Method Article

Neuritogenez ve Sinaps Matürasyonu yüksek içerikli Tarama için İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Nöronların Post-differentiation Rekaplamag

DOI:

10.3791/59305

⸱

August 28th, 2019

 ,  ,  , 
1Division of Biological Sciences, University of California, San Diego, 2Sanford Consortium for Regenerative Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, daha önce birden fazla hafta boyunca in vitro nöral atalardan farklılaşmış insan kök hücre türetilmiş nöronlar resucan ve kültür için ayrıntılı bir prosedür açıklar. Prosedür, ışık mikroskobu ve yüksek içerikli tarama ile uyumlu bir formatta nöritler, sinapslar ve geç ifade nöronal belirteçlerin görüntüleme tabanlı tahlilleri kolaylaştırır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan pluripotent kök hücre türetilmiş nöral progenitor hücrelerinden (NCD) iki boyutlu kültürde ayırt edilen nöronlar, hastalık mekanizmalarını keşfetmek ve bileşimi sorgulamak için yüksek içerikli tarama (HCS) yapmak için güçlü bir model sistemi temsil eder. veya gen mutasyonu fenotiplerini tanımlar. Ancak, insan hücreleri ile fonksiyonel NPC geçiş, olgun nöron birkaç hafta gerektirir. Sinapslar genellikle monolayer kültürde 3 haftalık farklılaşmadan sonra oluşmaya başlar ve birkaç nörona özgü proteinler, örneğin daha sonra ifade eden pan-nöronal belirteç NeuN veya 5/6 serebral kortikal nöron belirteci CTIP2, yaklaşık 4-5 hafta sonrası farklılaşma. Bu uzun farklılaşma süresi, küçük hacimli, çok kuyulu HCS platformlar için kullanılan en uygun kültür koşullarıyla uyumsuz olabilir. Pek çok zorluk arasında, en az hücre kümeleme ile iyi yapışılmış, düzgün dağılmış hücrelere duyulan ihtiyaç ve uzun vadeli canlılık ve fonksiyonel sinaps olgunlaşmasını teşvik eden kültür prosedürleri yer almaktadır. Bir yaklaşım büyük hacimli biçimde nöronlar ayırt etmek, daha sonra HCS uyumlu multi-wells daha sonraki bir zaman noktasında onları replate etmektir. Bu replating yaklaşımı kullanırken bazı temel zorluklar, dendritik ve aksonal ağın stresli bozulması nedeniyle, tekrarlanabilirlik ve hücre canlılığı ile ilgilidir. Burada, insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) türetilmiş nöronların büyük hacimli formatta 4-8 hafta farklılaşmasından sonra, 384-iyi mikrotiter'e aktarılması için ayrıntılı ve güvenilir bir prosedür gösteriyoruz. plakaları ve mükemmel hücre hayatta kalma ile daha 1-3 hafta için onları kültür. İnsan nöronların bu rekaplama sadece replating iki hafta içinde sinaps montaj ve olgunlaşma çalışma sağlar, ama aynı zamanda neurite rejenerasyon ve büyüme konisi özellikleri çalışmaları sağlar. 384 kuyulu bir platform kullanarak neuritogenez ve sinaptogenez için ölçeklenebilir tahlil örnekleri salıyoruz.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan pluripotent kök hücre (hiPSC) türetilmiş nöronlar giderek temel araştırma, ilaç geliştirme ve rejeneratif tıp alanlarında ilgili. İş akışları ve prosedürleri kendi kültür ve bakım optimize etmek ve belirli nöronal alt tiplerefarklılaşma verimliliğini artırmak için, hızla 1,2gelişmektedir. İnsan kök hücre kaynaklı nöronların, ilaç keşfi ve hedef doğrulamada yüksek içerikli analizlere uygun model sistemleri olarak yarar ve maliyet etkinliğini artırmak için, olgun, fonksiyonel oluşturmak için gereken kültürlenme süresini azaltmak yararlıdır nöronlar, maksimum sağlamlık korurken, tekrarlanabilirlik, ve fenotip alaka. 3 boyutlu organoid kültürler nörogelişim araştırmasında atılımlar itici olmasına rağmen3, 2 boyutlu monolayer kültürler ilerler en az doku kalınlığı nedeniyle otomatik görüntüleme tabanlı uygulamalar ile özellikle uyumludur.

Ancak görüntüleme tabanlı tarama yöntemlerinin insan nörolojik ve nörogelişimsel hastalık modellerine uyarlaması büyük bir sorunla karşı karşıyadır. İnsan sinir sisteminin in vivo olarak olgunlaştığı uzun zaman dilimi, doğal gen ekspresyonu programlarını barındırmak ve nöronal olgunlaşmayı sağlamak için kültürde uzun süre yitirir.

Uzun nöronal farklılaşma programının pratik bir sonucu, hiPSC türetilmiş monolayer kültürlerin bakımı yeterli sinaps olgunluğu elde etmek için haftalarca sürdürülmelidir. Bu süre zarfında, farklılaşmamış kalan nöral atalar bölünmeye devam eder. Bu hızlı bir şekilde kültür büyümek ve canlı postmitotik nöronlar korumak için gerekli besin içeriği gasp edebilirsiniz. Şiddetle nöral progenitor hücreleri bölen (NPCs) da büyüme substrat için nöronlar ile rekabet edebilir. Bu, bu tür kültürleri, görüntüleme tabanlı tahliller için uygun olmayan bir durum olan kötü yapışma sorunlarına maruz kılabilir. Ayrıca, birçok araştırmacı küçük kültür hacmi, nöronal farklılaşma geç aşamalarında gözlemlemek için yeterince uzun farklılaşmış nöronların sağlıklı popülasyonları korumak daha büyük zorluk bulabilirsiniz. Başka bir deyişle, yüksek içerik tarama (HCS) yaklaşımları kullanarak sinaps olgunlaşma tahlilleri insan kaynaklı nöronlar için çok zor olabilir.

Bu sorunların bazılarını atlatmak için, daha önce farklılaştırılmış hiPSC türetilmiş nöronların yeniden sulandırılması ve rekaplama bir prosedür kullanılmıştır. İlk olarak, tam kararlı nöronların bir popülasyonda neurite büyüme (ya da daha doğrusu, nöral rejenerasyon) çalışma sağlar. İkinci olarak, daha önce farklılaşmış nöronların büyük hacimli formattan (10 cm veya daha büyük) küçük hacimli biçimlere (HCS uyumlu 96 veya 384 kuyulu mikrotiter plakalar gibi) yeniden kaplaması, toplam kültürlendirme süresinde önemli bir azalma sağlar. küçük hacimli durum. Bu in vitro sonraki haftalarda sinaps montaj ve olgunlaşma çalışmasını kolaylaştırır.

Ancak, zaten uzun nöritler ve karmaşık bir bağlantı ağı kurmuş olgun nöronların rekaplama çeşitli zorluklar sunar, biri hücre ölümü bazen yüksek ve değişken oranıdır. Burada, mükemmel hücre sağkalım ve tekrarlanabilirlik ile sonuçlanan bir rekaplama prosedürü açıklar. Genellikle nöronlar, triturasyon öncesinde hücreleri substrattan ayırmak için kısa kuluçka dönemleri için (genellikle ~3-10 dk) proteolitik enzimlere maruz kalırlar. Bu kısa proteoziz süresi alışılmış olarak, nöronal olmayan hücreler ve farklılaşmamış atalar4,5,6dahil olmak üzere birçok bölen hücre türünü yeniden sulandırmak ve geçirmek için kullanılır. Ancak, uzun, birbirine bağlı nöronlar taşıyan farklı nöronlar için, sadece substrat hücreleri ayırmak için değil, aynı zamanda hasarı en aza indirirken bireysel hücreleri izole etmek için dendritik ve aksonal ağ bozmak için gereklidir. Nitekim, nöronların kalın bir örgü genellikle tek bir levha olarak substrat ayırmak eğilimindedir, yerine bireysel hücreler olarak. Bakım nöritlerin kalın ağ gevşetmek için alınmazsa, nöronlar sadece geri dönüşümsüz hasar lı hale gelir, ama bunların çoğu kümeleri kaldırmak için kullanılan filtre geçmek için başarısız, zayıf hücre verimi ile sonuçlanan. Aşağıda bu zorluklara karşı yaygın olarak kullanılan proteaz kuluçka prosedürü basit bir değişiklik açıklar.

Aşağıda açıklanan protokolde nöronlar 40-45 dakika boyunca proteolitik enzim (örn. Accutase) gibi hafif bir proteaz ile kuluçkaya yatırılır. Enzim ikiekledikten sonra ilk 5-10 dakika boyunca, nöronal ağ bir levha olarak substrat kapalı kaldırır. Proteaz ile kuluçka nazik triturasyon ve filtreleme ile devam etmeden önce ek bir 30-40 dakika için ilerler. Bu ekstra kuluçka süresi, malzemenin sindiriminin hücreler arası ağı rahatlatmasını sağlamaya yardımcı olur ve böylece sonraki triturasyonun tek tek hücrelerin askıya alınmasını sağlar. Bu işlem hücre ölümünü en aza indirirken rekaplama üzerine hücre dağılımının tekdüzeliğini en üst düzeye çıkarır. Bu rekaplama yöntemini çeşitli farklılaşma protokolleri7,8 ve hiPSC'lerin çeşitli hatlarından oluşturulan hiPSC kaynaklı nöronal kültürlere başarıyla uyguladık. Prosedür, kök hücre kaynaklı nöronların çoğu veya tüm hatları ile kullanım için nominal uygundur. Biz uzun bir proteaz kuluçka süresi kesinlikle küçük biçimli plakalar (örneğin, 35 mm çapında) kültürlerin replating için gerekli olmadığını gözlemledik; ancak, burada da gösterdiğimiz gibi, büyük çaplı plakalardan (örn. 10 cm çapında veya daha büyük) rekaplama yaparken, muhtemelen bu plakalarda bulunan nöritler çok uzun süreçleri uzatabildikleri ve yoğun bir şekilde birbirine bağlı bir dizi oluşturabildikleri için önemli bir fayda sağlar.

Burada bu yöntemi göstermek ve kısaca erken neuritogenez ve dendritler ve aksonlar boyunca pre-ve postsinaptik proteinlerin kümelenmesi içeren sinaps olgunlaşma sı için tahlillerde uygulama göstermek, daha sonra takip sinaptik sitelerde kolokalizasyon. Örnekler, bu protokolün hücre canlılığını ve tekrarlanabilirliğini korumada sunduğu avantajları vurgular. İlk olarak, araştırmacılar insan neuritogenesis erken adımları çalışma için izin verir. Deneysel ayarı kemirgen kortikal veya hipokampal nöronların yaygın olarak kullanılan birincil kültürlere benzer, burada hücreler geç fetal veya erken postnatal beyinden çıkarılır, nazik proteaz tedavisi sonrası triturasyon tarafından ayrıştırılır, ve izin nöritler başlatmak veya yordam9,10kesildi nöritler yeniden. Bu tür kemirgen primer nöronlar benzer, hiPSC kaynaklı nöronlar oluşturmak veya replating sonra birkaç saat içinde kendi nöritler yeniden başlar, daha az yüksek spatiotemporal görüntüleme için optimal bir ortamda büyüme konileri ve nörit morfolojisi görüntüleme sağlayan farklılaşmamış hücreleri çevreleyen. Nöronların ilk olarak bir ata popülasyonundan ayırt etmeye başladıklarında görülen değişken gecikmeler ve farklı büyüme oranlarına göre nötrit büyümenin daha senkronize olduğunu gözlemledik. Buna ek olarak, replating genellikle daha sonra nöral gelişim de görünen nöronal alt tip belirteçleri ifade nöronların tahlilleri sağlar, kortikal tabaka gibi 5/6 transkripsiyon faktörü CTIP2 (Tavuk ovalbumin upstream organizatörü transkripsiyon faktör-etkileşen protein 2), veya pan-nöronal marker NeuN11. Replating yaklaşımının özellikle yararlı bir özelliği sinaptogenezin HCS ile uyumlu bir zaman dilimi içinde ilerler.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Replating Öncesi Farklılaşma Dönemi

  1. 10 cm yemekleri üzerinde nöronlar ayırt, seçim bir protokol kullanarak7,8 nöronlar süreçleri ile kalın bir ağ oluşturmuş ve MAP2 veya TuJ1 gibi sadece erken nöronal belirteçleri ifade kadar, ama aynı zamanda NeuN gibi geç belirteçleri.
  2. Nöronal farklılaşma işlemi sırasında her 4 günde bir tercih edilen ortamın yarısını değiştirin.
    NOT:     Daha kapsamlı veya sık orta değişiklikler temel trofik faktörleri seyreltmek ve olgunlaşma olumsuz olabilir.
    1. iPSC türetilmiş WT126 nöronlar için, aşağıdaki diferansiyasyon sonrası kültür ortamıkullanın: 5 mL 100x N2 takviyesi, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF, 1 μg/mL laminin, 200 μM askorbik asit, 1 μM dibutiryl-cAMP ve 500 mL Dulbecco'nun modifiye Kartal'ın modifiye Kartal'ın orta sı için 10 mL SM1 besin karışımı F-12 (DMEM/F12). Yavaş yavaş, yarım ortam değişiklikleri kullanarak, nöral bazal orta ile değiştirin (Malzeme Tablosu) ve aynı takviyeleri.
    2. iPSC türetilmiş CVB WT nöronlar için aşağıdaki diferansiyasyon sonrası kültürortamını kullanın:500 mL nöral bazal A orta (Malzeme Tablosu) ve 500 mL DMEM/F12 orta 2 μg/mL laminin, 10 mL glutamin takviyesi (MalzemeTablosu), 0.75 mg/mL sodyum bikarbonat, 5 mL minimum esansiyel orta (MEM) esansiyel olmayan amino asitler, 0.2 mM askorbik asit, 10 ng/mL BDNF, 20 mL 50x B27 ve 10 mL 100x N2 takviyesi.

2. Kaplama Multiwells

  1. Rekaplamadan bir gün önce, poli-L-ornitin (PLO) ile kat. Bir stok çözeltisi (10 mg/mL) yapmak için steril suda FKÖ çözün. Bu stoku -20 °C'de saklayın. PKÖ'yü 1:100 suyla sulandırın ve kaplama camı 50 g/mL ve kaplama camı 1:1.000 oranı (10 g/mL) elde edin.
  2. Kaplamayı doğrudan hedef plakalara uygulayın. Plaka boyutuna uygun kaplama hacmini kullanın (örneğin, 24 kuyulu bir plaka için kuyu başına 500 μL FKÖ çözeltisi uygulayın).
  3. Tabakların oda sıcaklığında bir gecede karanlıkta oturmasına izin verin.
  4. Kaplamalı plakaları rekaplama gününde alın ve steril bir biyogüvenlik kabinine aktarın.
  5. FKÖ çözeltisini aspire edin ve steril suyla iki kez durulayın.
  6. Seyreltik laminin (1.15 mg/mL) fosfat tamponlu salin (PBS) 1:400 seyreltme.
    NOT: 4 °C'de laminin çözülmesi ve laminin ve düzensiz kaplamanın agregasını önlemek için pbs'ye hızlı cayma.
  7. Steril su aspire ve daha önce PLO ile kaplanmış kuyulara 500 μL laminin kaplama uygulayın.
  8. Plakaları en az 4-6 saat boyunca 37 °C'lik bir kuluçka makinesine yerleştirin. Tutarlı kuluçka süreleri kullanın.

3. Replating Diferansiye Nöronlar

  1. PBS ile farklılaştırılmış nöronların durulayın plaka bir kez yavaşça. PBS'yi, bozulmaması için doğrudan hücrelere değil, plaka duvarından hafifçe aşağı dağıtın.
  2. PBS'yi nazikçe aspire edin, hücrelere doğrudan dokunmaktan kaçınmak için dikkatli olun ama araştırmacıya doğru devrerken yemeğin kenarından aspire edin.
  3. 10 cm'lik plaka başına en az1 mL proteolitik enzim (Malzeme Tablosu) uygulayın ve hücreleri kuvöze döndürün. Doku kültür odası düşük nem nedeniyle yüksek buharlaşma oranı sergiliyorsa biraz daha yüksek hacimler ekleyin.
  4. 40-45 dk proteolitik enzim içeren inkübasyon hücreleri plakadan ayırmak ve nöronal ağ daki diğer nöronlardan ayırmak için.
    NOT: Bu adımda zamanlama çok önemlidir. Proteazçok erken söndürme rekaplama sonra artan hücre ölümüne yol açabilir. Proteolitik enzim üreticisi, 37 °C'nin çok altındaki sıcaklıkların, geçiş yapan hücre hatları için daha uzun kuluçka süreleri ile kullanılmasını önerir (örn. bir gecede 4 °C).) Ancak, 4 °C'deki nöronların kullanımından kaçınılmalıdır, çünkü genellikle soğuk maruziyetten sonra yetersiz sağkalım gösterirler. Üretici ayrıca 37 °C'de enzimle 60 dk kuluçka nın enzimin enziminin enziminin aktivasyonuna yol açtığını belirtir. Ancak, yazarların deneyimlerine göre, 37 °C'de hiPSC kaynaklı nöronal kültürlerin 40-45 dk kuluçka ya da rekaplama üzerine verimli dissociation ve mükemmel nöronal sağkalım için yeterlidir.
  5. Kuluçka süresi boyunca bir faz-kontrast mikroskop üzerinde nöronlar kontrol edin ve proteaz tedavisi nin devam etmesine izin nöral ağ tamamen plaka dan ayırır ve kısa bir süre altında plaka sallayarak üzerine küçük levhalar halinde parçalanmaya başlar Mikroskop.
  6. Sindirimi durdurmak için 10 cm plakada 1 mL proteaz başına 5 mL taze DMEM media kullanarak proteaz aktivitesini söndürün. Serolojik pipetler kullanarak ağı bozmak için hücreleri plakaya karşı 5-8 kez hafifçe triturate. Farklılaştırılmış nöronlar kırılgan olduğu için, triturating yaparken çok fazla basınç uygulamamaya dikkat edin. P1000 ucu kullanmayın, çünkü sonu çok keskin ve dardır ve böylece nöronlara zarar verebilir veya zarar verebilir.
  7. 100 μm çapında örgü ile bir hücre süzgeci aracılığıyla hücrelerle solüsyon uygulayın taze bir 50 mL konik tüp damla damla içine.
  8. Hücreler filtrelendikten sonra 5 mL taze DMEM ortamı yla süzgeçi durula.
  9. Tezgah üstü santrifüjdeki spin hücreleri 1.000 x g'de 5 dk.
  10. Konik tüpü biyogüvenlik kabinesine geri döndürün ve ortamın çoğunu aspire ederek hücrelerin nemi korumasını sağlamak için yaklaşık 250 l'lik bir ortam bırakarak.
  11. 2 mL taze DMEM ortamlarında hücreleri nazikçe yeniden askıya alın. Peleti tüpün yan tarafına sürtünmeyin. Bunun yerine, yavaşça konik 2-3 kez ters ve onları çıkarmak için 5 mL serolojik pipet sonundan hücreleri geçmek.
  12. Bir hemositometre kenarına resuspended nöronlar 10 μL uygulayın.
  13. Bu resuspension adımı sırasında hücre canlılığını değerlendirmek için hücre damlacıklarına 8-10 μL trypan mavisi ekleyin. Bu karışımın 10 μL'sini hemositometreye veya diğer otomatik hücre sayaçlarına uygulayın. Faz parlak ve trypan mavi boya hariç bu hücreleri uygun olarak değerlendirin.
  14. Canlı hücre/mL miktarını belirleyin ve konik tüpün içeriğini istenilen hücre yoğunluğuna göre seyreltmeye hazırlayın.
  15. 384 kuyulu bir plaka için kuyu başına plaka ~10.000 hücre; plaka ~ 150,000-200,000 hücreleri iyi başına 24-iyi plaka için.
  16. Uygun seyreltme elde etmek için resuspended hücrelerin konik tüp taze DMEM ekleyin ve b27 ve / veya BDNF gibi ek uygun takviyeleri eklemek, belirli hücre hattının gereksinimlerine bağlı olarak.
  17. Konik tüpü 2-3 kez karıştırmak için hafifçe yatırın.
  18. 24 kuyulu plakadan veya 16 kanallı pipet kullanarak 384 kuyulu çok kuyulu plakadan aspire laminin kaplamave PBS ile bir kez durulayın.
  19. 24 kuyulu plaka için P1000 veya 384 kuyulu plakalar için 16 kanallı pipet kullanarak PBS'yi aspire edin.
  20. Kümelenmeyi önlemek için sekiz lik bir hareketle her kuyuya hücre çözeltisi uygulayın. Kaplama tekdüzeliği, otomatik sıvı işleme cihazları kullanılarak da optimize edilebilir.
    NOT: Rekaplama sonrası 2-4 gün başlayan ortama laminin eklenmesi de hücrelerin homojen dağılımını korumaya yardımcı olur.
  21. Her kuyu için 3.19 ve 3.20 adımlarını tekrarlayın.
  22. Plakayı 37 °C ve %5 CO 2'de ayarlanan kuvöze geri döndürün.
  23. 2 gün sonra, bölüm 1.2'de açıklanan diferansiyasyon sonrası kültür ortamını kullanarak her 4 günde bir ortamın yarısını değiştirmeye başlayın. İstenilen olgunlaşma süresinden sonra 37 °C'de %3.7 formaldehit kullanarak kültürleri düzeltin ve hücreleri deneysel gereksinimlere göre lekeleyin.

4. Hücre Canlılık Tahlilleri Post-replating

  1. Stok çözeltisini kısa bir süre girdapladıktan sonra erken hücre ölümü muhabirini (VivaFix: kuyu başına 500 μL kültür ortamı başına 50 μL stok çözeltisinin 0,5 μL'lik kısmını) ekleyin.
  2. Görüntü canlı ve ölü hücreler cam alt multiwells kültürlü, 20 dakika sonra, herhangi bir yıkama adımı olmadan, boya floresan sadece bir kez hücrelerin içinde beri, ya da düzeltmek ve 4 ile co-leke 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ve / veya diğer antikorlar görüntüleme den önce konfokal mikroskop kullanarak.

5. İmmünoboyama

  1. PBS'de %3,7 formaldehit artı 37 °C'de 20 dk için 120 mM sakaroz ile kültürleri düzeltin.
  2. Durulama ve% 0.2 Triton X-100 ile 5 dakika oda sıcaklığında, ve sonra% 2 sığır serum albumin (BSA) ile 30 dakika için blok.
  3. Tavşan anti-MAP2 antikor 1:1.000, fare anti-β3 tubulin (TuJ1) antikor 1:2.000, tavuk anti-NeuN antikor (1:100) ve sıçan anti-CTIP2 antikor (1:500) veya anti-PSD95 ile oda sıcaklığında 1 saat durulama ve kuluçka olmadan BSA aspire ( 01:200), tavşan anti-sinapsin 1 (01:200) ve tavuk anti-MAP2 sinaptik boyama için antikor.
  4. PBS ile durula ve Alexa Fluor konjuge sekonder antikorlar artı DAPI ile 37 °C'de 45 dakika kuluçkaya yatırın.
  5. Son olarak, görüntülemeden önce PBS ile iki kez yıkayın.

6. Kalsiyum görüntüleme

  1. AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE (Salk Biyolojik Çalışmalar Enstitüsü, GT3 Çekirdek Tesisi) ile kültürlü hücreleri enfekte 10 gün post-replating ve görüntü de spontan kalsiyum geçici değerlendirmek için 3-4 hafta post-replating.

7. Görüntü edinimi ve Analizi

NOT: Satın alma sistemi hakkında ayrıntılı bilgi için lütfen Calabrese ve ark.12bakın.

  1. Manuel veya otomatik görüntü edinimi için bir görüntüleme modülü ve morfometrik ölçümler için CellProfiler13gibi bir görüntü analizi yazılım modülü kullanın.
  2. TuJ1 pozitif nöritlerin ve MAP2 pozitif dendritlerinin ortalama uzunluğunu, aynı alan daki nöron sayısına (DAPI + MAP2 veya TuJ1 pozitif hücreler) bölünerek görüş alanı başına toplam uzunluğu ölçerek hesaplayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birden fazla hafta için farklılaşmış olan hiPSCs türetilmiş nöronların rekaplama çeşitli avantajlar sunuyor. Ancak, uzun, birbirine bağlı dendritler ve aksonlara sahip farklılaştırılmış nöronların ayrılması ve dizginlettürülmeleri (Şekil1A)geri dönüşümsüz olarak hasar görmüş nöronların yüksek bir fraksiyonuna neden olabilir.

Protokol bölümünde açıklandığı gibi, nöronları substrattan ayırmak için proteolitik enzimle kuluçka kullandık. Tipik olarak,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek içerik tarama platformları ile uyumlu bir şekilde canlılık, farklılaşma başarısı ve hücre altı görüntülemeyi optimize eden insan nöronal kültürlerinin yeniden süspansiyonu ve yeniden kaplaması için doğrudan ileri ye doğru bir prosedür gösterdik. ve uyuşturucu keşfi ile ilgili diğer tahliller. Şekil 6 genel iş akışını ve bu tür uygulamaların örneklerini göstermektedir.

Burada kortikal nöron kaderine yönelik hiPSC kaynaklı nöronlara odaklanmış olsak da, bu yö...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, ulusal kooperatif yeniden programlanmış hücre araştırma gruplarının (NCRCRG) akıl hastalığını incelemek için bir bileşenidir ve NIH grant U19MH1 2015-0644 tarafından desteklenmiştir. İlk çalışmalar da NIH hibe NS070297 tarafından desteklendi. Biz Dr Carol Marchetto ve Fred Gage, Salk Enstitüsü, nöral ata hücrelerinin WT 126 hattı sağlamak için teşekkür ederim, ve Dr Eugene Yeo ve Lawrence Goldstein, UC San Diego nöral ata hücrelerinin CVB WT24 hattı sağlamak için. Biz Yararlı tartışmalar için Dr Anne Bang, Sanford Burnham Prebys Tıp Discovery Enstitüsü, laboratuvarda Deborah Pre teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sonrası Kaplama Ortamı< / güçlü >
L-Askorbik AsitSigmaA44031 L N2B27 ortamına 1 mL 200 mM stok ekleyin
Dibutiril-cAMPSigmaD06271 ve mikro ekleyin; M
İnsan BDNFPeprotech450-0210 ng/ml nihai konsantrasyon
B27 (50x)Thermofisher Scientific175040441 L N2B27 ortamına DMEM
/F12ve 50 mL konik olarak dağıtın; parafilm sargı kapakları
İnsan GDNFPeprotech450-1010 ng/mL nihai konsantrasyon
GlutamaxThermofisher Scientific350500381 L N2B27 ortamına 10 ml ekleyin; glutamin takviyesi
Fare LamininSigmaP3655-10mg100 ve mikro ekleyin; L ila 50 mL N2B27
MEM Esansiyel Olmayan Amino AsitlerThermofisher Scientific111400351 L'ye 5 mL ekleyin N2B27 ortamı
N2 (100x) EkYaşam Teknolojileri17502048500 mL'ye 5 mL ekleyin
Neurobazal A MediaThermofisher Scientific10888022CVB wt hücreleri için N2B27 ortamı oluşturmak için DMEM/F12 ile birleştirin; nöral bazal A ortamı
Nörobazal MedyaWT126 hücreleri için Thermofisher Scientific 21103049; nöral bazal medya
SM1 TakviyesiKök Hücre Teknolojileri5711Ortama 1:50 ekleyin
Sodyum bikarbonatThermofisher Scientific25080-0941 L N2B27'ye 10 mL ekleyin ortam
Plaka Hazırlanışı
10 cm Doku Kültürü YemekleriFisher Scientific08772-EPlastik TC ile muamele edilmiş yemekler
6 kuyulu Doku Kültürü KaplarıThomas Scientific1194Y80NEST plakaları
Fare LamininYaşam Teknolojileri23017-015üzerine 1:400
ekleyin Plastik üzerine 1:1,000 ekleyin
UltraPure Damıtılmış SuYaşam Teknolojileri10977-015Seyreltmek için Poli-L-Ornitin
< güçlü > Kaplama Reaktifleri< / güçlü>
100 mM Hücre SüzgeciCorning431752Steril, ayrı ayrı sarılmış
384 oyuklu plaka, kaplanmamışPerkinElmer6007550FKÖ ve Laminin
DPBSile Kaplama Yaşam Teknolojileri14190144 Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu suyu
Poli-D-Lizin Ön Kaplamalı 384 Kuyulu PlakalarPerkinElmer6057500Laminin ile kaplamadan önce durulayın
StemPro AccutaseLife TechnologiesA11105011 mL/10 cm plakayı 30-45 dakika boyunca uygulayın; proteolitik enzim
fiksasyon malzemeleri< / güçlü>
% 37 FormaldehitFisher ScientificF79-1PBS'de
ÇözüldüSükrozFisher ScientificS5-1210 mL fiksatif
İmmün Boyama Malzemeleri
Alexa Fluor 488 Keçi anti-fareInvitrogenA-11001ikincil antikor
Alexa Fluor 568 Keçi anti-tavukInvitrogenA-11041ikincil antikor
Alexa Fluor 647 Keçi anti-tavukInvitrogenA-21449ikincil antikor
Alexa Fluor 561 Keçi anti-sıçanInvitrogenA-11077ikincil antikoru
DAPIBiotium40043
b3-tubuline (TuJ-1) karşı DNA Fare antikorunuNöromiklerMO15013erken evre nöronal belirteç
CTIP2'ye karşı sıçan antikoruAbcamab18465katman 5/6 kortikal nöronlar
MAP2'ye karşı tavuk antikoruLifeSpan BiosciencesLS-B290erken evre nöronal belirteç
Millipore'akarşı tavuk antikoruABN91geç evre nöronal belirteç
MAP2'ye karşı tavşan antikoruShelley HalpainN/Aerken evre nöronal belirteç
PSD-95SigmaP-246post-sinaptik belirteçlere karşı fare antikoru
Synapsin 1MilliporeAB1543pre-sinaptik belirteç
Sığır serum albüminine karşı tavşan antikoru (BSA)GE Healthcare Life SciencesSH30574.02Titon X-100 Sigma'yı bloke etmek için PBS'de %
109002931geçirgenlik için PBS'de% 0.2'ye seyreltin
Viability Markers
Vivafix 649/660Biorad135-1118hücre ölümü belirteci
Kalsiyum Görüntüleme
Reaktifin / Ekipmanın AdıŞirketKatalogNumarası Yorumlar/
Açıklama AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRETHE SALK INSTITUTE, GT3 Core FacilityN/Aviral dağıtım sisteminde kalsiyum raporlayıcı
hiPSC türevi NPC'ler
WT 126 (Y2610)Gage labN/AMarchetto et al., 2010
CVB WT24Yeo ve Goldstein labsN/Ayayınlanmamış
Glutamax Thermofisher Scientific 31331093 ile 20 mL ekleyin Plastik Poli-Ornitin Sigma P3655-10mg başına 0.8 g< / güçlü >, görselleştirir NeuN

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Engel, M., Do-Ha, D., Munoz, S. S., Ooi, L. Common pitfalls of stem cell differentiation: a guide to improving protocols for neurodegenerative disease models and research. Cell and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3693-3709 (2016).
  2. Kim, D. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 109(2014).
  3. Amin, N. D., Paşca, S. P. Building Models of Brain Disorders with Three-Dimensional Organoids. Neuron. 100 (2), 389-405 (2018).
  4. Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2019).
  5. Langdon, S. P. Cancer Cell Culture. , Humana Press. New York, NY. (2010).
  6. Picot, J. Human Cell Culture Protocols. 107, Springer Science & Business Media. Berlin, Germany. (2005).
  7. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
  8. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  9. Banker, G., Goslin, K. Developments in neuronal cell culture. Nature. 336 (6195), 185-186 (1988).
  10. Calabrese, B., Halpain, S. Essential role for the PKC target MARCKS in maintaining dendritic spine morphology. Neuron. 48 (1), 77-90 (2005).
  11. Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116 (1), 201-211 (1992).
  12. Calabrese, B., Saffin, J. M., Halpain, S. Activity-dependent dendritic spine shrinkage and growth involve downregulation of cofilin via distinct mechanisms. PLOS One. 9 (4), 94787(2014).
  13. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100(2006).
  14. Gupta, S., et al. Deriving Dorsal Spinal Sensory Interneurons from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 390-405 (2018).
  15. Ogura, T., Sakaguchi, H., Miyamoto, S., Takahashi, J. Three-dimensional induction of dorsal, intermediate and ventral spinal cord tissues from human pluripotent stem cells. Development. 145, (2018).
  16. Playne, R., Jones, K., Connor, B. Generation of dopamine neuronal-like cells from induced neural precursors derived from adult human cells by non-viral expression of lineage factors. Journal of Stem Cells and Regenerative Medicine. 14 (1), 34-44 (2018).
  17. Rao, M. S., et al. Illustrating the potency of current Good Manufacturing Practice-compliant induced pluripotent stem cell lines as a source of multiple cell lineages using standardized protocols. Cytotherapy. 20 (6), 861-872 (2018).
  18. Suga, H. Differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic and pituitary cells. Neuroendocrinology. 101 (1), 18-24 (2015).
  19. Endaya, B., et al. Isolating dividing neural and brain tumour cells for gene expression profiling. Journal of Neuroscience Methods. 257, 121-133 (2016).
  20. Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
  21. Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), e54900(2017).
  22. Grainger, A. I., et al. In vitro Models for Seizure-Liability Testing Using Induced Pluripotent Stem Cells. Frontiers in Neuroscience. 12, 590(2018).
  23. Daub, A., Sharma, P., Finkbeiner, S. High-content screening of primary neurons: ready for prime time. Current Opinion in Neurobiology. 19 (5), 537-543 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Pluripotent Stem Cell derived NeuronsNeurite RegenerationSynapse MaturationHigh content ScreeningProtease IncubationCell ReplatingViability AssessmentNeuronal DifferentiationCalcium ImagingMultielectrode Array

Related Articles