Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Görüntü membran reseptörleri Floresans mikroskobu tarafından küme boyutunu ve Difüzyon analizi için protokol işleme

8.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/59314

⸱

9 Nisan 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Macromolecular Structures, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 2Campus Urb. Montepríncipe s/n, Univ. San Pablo CEU, 3Department of Immunology and Oncology, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 4Department of Cell Signaling, Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CSIC), 5Meyer Cancer Center, 6Department of Anatomy and Cell Biology, McGill Univ.

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, tek parçacık kantitatif değerlendirilmesi Difüzyon katsayıları, Floresans mikroskobu tarafından algılanan tek parçacıkların hareket ve küme boyutları türleri sağlar görüntü analizi izleme için bir iletişim kuralı mevcut.

Özet

Bir video serisi ve onların yörüngeleri posterior analizi üzerinde izleme parçacık günümüzde birçok biyolojik çalışmalarda ortak bir işlemdir. Hücre membran reseptör analizini kullanarak kümeleri bir model olarak, biz bu görüntü analiz görevi, Fiji (ImageJ) ve Matlab rutinleri için kullanarak için detaylı bir iletişim kuralı mevcut: 1) bölgeleri ilgi tanımlamak ve tasarım bu bölgelere; adapte maskeleri 2) parçacıklar Floresans mikroskobu videoları izlemek; 3) seçili parça Difüzyon ve yoğunluk özellikleri analiz. Kantitatif analiz Difüzyon katsayıları, hareket ve küme boyutu Floresans mikroskobu tarafından elde edilen ve görüntü işleme objektif parçacık dinamiği ve bunun sonuçları belirlemek için değerli bir araç sağlar çevre koşulları. Bu makalede biz bu özellikler analizi için detaylı protokolleri mevcut. Açıklanan yöntemi burada sadece tek molekül izleme algılama, ama aynı zamanda hücre zarı, yanal Difüzyon parametrelerinin tahmini otomatikleştirir, yörünge türünü sınıflandırır ve tam analiz böylece üstesinden sağlar Tüm yörüngesini, hücre zarının üzerinde nokta boyutu miktarının zorluklar.

Giriş

Termal Difüzyon nedeniyle sürekli hareket membran proteinlerinin lipid bilayer gömülü bulunmaktadır. Cins etkileşimleri reaksiyonlar monomerleri boyutu değişir ve kompleksleri sinyal istikrar etkisi kompleksleri oluşumu izin olarak kendi dinamikleri hücre yanıtları, düzenlenmesi için gereklidir. Protein dynamics kontrol mekanizmaları elucidating böylece yeni bir meydan okuma olarak hücre biyolojisi, sinyal iletim yolları anlamaya ve önceden tahmin edilemeyen hücre işlevleri tanımlamak için gerekli olduğunu.

Optik bazı yöntemler geliştirdik bu etkileşimler yaşayan çalışmaya1hücreleri. Bunlar arasında toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi, 1980'lerin başında geliştirilen moleküler etkileşim veya hücre zarı2çok yakınındaki bir çalışma sağlar. Membran protein yörüngeleri yaşayan hücrelerde TIRF veri elde edilen dinamik parametreleri çalışma için tek bir parçacık izleme yöntemini (SPT) gereklidir. Çeşitli algoritmalar bunun için mevcut olmasına rağmen şu anda bu parçacık hareket heterojenite yoğun parçacık alanındaki parçacıklar elde edilen parça bağlanmak için ardışık çerçeveler arasında bağlantı kurarak ele Jaqaman ve ark.3 Yayınevi kullanın kesimleri içine tam yörüngeler (geçici parçacık ortadan kalkması). Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı birleştirme ve bölme sonucunda toplama ve ayrışma olayları3parçacık yakalar. Bu yazılımın çıkış veri algılama tüm yörünge boyunca parçacıkların X ve Y konumlarını her çerçevede tanımlayarak biridir.

Bir kez parçacıkları tespit edilir, kısa timelag Difüzyon katsayısı (D1-4)4,5belirlemek için farklı algoritmaları uygulamak. An ölçekleme spektrum (MSS)6,7,8 analizi uygulayabilir veya 'Alfa' değeri ayarlama, ortalama kare deplasman (MSD) eğrisi9tarafından uygun, ayrıca parçacıklar göre sınıflandırmak yörünge türü.

Floresans görüntülerde nokta yoğunluğunu analiz bilim adamları alan10,11' deki yönergeleri için paylaşılan bir hedefidir. Parlaklık ve sözde numarası kullanılan en yaygın algoritmasıdır. Bu yöntem yine de doğru kare kare yoğunluğu algılama mobil kesir parçacıklar içinde izin vermez. Böylece, yeni bir algoritma bu parçacık yoğunluklarda çerçevelemek-yanında-çerçevelemek değerlendirmek için ve onların toplama durumu belirlemek için oluşturmuş. Bir kez her parçacık koordinatlarını U-Track2 yazılım3kullanarak tespit edilir, biz şiddeti her çerçevede tam yörünge üzerinde Ayrıca her çerçeve içinde hücre arka planı dikkate alarak tanımlar. Bu yazılım nokta yoğunluğu ve hücre arka planı belirlemek için farklı seçenek sunuyor ve referans olarak bilinen monomeric ve dimerik proteinleri kullanarak tespit parçacık (küme boyutu) proteinler yaklaşık sayısını hesaplar.

Bu makalede, aşağıdaki üç adımı gerçekleştirmek için dikkatli bir rehber tarif: 1) tespit ve floresan mikroskopi U-parça; kullanarak bir video boyunca tek parçacıklar izleme 2) bu parçacıklar ve MSS tarafından uzun yörüngeleri ile parçacıkların hareketi (sınırlı, ücretsiz veya yönlendirilmiş) tip anlık Difüzyon katsayısı (D1-4) analiz; 3) Çeviri: her yer için tahmini arka plan Floresans video boyunca nokta yoğunluğu ölçme. Bu küme boyutu tahmin ve kimlik photobleaching adımları sağlar.

Bu Protokolü'nün kullanılmasına özel beceri gerektirmez ve hücre kültürü ile herhangi bir laboratuarda gerçekleştirilen, Akış Sitometresi ve mikroskopi İmkanları. ImageJ veya Fiji (ImageJ12dağıtım), U-track3ve bazı reklam hoc yapılan rutinleri (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip) iletişim kuralını kullanır. U-track ve geçici yordamları uyumlu herhangi bir bilgisayarda yüklü Matlab üzerinden çalışacak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. biyolojik örnekler hazırlanması

  1. Jurkat hücrelerin % 10 FCS ile desteklenmiş RPMI 1640 ortamda büyümesine NaPyr ve L-glutamin (tam RPMI). Bir monomeric GFP etiketli Kemokin reseptör vektör (CXCR4-onun algılama Floresans mikroskobu kullanarak izin vermek için AcGFP, 20 μg) Electroporate Jurkat hücrelerle (20 x 106 hücreler/400 µL % 10 FCS ile RPMI 1640,).
    Not: MCherry, mScarlet, vb gibi diğer monomeric floresan proteinler kullanmak mümkündür.
  2. transfection sonra 24 h hücre canlılığı ve CXCR4-AcGFP ifade belirlemek için bir Akış Sitometresi hücrelerde analiz.
  3. Transfected reseptör düşük ifade TIRFM deneylerde tek parçacık izleme izleme bireysel için sağlamak için gerektiği şekilde hücre GFPdüşük pozitif hücreleri (şekil 1), sıralama tarafından CXCR4-AcGFP düzeyi düşük ifade hücreleri seçin Yörüngeler9.
  4. Reseptörleri hücre yüzeyine sayısını ölçmek.
    Not: Bir örnek13, ~ 8500-22 000 AcGFP etiketli reseptörleri/hücre, ~ 2-4.5 parçacıklar/μm kalınlığında2' ye karşılık gelir.
  5. Resuspend tam RPMI hücrelerde sıralanmış ve en az 2 h 37 ° c, % 5 CO2için kuluçkaya. Santrifüj kapasitesi hücreler (300 x g, 5 dk) ve onları TIRF arabellek (HBSS, 25 mM HEPES, % 2 FCS, pH 7.3) resuspended.
    1. 35 mm cam popolu microwell yemekler (2-3 x 105 hücre/çanak) uygun ligand (yani, CXCL12, 100 nM, 1 h, 37 ° C) ve (20 μg/mL, 1 h, 37 ° C) fibronektin ile kaplı tabakta. Hücreleri (20 dk 37 ° c, % 5 CO2) resim alma önce kuluçkaya.
  6. Bir EM-CCD kamera, bir 100 x petrol-daldırma amacı ile donatılmış bir TIRF mikroskop kullanarak deneyler gerçekleştirmek (HCX PL APO 100 x / 1,46 NA) ve 488 nm diode lazer. Mikroskop sıcaklık kontrolü ve kuluçka CO2sağlar. Bulun ve photobleaching etkileri en aza indirmek için parlak alanını kullanarak kaba ve ince odak topuzlar, hücrelerle odaklanmak. TIRF modunda iyi odak ayarı için düşük lazer şiddeti, yetersiz tek-parçacık algılama için veya photobleaching etkileri (%5 lazer gücü, 28 μW) ikna etmek için kullanın.
  7. Filmler (görüntü sıralarını) yaklaşık 50 kazanmak çerçeveler arasındaki zaman aralığını en aza s. Fani alanının penetrasyon derinliği 70-90 nm olmalıdır. Deneysel her koşul için alınan Filmler ".lif" (video.lif) kaydedin.
    Not: Açıklanan örnek filmlerde %49 lazer güç satın aldı (2 mW) bir çekim hızı 90 MS ve 98 ms, 49 için bir zaman aralığı ile s (500 kare). Seçili fani dalgasının penetrasyon olduğunu 90 nm.

2. çeşitli görüntüleri ve maskeleri oluşturulması

  1. Deneysel her koşul (video.lif) için her serisi için farklı klasörler içermesi gerekir yeni bir klasör (VideoName) oluşturun. Her klasör için video görüntülerinin bir "videoSeq" klasör ve çözümleme sonuçlarını bir "sonuçlar" klasörünü içerir. Şu anda dosya yapısı aşağıda olduğundan emin olun:
    VideoName/video.lif
    VideoName/Seri1/videoSeq
    VideoName/Seri1/sonuçlar
    Not: Mikroskop--dan farklı .lif dosyaları her tedavi durumu (FN, FN + SDF) için birkaç video ile elde edilir. "video.lif" mikroskop gerçekleştirilen input.lif video dosyası tüm TIRF film satın almalar (serisi) ile karşılık gelir. "videoSeq" klasör biz analiz film 500 çerçeveleri içerir. "Sonuçlar" klasör gerçekleştirilen çözümlemesinden tüm dosyaları içerir. Doğru isimlendirme ve yerelleştirme farklı klasörlerin algoritmalar doğru işlev için gereklidir. Adları kalın yukarıdaki listede sabit (yani, onlar çünkü komut dosyaları tarafından aranan isimler bunlar bu şekilde çağrılacak var). Adlarında değil kalın deneme gerçekleştirilen yansıtacak şekilde değiştirebilirsiniz.
  2. TIRFM video (.lif dosya) Fiji menü çubuğu ve BioFormats (tamamlayıcı şekil 1) kullanarak LIF dosyasını içe aktarmak için Tamam tıklayın dosyada bırakarak Fiji veya ImageJ ile açın.
  3. İşleme ve Tamam (tamamlayıcı şekil 2A)'ı tıklatın seriyi seçin. Bir maske bu video analizi için tasarlamak için aynı zamanda farklı kromofor ile çok kanallı bir görüntü alma (örneğin, serisi 1 Serisi 2 ilgili video ve çok kanallı görüntü'dir). Video (ve çok kanallı görüntü) bir ImageJ yığını olarak açılmalıdır. Örnekte (tamamlayıcı şekil 2B), görüntünün sol tarafta ve video sağ tarafta.
    Not: Video için bir maske oluşturulmasını gerekli değildir, adım 2.5 için gidin.
  4. Bir maske oluşturun. Tek bir görüntü ile kanalları maske tasarımı için yararlı oluşturun. Bu durumda, ilginç Kanallar kırmızı, yeşil ve gri olanlar vardır.
    1. Çok kanallı görüntü (ek şekil 3A) kanallardan bölünmüş: görüntü barda seçin menü ve tıkırtı renk | Kanalları bölmek. Farklı kanalları ayrı görüntüler (ek şekil 3B) olarak gösterir.
    2. Yine üç kanal (tamamlayıcı şekil 4A) tek bir görüntüde Birleştir: görüntü barda seçin menü ve Seç renk | Kanalları birleştirme. Uygun kanallar'ý seçin ve Tamam (tamamlayıcı şekil 4B) tuşuna basın. Yeni bir sigara yığılmış görüntü olacak (tamamlayıcı şekil 4 c) oluşturulur.
    3. İki windows Windows Eşitleme aracı (tamamlayıcı şekil 5A) kullanarak eşitleme: analiz barda seçin menü | Araçlar | Senkronize Windows. Eşitle görüntü olanakları ile yeni bir pencere (tamamlayıcı şekil 5B) gösterilecek.
    4. Senkronize iki pencere ile (çok kanallı görüntü ilişkili yok ise sadece video), her iki windows aynı bölgede kırpılmış olabilir. Faiz bölge ImageJ kayan menü dikdörtgen seçim aracı ile çizin. Barda görüntü seçin menü ve Seç kırpma (tamamlayıcı şekil 6A). İki kırpılmış görüntü tek tek gösterilir (tamamlayıcı şekil 6B).
    5. Her iki windows (tamamlayıcı şekil 6B) Windows Eşitleme Yöneticisi'nde Unsynchronize tüm düğmesine basarak unsynchronize.
  5. Bir maske gibi adım 2.4 oluşturduysanız, faiz bölge ImageJ kayan menü dikdörtgen seçim aracı ile çizin.
  6. Karşılık gelen video Rehberi (tamamlayıcı şekil 7A) altında dizin videoSeq bir Resim Silsilesi video Kaydet: çubuğunda dosya seçin menü ve Kaydet'i tıklatın olarak | Görüntü sırası..... video0000.tif, video0001.tif,..., video0499.tif (tamamlayıcı şekil 7B) olarak video sıra etiketlerini yeniden adlandırma: adı kutusuna video yeniden adlandırın ve Tamam' ı tıklatın. Sıra yalnız başarıyla U-track tarafından kullanılmak üzere kendi dizininde olması gerekir.
    Not: Video için bir maske tasarlama adım 2.8 için gitmek değilse.
  7. Bir maske tasarlayın. Çok kanallı görüntü seçin ve segmentasyon yayıncı tapa (tamamlayıcı şekil 8A) açın: eklentileri barda seçin menü ve Seç segmentasyon | Segmentasyon editörü. Eklemek ve segmentasyon Düzenleyicisi (ek resim 8B, C) etiketlerin üzerinde sağ tıklayarak ayrılmasını gerektiği gibi etiketleri yeniden adlandırın.
    1. ImageJ kayan menüsünde uygun seçim aracını seçin (burada, freehand kullanın), bir etiket (yeşil) seçin ve önce en dıştaki maskesi (tamamlayıcı Þekil 9A) Tasarla. Tasarlanmış sonra seçim seçeneği Bileşik penceresinin ve seçilen maske düğmesine basın + ekrana (tamamlayıcı Þekil 9A) görüntülenir. Sonraki etiketleri (iç, kırmızı) ile bu işlemi tekrarlayın (tamamlayıcı şekil 9B).
      Not: Yeşil ve iç etiketleri için maske tasarladıktan sonra dış maskesi görüntünün geri kalanı yer alacak.
    2. Maskeleri resimdeki bölgeleri olarak 0, 1, 2 kodlanmış... RGB etiketleri penceresi etiketlerinde sıraya göre. Maske farklı Etiketler tasarlanmıştır için kaydettiğiniz zaman maske adı mask.tif (tamamlayıcı şekil 9C) ile video olarak aynı dosya adıyla: çubuğunda dosya seçin menü ve Seç Farklı Kaydet | TIFF....
      Not: Seçili maskeleri Difüzyon katsayıları hesaplanması ve sınıflandırılması (bkz. Adım 4.2) yörüngeleri istihdam edilecektir.
  8. Şu anda dosya yapısı aşağıda olup olmadığını kontrol edin:
    VideoName/video.lif
    VideoName/Seri1/mask.tif
    VideoName/Seri1/ videoSeq / video0000.tif
    VideoName/Seri1/ videoSeq / video0001.tif
    ...
    VideoName/Seri1/ videoSeq / video0499.tif
    VideoName/Seri1/sonuçlar
    Not: Mask.tif adımları 2.4 ve 2.7 tasarlandığı gibi maskeli bir görüntüdür. Video*.tiff video adım 2,6 kaydedilen gibidir. Yukarıda da belirtildiği gibi adları kalın olarak yukarıdaki listede sabit, yani, onlar çünkü komut dosyaları tarafından aranan isimler bunlar bu şekilde çağrılacak. Adlarında değil kalın deneme gerçekleştirilen yansıtacak şekilde değiştirebilirsiniz.

3. izleme parçacıklar

  1. U-parça kullanarak seçili filmlerinde görülen tüm parçacıklar izlemek.
  2. Matlab açıp U-track dizin yolunu yolu kullanarak ekleyebilirsiniz | Eklemek menüsünde alt klasörleri seçeneği ile. Gelecekte infaz Matlab U-parça olması yolundaki yolunu kaydedin. Bu yol ayarı yalnızca bir kez yapılması gerekir.
  3. Çalışma dizini analiz edilecek serisi içeren dizini değiştirin. U-parça içinde konsol (tamamlayıcı şekil 10) movieSelectorGUI yazarak çağırmak ve enter tuşuna basın. Film seçimi penceresi olacak (tamamlayıcı şekil 11A) açıldı.
  4. Yeni film butonuna basın ve film baskı pencere-ecek gözükmek (tamamlayıcı şekil 11B).
  5. Kanal Ekle (VideoName/Seri1/video) video ile dizin seçin ve film bilgileri parametreleri doldurmak için tuşuna basın. Belgili tanımlık verim müdür için U-track sonuçlarını sonuçlar için (videoName/Seri1/sonuçları) ayarlayın.
    Not: Film bilgi parametreleri mikroskop ve edinme koşulları elde edilebilir.
  6. Üzerinde Gelişmiş kanal ayarları düğmesine basın ve satın alma için ilgili parametreleri doldurun. Parametrelerin değerlerini (tamamlayıcı şekil 11C) örneğe.
  7. Gelişmiş kanal ayarları penceresinde kaydetmek ve film baskı penceresinde Kaydet tuşuna basın. Program ve sonuçları dizininde movieData.mat adlı dosyaya yazma onay isteyecektir. Onaylayın.
  8. Film oluşturduktan sonra Continue (devam) film Seçimi penceresi basın. U-track nesne türü hakkında çözümlenmesi için soracaktır. Tek-parçacıklar (tamamlayıcı şekil 12) seçin. Denetim Masası penceresi (tamamlayıcı şekil 13A) görünür.
    1. İlk adım seçin Adım 1: algılama ve ayartuşuna basın. Ayar Gauss karışım modeli uygun pencere-ecek gözükmek (tamamlayıcı şekil 13B). Örnekte, "Yerel arka plan ile karşılaştırma için alfa değeri" 3 (ek şekil 13B) 0,001 ve "Rolling-pencere saat ortalama" için ayarlanır.
    2. Uygula Ayarları Gauss karışım modeli uygun penceresinde ve Denetim Masası'nda çalıştırın basarsınız. Tamamlayıcı şekil 13yapılandırmada ile sadece algılama adım çalıştırır. Bu adımı birkaç (2-5) dakika sürer. Sonuçları (algılama, tamamlayıcı Şekil 14) adım 1 sonuç düğmesine basarak denetleyebilirsiniz.
      Not: Yukarıda gösterildiği gibi film kırmızı daireler algılanan parçacıklar gösterir. Kırmızı bir daire gösteriliyorsa, o zaman bu adımı doğru çalıştı değil.
  9. Parça, diğer bir deyişle, birleştirme alanına birden çok kare parça içine önceki adımda tespit parçacıklar tanımlaması gerçekleştirin. Bu Adım 2: izleme U-parça ayarlarını Tamamlayıcı şekil 15A-Ciçinde gösterildiği gibi tanımlanması gerekiyor. Örneğin kare kare bağlama ve boşluğu kapatma, birleştirme ve bölme için adım 2 maliyet işlev ayarları ek şekil 15B ve C, sırasıyla gösterilir.
  10. Adım 2 için parametreleri ayarlamanın sonra Denetim Masası ' ndaki basın çalıştırmak ve yalnızca adım 2 (tamamlayıcı şekil 16) çalışır.
  11. İzleme çözümlemesi, adım 3. Ayarlarýný da tamamlayıcı şekil 17 ' (doğru kapı aynası) gösterildiği gibi. Sonra Uygula ayarı-hareket analiz ve kontrol paneli-U-Track çalıştırmak panelinde tuşuna basın. Bu adımı birkaç saniye sürer.
  12. Adım 3 sonuç düğmesi ile işlemi doğru bir şekilde tüm parçalar belirlemiştir doğrulayın. Bunu yaparken, parça numarasını göster film seçenekleri penceresinin üzerinde tıklatın ve kare kare her parça oldu doğru (tamamlayıcı Şekil 18) tespit denetleyin. El ile gerçek parçacıklar değildir bu parçacıklar açıklama ekleyin.
    Not: Bu manuel seçim yapılmazsa, difüzyon katsayısı (bkz. Adım 4) hesaplandığında zayıf bir otomatik seçim daha sonra gerçekleştirilebilir.

4. Difüzyon katsayıları ve yörüngeler sınıflandırılması hesaplanması

  1. Tüm komut dosyalarını (örneğin, VideoName/Serie1) analiz ediliyor video Directory'den çağrılır emin olun.
  2. MATLAB'de veren tarafından Difüzyon katsayıları konsol komutu hesaplamak için tüm yörüngeleri okuyun: 0,1 saniye arasında iki ardışık kareyi (panel film gösterilen zaman aralığını, zamanında nerede trajectories=readTrajectories(0.1), Bilgi, tamamlayıcı şekil 11B).
  3. Hatalı belirlendi noktalar/yörüngeleri için karşılık gelen yörüngeler hariç. Dışlamak için noktalar bir listesini verebilir. Örneğin, 4, 5 ve 28 noktalar dışlamak için yazın: yörüngeleri readTrajectories (0,1, [4, 5, 28]) =.
  4. Bu hücrenin parçaların her biri için anlık Difüzyon katsayıları hesaplayın. Bu durumda, bir süre gecikme Difüzyon katsayısını hesaplar = 4, D1-4denir. Bunu yapmak, Matlab konsol koşmak belgili tanımlık buyurmak: D calculateDiffusion = (yörüngeler, 113.88e-3, 0.0015, 'Alfa') yörüngeleri adım 3'te, 113.88e elde edilen yörüngeleri nerede-3 mikron elde edilen görüntülerde piksel boyutunu, 0.0015 bir üst sınır Difüzyon katsayıları hareketsiz parçacıkların µm2/s, 'Alfa' ölçtüğü için aşağıda açıklandığı gibi donanımlı modelidir.
    Not: Bir daha hızlı kamera ve ihtiyaç kullanırken Difüzyon parametre hesaplamak için daha fazla kare, örneğin 20'ye, tarafından artırmak D calculateDiffusion = (yörüngeler, 113.88e-3, 0.0015, 'Alfa', '', 20). Dize parametresi 20, yukarıdaki, önce '', çıktı dosyasına eklenen sonek. Bu soneki farklı analizler ayırt etmek için kullanılabilir.
  5. MSD farklı bir işlevi ile daha bir farklı uygun modu ('sınırlı', 'ücretsiz' veya 'Yönetmen') ile calculateDiffusion işlevini çağırarak uygun. Örneğin, 'sınırlı': D calculateDiffusion = (yörüngeler, 113.88e-3, 0.0015, 'sınırlı').
  6. Yönlendirilmiş modeli için uygun sonuçlar elde etmek gibi ek şekil 20' de gösterilen.
  7. Yörüngeler kısa ve uzun yörüngeleri ayrıştırmak. Komutunu kullanın: [shortTrajectories, longTrajectories]=separateTrajectoriesByLength(trajectories,50) 50 (gösterilen uzun örnekte) dikkate alınması gereken bir yörünge en az uzunluğunu çerçevelerinde nerede.
  8. Kısa yörüngeleri adım 4,3 açıklanan aynı uygun yordamı kullanarak çalışma: D calculateDiffusion = (shortTrajectories, 113.88e-3, 'Yönetmen', 0.0015, 'Kısa'). Kısa ve anormal yörüngeleri komutu ile analiz: D calculateDiffusion = (shortTrajectories, 113.88e-3, 0.0015, 'Alfa', 'Kısa').
  9. Onların an ölçekleme spektrum (MSS)7üzerinden hareket türünü sınıflandırmak için uzun yörüngeleri analiz. Komut: trajectoriesClassification classifyLongTrajectories = (longTrajectories, 113.88e-3,0.0015, 'uzun') analizi ekranda gösterir ve trajectoryClassification < sonek > .txt adlı bir dosya oluşturur dizin results\TrackingPackage\tracks.

5. küme Ssize parçacık yoğunluğu üzerinden hesaplanması

Not: Tüm komut dosyalarını (örnek gösterilen, VideoName/Serie1) analiz ediliyor video Directory'den çağrılır emin olun.

  1. Onların yörünge boyunca her parçacık yoğunluğunu analiz. Bunu yapmak, komut dosyasını çağırmak Matlab konsol yazarak: U-track ilk bölümünde tarafından hesaplanan yörüngeleri giriş olarak alır analyzeSpotIntensities. En basit haliyle, sadece herhangi bir bağımsız değişken olmadan komut dosyası (gösterilen, VideoName/Seri1 örnekte) analiz ediliyor video Directory'den çağrı analyzeSpotIntensities(). Bağımsız değişkenler komut dosyasında olarak için sağlayarak çok farklı şekillerde bu temel davranışını yapılandırın: analyzeSpotIntensities ('Arg1´, Değer1, ' Arg2´, değer2,...). Karşılık gelen değişken değerleriyle birlikte geçerli argümanlar ('ArgN´, deðerN) listelenir.
    1. ('spotRadius´, 1)
      SpotRadius karşılık gelen boyut 3 x 3 noktada ((2*spotRadius+1)x(2*spotRadius+1)). merkezli bir yama 1 piksel (varsayılan olarak) kullanarak floresan yoğunluğu analiz
      Not: 5 x 5 noktada merkezli bir yama için bir spotRadius seçin 2, vs.
    2. ('onlyInitialTrajectories´, 1)
      (True, 1 değeri) bu bağımsız değişken belirtilmezse, yalnızca videonun ilk karesi başlatmak yörüngeleri analiz. Bu denetim görüntüler (varsayılan olarak 0, false) çözümlemek yararlıdır.
    3. ('trackTrajectory´, 0)
      Bu bağımsız değişken 0 (yanlış) olarak ayarlarsanız, noktanın koordinatı tüm çerçeveleri (hareketsiz noktalar için kullanışlıdır) için ilk çerçevesi içinde tutun. Bağımsız değişken 1'e (varsayılan 1, doğru) olarak ayarlarsanız, noktanın koordinatlarını hesapladım birlikte video aşağıdaki U-track tarafından izlenir.
    4. ('excludeTrajectories´, [4,5,28])
      Adım 4,3 (örnekte 4, 5, 28) hariç bu yörüngeler yörünge sayısını içerir.
    5. ('extendTrajectory ´, 1)
      Bu değer 1 (doğru) ayarlarsanız, videonun sonunda yama yoğunluğu (yörünge daha önce bıraksa bile) kadar analiz edin. (TrackTrajectory yanlış olması durumunda) noktanın koordinatı yörünge (trackTrajectory doğruysa) son koordinatıyla veya yörünge ilk koordinatıyla değil. Bu bağımsız değişken ise false (0) varsayılan olarak.
    6. ('subtractBackground´, 1)
      Bu parametre ayarlanmışsa, o zaman doğru ham Floresans her noktada orayı (aşağıya bakın) için arka plan Floresans tahmininin tarafından ölçüldü. Bu bağımsız değişken ise, varsayılan olarak true (1).
    7. ('meanLength´, çerçeve numarası)
      Bu parametre ayarlanmışsa, ortalama yoğunluğu nokta Belirtilen uzunluğun ölçülür. 'MeanLength', 20 ilk 20 kare ortalama nokta yoğunluğunu ölçmek için ayarlayın. Bağımsız değişkeni ayarlarsanız, nokta yoğunluğu bütün yörünge (varsayılan olarak, tam uzunlukta) hesaplanır.
    8. ('showIntensityProfiles´, 1)
      Bu parametre yanı sıra kendi arka plan farklı çerçeveler boyunca yoğunluk profil çizmek için (varsayılan olarak 0, false), 1 ayarlayın.
      Not: Bu araziler tamamlayıcı şekil 21' de gösterilen photobleaching tanımlamak çok yararlıdır. Photobleaching oldu mümkünse her yolu için rutin otomatik olarak analiz eder. Bu ilk ve son N Çerçeveler yol boyunca öğrenci'nin t ile yoğunluk değerleri karşılaştırarak yapılır. Varsayılan olarak, N 10, ama bu değer bağımsız değişkeni değiştirilebilir ' Nbleach´.
    9. ('backgroundMethod´, değer)
      Her spot arka plan belirlemek için bu parametreyi ayarlayın. Bu çeşitli şekillerde yapılabilir ve hangisinin kullanılacağını seçili değişen "değeri" olabilir:
      1. ('backgroundMethod´, 0)
        Arka planı tüm video için el ile belirlemek için bu değeri kullanın. 8 puan video ilk karesini seçmek için izin verir. Bu noktalar etrafında bir yama tüm video analiz edilir ve bu yoğunluklarını % 95 parametreli tüm noktalar için arka plan yoğunluk olarak seçilir.
      2. ('backgroundMethod´, 1)
        Her çerçeve için arka planı el ile belirlemek için bu değeri kullanın. Her yer ve her çerçeve için 8 puan seçin. Bu zaman alıcı bir görev ama kontrolü bir çok kullanıcıya verir. Bu yamaları yoğunluklarını % 95 parametreli bu noktada bu çerçevedeki arka plan yoğunluk olarak seçilir.
      3. ('backgroundMethod´, 2)
        Her spot arka plan hesaplamak için bu değeri tahmini 8 nokta etrafında bağımsız değişkeni tarafından kontrollü bir RADIUS ile yer alan dairesel puan üzerinden kullanımı ' backgroundRadius´ (varsayılan olarak, 4 * spotRadius).
      4. ('backgroundMethod´, 3)
        Tarafından ilk hücrenin video bulmak ve her çerçevede (tamamlayıcı şekil 22) hücreye yoğunluklarda analiz her çerçeve için arka plan hesaplamak için bu değeri kullanın.
        Not: Arka plan gri değeri belirli bir parametreli Bu dağılım, olarak seçilir (varsayılan olarak 0.5 (= % 50), her ne kadar bu parametre bağımsız değişkeni denetlenebilir ' backgroundPercentile´, bu değer ayarlanabilir daha yüksek, örneğin, 0,9 (= %90) hücrenin arka plan olarak dikkate alınması gereken isteyen varsa. Hücre kimliği yardımcı olmak için hangi bağımsız değişken kullanarak çerçeveler beklenen en fazla arka plan değeri belirtmek ' maxBackground´ (örneğin, içinde tüm analiz videoları, arka plan değeri normalde hiç gider 6000)13. Varsayılan olarak, bu seçenek 0 bu yardım varsayılan olarak kullanılmaz anlamı, ayarlanır. Hücre algılama ve arka plan tahmini için bağımsız değişkeni ayarlayarak seçili alanı olan görmek ' showImages´ 1 (Durdur CTRL-C tuşlarına basarak istediğiniz zaman yürütme).
  2. Adımları 4 ve 5. 1, sırasıyla, kullanarak gatherDiffusion.AndIntensity () hesaplanan yörüngeleri Difüzyon ve yoğunluğu bilgi toplamak. Sadece kısa yörüngeleri Difüzyon ve yoğunluğu bilgi toplamak. Bunu yapmak, adım 4.7 ve türü kullanılan soneklerini kullanan: gatherDiffusionAndIntensity ('Short´) nerede ' Short´ olduğunu adım 4.7 içinde kullanılan soneki.
  3. An spektrum ölçekleme ve yoğunluk InformationBy yazarak toplamak: nereye 'Uzun' soneki kullanılır adım 4.7 gatherTrajectoryClassificationAndIntensity('Long') . Bu iletişim kuralı kullanılarak oluşturulan tüm dosyaların Şekil 2' de görüntülenir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu Protokolü'nün kullanılmasına Floresans mikroskobu film ve dinamik özellikleri analiz tespit parçacıklar otomatik izleme sağlar. Başlangıçta, hücreleri izlenmesi gereken fluorescently birleştiğinde protein ile transfected. SPT (şekil 1) sıralama hücre tarafından elde edilir sağlar hücre yüzeyi reseptörleri uygun seviyede sunuyor. Seçili hücrelerin bu Protokolü (tamamlayıcı Video 1) açıklanan araçları ile okudu bir biçimde videolar oluşturur...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Açıklanan yöntemi bile Matlab ile çalışan herhangi bir önceki deneyimi kalmadan gerçekleştirmek kolaydır. Ancak, Matlab rutinleri son derece farklı komutlar isimlendirme ve program tarafından istihdam farklı klasörler lokalizasyonu ile doğruluk gerektirir. İzleme çözümlemesi rutin (Adım 3), birden çok parametre değiştirilebilir. "Ayarı Gauss karışım modeli uygun" pencere (Adım 3.8) U-parça videoda tek parçacıkların nasıl algılar denetler. Bu3' te açıklandığı gibi bir Gauss karışım modeli yaklaştır...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Biz Carlo Manzo ve Maria García Parajo Difüzyon katsayısı analiz onların yardım ve kaynak kodu için müteşekkiriz. Bu eser kısmen İspanyol bilim Bakanlığı, yenilik ve üniversiteler (SAF 2017-82940-R) gelen hibe tarafından desteklenen ve Instituto de salud Carlos III (RD12/0009/009 ve RD16/0012/0006; RETICS programı RIER). LMM ve JV Fundación genel CSIC COMFUTURO program tarafından desteklenir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
İnsan Jurkat hücreleriATCCCRL-10915İnsan T hücre hattı. Bu yazılım
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)Clontech632469ile farklı floresan proteinleri takip edilebilir ve analiz edilebilir
;BioRad Jurkat hücreleri için 280 V, 975 mF kullanıyoruz. Elinizde en iyi çalışan transfeksiyon yöntemini kullanın.
Cytomics FC 500 akış sitometresi Beckman Coulter
MoFlo Astrios Hücre Sıralayıcısı Beckman CoulterTransfeksiyon seviyesine bağlı olarak, hücre sıralaması gerekli olmayabilir. Ayrıca, ilgilenilen reseptörün yeterli seviyelerinin kararlı ifadesine sahip hücreleri de kullanabilirsiniz.
Dako QifikitDakoCytomationK0078Hücre yüzeyindeki reseptörlerin sayısını ölçmek için kullanılır.
Cam alt mikro kuyu tabaklarıMatTek corporationP35G-1.5-10-C
Plazmadan İnsan FibronektiniSigma-AldrichF0895
Rekombinant insan CXCL12PeproTech300928A
Ters Leica TIRFLeica
EM-CCD kameraAndor DU 885-CSO-#10-VP
MATLABMathWorks, Natick, MA
U-Track2 yazılımıDanuser Laboratuvarı
ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/
FiJiFiJIhttps://imagej.net/Fiji)
u-Track2 yazılımıMatlab aracı.  Yüklemek için web sayfasından (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) .zip dosya indirin ve dosyayı seçtiğiniz bir dizinde açın
GraphPad PrismGraphPad yazılımı
ile başka herhangi bir hücre tipi analiz edilebilir DNA3GFP Bu rutin Gen Nabız X Hücre elektroporatörü

Kaynaklar

  1. Yu, J. Single-molecule studies in live cells. Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).
  2. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).
  3. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  4. Bakker, G. J., et al. Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).
  5. Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).
  6. Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. Strongly and weakly self-similar diffusion. Physica D. 154, 111-137 (2001).
  7. Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).
  8. Ewers, H., et al. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).
  9. Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights. Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601(2015).
  10. Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).
  11. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Martinez-Munoz, L., et al. Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function. Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).
  14. Destainville, N., Salome, L. Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments. Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Tek Molekül İzlemeParçacık İzlemeDifüzyon AnaliziKüme Boyutu Analiziİlgi AlanıMaske TasarımıFiji ImageJMATLAB Rutinleri
Görüntü membran reseptörleri Floresans mikroskobu tarafından küme boyutunu ve Difüzyon analizi için protokol işleme
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.