Method Article

Görüntü membran reseptörleri Floresans mikroskobu tarafından küme boyutunu ve Difüzyon analizi için protokol işleme

DOI:

10.3791/59314

⸱

April 9th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Macromolecular Structures, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 2Campus Urb. Montepríncipe s/n, Univ. San Pablo CEU, 3Department of Immunology and Oncology, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 4Department of Cell Signaling, Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CSIC), 5Meyer Cancer Center, 6Department of Anatomy and Cell Biology, McGill Univ.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, tek parçacık kantitatif değerlendirilmesi Difüzyon katsayıları, Floresans mikroskobu tarafından algılanan tek parçacıkların hareket ve küme boyutları türleri sağlar görüntü analizi izleme için bir iletişim kuralı mevcut.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir video serisi ve onların yörüngeleri posterior analizi üzerinde izleme parçacık günümüzde birçok biyolojik çalışmalarda ortak bir işlemdir. Hücre membran reseptör analizini kullanarak kümeleri bir model olarak, biz bu görüntü analiz görevi, Fiji (ImageJ) ve Matlab rutinleri için kullanarak için detaylı bir iletişim kuralı mevcut: 1) bölgeleri ilgi tanımlamak ve tasarım bu bölgelere; adapte maskeleri 2) parçacıklar Floresans mikroskobu videoları izlemek; 3) seçili parça Difüzyon ve yoğunluk özellikleri analiz. Kantitatif analiz Difüzyon katsayıları, hareket ve küme boyutu Floresans mikroskobu tarafından elde edilen ve görüntü işleme objektif parçacık dinamiği ve bunun sonuçları belirlemek için değerli bir araç sağlar çevre koşulları. Bu makalede biz bu özellikler analizi için detaylı protokolleri mevcut. Açıklanan yöntemi burada sadece tek molekül izleme algılama, ama aynı zamanda hücre zarı, yanal Difüzyon parametrelerinin tahmini otomatikleştirir, yörünge türünü sınıflandırır ve tam analiz böylece üstesinden sağlar Tüm yörüngesini, hücre zarının üzerinde nokta boyutu miktarının zorluklar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Termal Difüzyon nedeniyle sürekli hareket membran proteinlerinin lipid bilayer gömülü bulunmaktadır. Cins etkileşimleri reaksiyonlar monomerleri boyutu değişir ve kompleksleri sinyal istikrar etkisi kompleksleri oluşumu izin olarak kendi dinamikleri hücre yanıtları, düzenlenmesi için gereklidir. Protein dynamics kontrol mekanizmaları elucidating böylece yeni bir meydan okuma olarak hücre biyolojisi, sinyal iletim yolları anlamaya ve önceden tahmin edilemeyen hücre işlevleri tanımlamak için gerekli olduğunu.

Optik bazı yöntemler geliştirdik bu etkileşimler yaşayan çalışmaya1hücreleri. Bunlar arasında toplam iç yansıma....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. biyolojik örnekler hazırlanması

  1. Jurkat hücrelerin % 10 FCS ile desteklenmiş RPMI 1640 ortamda büyümesine NaPyr ve L-glutamin (tam RPMI). Bir monomeric GFP etiketli Kemokin reseptör vektör (CXCR4-onun algılama Floresans mikroskobu kullanarak izin vermek için AcGFP, 20 μg) Electroporate Jurkat hücrelerle (20 x 106 hücreler/400 µL % 10 FCS ile RPMI 1640,).
    Not: MCherry, mScarlet, vb gibi diğer monomeric floresan proteinler kullanmak mümkündür.
  2. transfection sonra 24 h hücre canlılığı ve CXCR4-AcGFP ifade belirlemek için bir Akış Sitometresi hücrelerde analiz.
  3. Transfected reseptör düşük ifade TIRFM deneylerde ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu Protokolü'nün kullanılmasına Floresans mikroskobu film ve dinamik özellikleri analiz tespit parçacıklar otomatik izleme sağlar. Başlangıçta, hücreleri izlenmesi gereken fluorescently birleştiğinde protein ile transfected. SPT (şekil 1) sıralama hücre tarafından elde edilir sağlar hücre yüzeyi reseptörleri uygun seviyede sunuyor. Seçili hücrelerin bu Protokolü (tamamlayıcı Video 1) açıklanan araçları ile okudu bir biçimde videolar oluşturur.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklanan yöntemi bile Matlab ile çalışan herhangi bir önceki deneyimi kalmadan gerçekleştirmek kolaydır. Ancak, Matlab rutinleri son derece farklı komutlar isimlendirme ve program tarafından istihdam farklı klasörler lokalizasyonu ile doğruluk gerektirir. İzleme çözümlemesi rutin (Adım 3), birden çok parametre değiştirilebilir. "Ayarı Gauss karışım modeli uygun" pencere (Adım 3.8) U-parça videoda tek parçacıkların nasıl algılar denetler. Bu3' te açıklandığı gibi bir Gauss karışım modeli yaklaştır.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz Carlo Manzo ve Maria García Parajo Difüzyon katsayısı analiz onların yardım ve kaynak kodu için müteşekkiriz. Bu eser kısmen İspanyol bilim Bakanlığı, yenilik ve üniversiteler (SAF 2017-82940-R) gelen hibe tarafından desteklenen ve Instituto de salud Carlos III (RD12/0009/009 ve RD16/0012/0006; RETICS programı RIER). LMM ve JV Fundación genel CSIC COMFUTURO program tarafından desteklenir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
İnsan Jurkat hücreleriATCCCRL-10915İnsan T hücre hattı. Bu yazılım
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)Clontech632469ile farklı floresan proteinleri takip edilebilir ve analiz edilebilir
;BioRad Jurkat hücreleri için 280 V, 975 mF kullanıyoruz. Elinizde en iyi çalışan transfeksiyon yöntemini kullanın.
Cytomics FC 500 akış sitometresi Beckman Coulter
MoFlo Astrios Hücre Sıralayıcısı Beckman CoulterTransfeksiyon seviyesine bağlı olarak, hücre sıralaması gerekli olmayabilir. Ayrıca, ilgilenilen reseptörün yeterli seviyelerinin kararlı ifadesine sahip hücreleri de kullanabilirsiniz.
Dako QifikitDakoCytomationK0078Hücre yüzeyindeki reseptörlerin sayısını ölçmek için kullanılır.
Cam alt mikro kuyu tabaklarıMatTek corporationP35G-1.5-10-C
Plazmadan İnsan FibronektiniSigma-AldrichF0895
Rekombinant insan CXCL12PeproTech300928A
Ters Leica TIRFLeica
EM-CCD kameraAndor DU 885-CSO-#10-VP
MATLABMathWorks, Natick, MA
U-Track2 yazılımıDanuser Laboratuvarı
ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/
FiJiFiJIhttps://imagej.net/Fiji)
u-Track2 yazılımıMatlab aracı.  Yüklemek için web sayfasından (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) .zip dosya indirin ve dosyayı seçtiğiniz bir dizinde açın
GraphPad PrismGraphPad yazılımı
ile başka herhangi bir hücre tipi analiz edilebilir DNA3GFP Bu rutin Gen Nabız X Hücre elektroporatörü

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yu, J. Single-molecule studies in live cells. Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).
  2. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Ce....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Image ProcessingFluorescence MicroscopySingle Molecule TrackingParticle TrackingDiffusion AnalysisCluster Size AnalysisRegion Of InterestMask DesignFiji ImageJMATLAB Routines

Related Articles