tüpüne (Adım 5.5) birikir.
    Not: iki kişi aynı anda parçalara sahip verimli yalıtım iyi göz dokusunun hızlanır.
  3. Her toplu işlem için göz-beyin kompleksleri (Adım 2.1-2,9) ve bir P20 veya P100 hava deplasman micropipette ve yağlama ipucu (3.1.2. adımda açıklandığı gibi hazırlanmış) kullanarak transfer içine ~ 400 µL PBS bir 9-şey cam tabak nükleaz ücretsiz kısaca, buzda, durulama, izole etmek.
    Not: Sonraki adımlar için 5,4, 5.5 ve 5,8 yağlama bu uç kullanılabilir.
  4. Durulama adım iki kez tekrarlayın.
  5. Göz-beyin kompleksleri çanak dissekan siyah üzerinde temiz bir buz gibi PBS nükleaz ücretsiz taze 400 µL damla aktarın.
  6. Her gözün optik (karmaşık göz beyin sürekli için) sağlam tungsten iğne kullanarak loblar kaldırmak ve bir güzel tıraş bıçağı veya mikrodiseksiyon temiz kesim her gözün optik LOB makas.
    Not: Gözleri bu aşamada 'yapışkan' olan ve hafifçe diseksiyon yemek için uygun. (Konuya bakın) optik loblar gözlerinden kaldırılması kolaylaştıracak yardımcı olabilir gibi avantajlıdır.
  7. 'Tüm gözler 'yığınına' forseps iyi bir çifti bir bıçak kullanarak nükleaz ücretsiz PBS içinde parçalanmış çanak üzerinde süpürme'.
  8. Gözleri bir steril RNase free microcentrifuge tüp için aktarmak ve flash-sıvı azot kıpırdama.
  9. Diseksiyon (Adım 5,3 5,8) her toplu işleminin pupa yineleyin. Gözlerin her toplu iş iş bir tüp içinde tüm gözler biriktirmek için sıvı azot (Adım 5.5) muhafaza edilmiştir aynı microcentrifuge tüp içine aktarın.
  10. -80 ° C'de örnekleri RNA ayıklama kadar saklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Pupa göz gelişimsel süreçleri araştırmak için mükemmel bir model hizmet veren bu sürücü morfogenez kolayca erişilebilir bir dokudur. Burada, retina disseke ve ayirt apikal adherens kavşaklar (şekil 3A, C) veya apoptosis (şekil 3)25sırasında aktif Dcp-1 caspase (şekil 3D) algılamak için kullanılan. Bu yaklaşımlar açıkça işe alım ve morfogenetik Primer hücre (dan 18 h APF) dahil olmak üzere öne...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Drosophila pupa göz diseksiyon burada açıklanan yöntemi 6-10 göz-beyin kompleksleri 10-15 dakika içinde yalıtım olanak sağlar. Ancak, sabır ve uygulama diseksiyonu tekniği master ve diseksiyonu hızını ve kalitesini geliştirmek için gereklidir. Bu kısa diseksiyon kez her gözün retina bir veri kümesindeki fenotip veya gen ifadesi değişkenliği azaltmak yaklaşık aynı gelişimsel sahne, sağlanır. Alternatif iletişim kuralları daha az pratik master için gerekli olabilir ederken, bizim iletişim kuralı sistemli bir şekil...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

El yazması üzerinde Zack davul ve bizim yorumcular yararlı yorumlar için teşekkür ederiz. Bu eser R15GM114729 tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Adobe PhotoshopAdobeGörüntü işleme yazılımı
Bambu splintler, 6 " Ted Pella Inc116
Beta merkaptoetanolSigma-AldrichM3148
Beta-gliserol fosfatSigma-Aldrich50020
Siyah diseksiyon kabıSYLG170 veya SYLG184 (ince öğütülmüş kömür tozu ile siyah renkli) kenara doldurulmuş cam petri kabı. Polimerize olması için 24-48 saat oda sıcaklığında bırakın.
Bıçak tutucuGüzel Bilim Araçları10053
Sığır serum albüminiSigma-AldrichA7906
cTam, EDTA içermeyen proteaz inhibitörü kokteyl tabletleriRoche4693132001
Konfokal mikroskop (Zeiss LSM 501)Carl Zeissveya benzeri mikroskop
Dietil Pirokarbonat (DEPC)Sigma-Aldrich40718
Çift taraflı bant3M665
Drosophila gıda ortamı, besin açısından zengin %7,5 sükroz, %15 glikoz, %2,5 agar, %20 bira mayası, %5 pepton, %0,125 MgSO4.7H2O, %0.125 CaCl2.2H20
Drosophila gıda ortamı, standartBloomington Drosophila Stok merkezi mısır unu tarifi.  (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)
Etilendiamintetraasetik asitSigma-AldrichE6758
PBS, pH 7.4'te fiksatif çözelti
Floresan mikroskobu (TCS SP5 DM mikroskobu)Leica Microsystemsveya benzeri mikroskop
Forseps Güzel Bilim Aletleri91150-20Forseps sık sık keskinleştirilmelidir.
FormaldehitThermo Scientific28908
Cam 9 kuyulu tabaklar Corning7220-859 kuyulu yemekler olarak da bilinir 
Cam lameller (22 x 22 mm)Fisher Scientific12-542-B
Cam mikroskop slaytları (25 x 75 x 1 mm)Fisher Scientific12-550-413
Cam petri kabıCorning3160-100BO
GliserolSigma-AldrichG5516
Image Studio yazılım sürümü 5.2.5LI-COR BiosciencesBatı lekelerinin niceliklemesi için görüntü işleme yazılımı.
Laemmli numune tamponuBio-Rad161-07372X konsantre protein numune tamponu, üreticinin talimatlarına göre beta merkaptoetanol ile takviye edilir.
Örnek tamponunu azaltan şerit işaretleyici ThermoFisher Scientific390005X konsantre protein numune tamponu.
Mikrosantrigür tüpleri AxygenMCT-175-C
Mikrodiseksiyon makası Güzel Bilim Araçları15000-03
Mikro kuyu tepsileri (72 x 10 &mikro; L kuyuları)Nunc438733
Montaj ortamıPBS'de %0,5 N-propilgallat ve %80 gliserol
N-propilgallatSigma-AldrichP3130
Nükleaz içermeyen PBS (%0,1 DEPC'de PBS, pH 7.4)PBS'ye uygun hacimde DEPC ekleyin, iyice karıştırın ve sürekli karıştırarak gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. En az 20 dakika otoklavlayın. 4 ° C'de saklayın; C
PBS (fosfat tamponlu tuzlu su pH 7.4)Sigma-AldrichP5368Üreticinin talimatlarına göre hazırlayın
PBS+pi (PBS artı proteaz ve fosfataz inhibitörleri)10mM NaF, 1mM beta-gliserol fosfat ve 1mM Na3VO4 PBS, pH 7.4.   
PBS'de PBT% 0.15 TritonX ve% 0.5 sığır serum albümini, pH 7.4
Pim tutucuGüzel Bilim Araçları26016-12
Birincil antikor: keçi anti-GAPDHImgenexIMG-3073Batı lekeleme için. 1:3000'de kullanılır
Birincil antikor: tavşan anti-bölünmüş Dcp-1Hücre sinyali9578Sİmmünofloresan için. 1:100'de kullanılır
Birincil antikor: sıçan anti-DEcadGelişimsel Çalışmalar Hibridoma BankasıDCAD2. 1:20'de kullanılır
Birincil antikor: sıçan anti-DEcadDOI: 10.1006/dbio.1994.1287DCAD1  Tadashi Uemura'dan hediye. 1:100'de kullanılır.
RNA ekstraksiyon kiti: Relia Prep RNA dokusu Miniprep kiti PromegaZ6110
Rnase dekontaminasyon reaktifi (RNase Away)Moleküler BiyoÜrünler7002
Neşter bıçaklarıİnce Bilim Araçları10050Küçük bir scapel bıçağı parçasını kırın ve bıçak tutucusuna sabitleyin.
İkincil antikor: 488-konjuge ve nbsp; eşek anti-sıçan IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch712-545-153İmmünofloresan için. 1:200'de kullanılır
İkincil antikor: cy3-konjuge keçi tavşan önleyici IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch111-165-144İmmünofloresan için. 1: 100
İkincil antikorda kullanılır: HRP konjuge keçi anti-sıçan IgG (H + L)Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi7077. 1: 3000'de kullanılır
İkincil antikor: HRP konjuge tavşan anti-keçi IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch305-035-003Western blot için. 1:3000
Sodyum KlorürSigma-AldrichS3014
Sodyum FlorürSigma-Aldrich215309
Sodyum vanadatSigma-Aldrich50860
Spektrofotometre (NanoDrop)ThermoFisher Scientific2000c 
Stereo diseksiyon mikroskobu (M60 veya M80)Leica Microsystemsveya benzeri mikroskop
Sylgard (siyah)Dow CorningSYLG170
Sylgard (şeffaf)Dow CorningSYLG184İnce öğütülmüş kömür tozu ile siyah
renk Doku: KimwipesKIMTECH34120
TritonXSigma-AldrichT8787
Trizma hidroklorür pH7.5Sigma-AldrichT5941
Tungsten iğne, inceGüzel Bilim Araçları10130-10Pim tutucuya yerleştirin
Tungsten iğnesi, sağlamGüzel Bilim Araçları10130-20Pim tutucuya yerleştirin
WTLB (batı doku lizis tamponu)50mM Tris<>12>3 içinde 1mM EDTA, %20 gliserol, 10mM NaF, 1mM beta-gliserol fosfat ve 1mM Nasub34 içinde (pH 7.5). 10 mL çözelti başına bir cOmplete proteaz kokteyl masası ile takviye edin.
Maya ezmesi(yerel süpermarket)~ 20 mL damıtılmış H < sub > 2 O içinde çözülmüş yaklaşık 2 yemek kaşığı Fleischmann's ActiveDry Maya (veya benzeri)
% 4 formadehit. İmmünofloresan için Batı blotlama için

Kaynaklar

  1. Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).
  2. Wolff, T., Ready, D. The development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview. 1277-1325 (1993).
  3. Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Current opinion in genetics & development. 17 (4), 309-313 (2007).
  4. Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Developmental Dynamics. 241 (1), 136-149 (2012).
  5. Hayashi, T., Carthew, R. W. Surface mechanics mediate pattern formation in the developing retina. Nature. 431, 647(2004).
  6. Bao, S., Cagan, R. Preferential Adhesion Mediated by Hibris and Roughest Regulates Morphogenesis and Patterning in the Drosophila Eye. Developmental Cell. 8 (6), 925-935 (2016).
  7. Cordero, J. B., Larson, D. E., Craig, C. R., Hays, R., Cagan, R. Dynamic Decapentaplegic signaling regulates patterning and adhesion in the Drosophila pupal retina. Development (Cambridge, England). 134 (10), 1861-1871 (2007).
  8. Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing Drosophila pupal retina. Mechanisms of development. 125 (3-4), 223-232 (2008).
  9. Martín-Bermudo, M. D., Bardet, P. L., Bellaïche, Y., Malartre, M. The vav oncogene antagonises EGFR signalling and regulates adherens junction dynamics during Drosophila eye development. Development. 142 (8), 1492-1501 (2015).
  10. Chan, E. H., Chavadimane Shivakumar, P., Clément, R., Laugier, E., Lenne, P. F. Patterned cortical tension mediated by N-cadherin controls cell geometric order in the Drosophila eye. eLife. 6, e22796(2017).
  11. Lin, H. V., Rogulja, A., Cadigan, K. M. Wingless eliminates ommatidia from the edge of the developing eye through activation of apoptosis. Development. 131 (10), 2409-2418 (2004).
  12. Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mechanisms of development. 121 (12), 1523-1530 (2004).
  13. Mendes, C. S., et al. Cytochrome c‐d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina. EMBO reports. 7 (9), 933-939 (2006).
  14. Monserrate, J., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death & Differentiation. 14 (2), 209-217 (2007).
  15. Bushnell, H. L., et al. JNK is antagonized to ensure the correct number of interommatidial cells pattern the Drosophila retina. Developmental Biology. 433 (1), 94-107 (2018).
  16. Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, (2007).
  17. Hsiao, H. Y., et al. Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4347(2012).
  18. Tea, J. S., Cespedes, A., Dawson, D., Banerjee, U., Call, G. B. Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (93), e52315(2014).
  19. Johnson, R. I., Cagan, R. L. A Quantitative Method to Analyze Drosophila Pupal Eye Patterning. PLoS ONE. 4 (9), e7008(2009).
  20. Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
  21. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  22. Ellis, M. C., O'Neill, E. M., Rubin, G. M. Expression of Drosophila glass protein and evidence for negative regulation of its activity in non-neuronal cells by another DNA-binding protein. Development. 119 (3), 855-865 (1993).
  23. Duffy, B. J. GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife. genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  24. Li, W. Z., Li, S. L., Zheng, H. Y., Zhang, S. P., Xue, L. A broad expression profile of the GMR-GAL4 driver in Drosophila melanogaster. Genet Mol Res. 11 (3), 1997-2002 (2012).
  25. Song, Z., McCall, K., Steller, H. DCP-1, a Drosophila Cell Death Protease Essential for Development. Science. 275 (5299), 536-540 (1997).
  26. Hay, B. A., Wassarman, D. A., Rubin, G. M. Drosophila homologs of baculovirus inhibitor of apoptosis proteins function to block cell death. Cell. 83 (7), 1253-1262 (1995).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Göz-Beyin KompleksiMikrodisseksiyon Protokolüİmmünohistokimya AnaliziWestern Blot AnaliziRNA İzolasyon YöntemiPupa Göz DisseksiyonuDoku Fiksasyon ProtokolüAntikor İnkübasyonuMikroskop Lamına Monteleme
Drosophila pupa Retina diseksiyon immünhistokimya, Batı analiz ve RNA izolasyon için
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.