Bu protokol, organ yapısında değişiklik olmadan lenf düğümlerini boşaltmada farklı hücre popülasyonlarını görüntüleyen bir tekniği tanımlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Ex-Vivo Konfokal Mikroskopi ile Lenf Nodal Yapısı nın Ve Hücresel Lokalizasyonun Görselleştirilmesi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Lenf düğümleri (LNs) organlar vücuda yayılmış, doğuştan gelen bağışıklık yanıtları adaptif bağışıklık ile bağlayabilirsiniz nerede. Aslında, LNs stratejik lenfdamarların yolunda interposed, LN tüm yerleşik bağışıklık hücreleri ile doku antijenleri samimi temas sağlayan. Böylece, hücresel kompozisyon, dağılım, yer ve etkileşim ex vivo bütün LN görüntüleme kullanarak anlamak vücudun yerel ve sistemik bağışıklık yanıtları koordine nasıl bilgi katacak. Bu protokol, geleneksel konfokal mikroskoplar ve stok reaktifleri kullanılarak çok tekrarlanabilir ve kolay bir metodoloji sağlayan floresan etiketli antikorların in vivo uygulamasının ardından bir ex vivo görüntüleme stratejisi göstermektedir. Antikorların deri altı enjeksiyonu ile, geleneksel immünoreskans mikroskobu tekniği ile potansiyel olarak zarar görebilir doku yapılarını etkilemeden, nn'lerin boşaltılmasında farklı hücre popülasyonlarının etiketedilmesi mümkündür.
Giriş
Lenf düğümleri (LNs) doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık yanıtları köprü önemli işlevi ile vücutta yaygın olarak mevcut oval şekilli organlardır. NNs yabancı parçacıklar ve kanserli hücreleri tanımlamak için onlara karşı bir bağışıklık yanıtı monte etmek için lenf filtre1. Antijen sunan hücreler (AAP' ler), T hücreleri ve B hücreleri yabancı parçacıkları ve kanserli hücreleri ortadan kaldırmak için antijene özgü antikorlar (humoral bağışıklık) ve sitotoksik lenfositler (hücresel bağışıklık) oluşturmak için birlikte çalışır2. Böylece, lenfatik sistemde mevcut bağışıklık hücrelerinin dinamikleri anlamak aşı gelişimi ve ka....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Protokol Harvard Tıp Fakültesi Hayvanlar Daimi Komitesi ve Brigham ve Kadın Hastanesi, protokol 2016N000230 tarafından onaylandı.
1. Deney için kullanılan fareler
- Antikor karışımı nı yönetmek için B6 arka planında 8 haftalık erkek ve dişi fareler kullanın.
- Ex vivo bütün LN görüntülemenin muhabir farelere antikor karışımı uygulanmadan uygulanıp uygulanamayacağını belirlemek ve antijen ibraz da dahil olmak üzere mononükleer hücrelerin varlığını araştırmak için CX3CR1GFP1 GFP/WTCCR2RFP/WT farelerini kullanın hücreler ve fagositler ve LN'deki dağılımları.
NOT: CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu el yazması, bu organlardaki belirli hücre popülasyonlarını lekelemek için floresan etiketli antikorların enjeksiyonundan sonra yapılarına zarar vermeden inguinal ve popliteal lenf düğümlerini çıkarma tekniklerini göstermektedir (Şekil1 ve Şekil 2 ).
BV421 anti-CD4 ve BB515 anti-CD19 ve konfokal görüntüleme analizi ile LN hücrelerinin immünetiketleme güçlü kombinasyonu inguinal ve popliteal NNs T hücrelerinin lokalizasyonu tanımlana.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Moleküler biyoloji ve yüksek boyutlu immünofenotiotipleme de dahil olmak üzere diğer teknikler ile görüntüleme kombinasyonu kendi doğal bağlamda bağışıklık hücrelerini araştırmak için yeteneğimizi geliştirdi. Aslında, diğer yaklaşımlar doku sindirimi ve hücre izolasyonu gerektirebilir iken - doku bütünlüğünün kaybına yol açabilir - in vivo veya ex vivo görüntüleme kullanımı coğrafi bir şekilde farklı hücre alt tipleri araştırmada büyük bir avantaj sağlar3 , 16. H.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma NIH (R01 AI43458 - H.L.W.) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| BV421 anti-CD4 | BD Horizon | 562891 | GK1.5; 0.2 mg mL < sup>-1< / sup> |
| BB515 anti-CD19 | BD Horizon | 564509 | 1D3; 0.2 mg mL < sup>-1< / sup> |
| BB515 Sıçan IgG2a, κ İzotip Kontrolü | BD Horizon | 564418 | R35-95; 0.2 mg mL-1< / sup> |
| BV421 Fare IgG2b, K İzotip Kontrolü | BD Horizon | 562603 | R35-38 0.2 mg mL-1 |
| Cellview kültür kabı | Greiner-Bio | 627861 | 35x10 mm cam tabanlı |
| İnsülin şırıngaları | BD Plastipak-İnsülin | U-100 | |
| Kimwipes | Kimtech Bilim Markası | 7557 | boyut 21 x 20 cm / kutu başına 100 yaprak |
| Mikrocerrahi kavisli forseps | WEP Cerrahi Aletler | özel yapım | 12,5 cm |
| Mikrocerrahi kavisli makas | WEP Cerrahi Aletler | özel yapım | 11,5 cm |
| İğne | BD PrecisionGlide-30 | ölçer ve süreler; ½ inç | |
| Nikon Eclipse Te + A1R konfokal kafa | Nikon | - | ana 4 lazer çizgisi (405, 488, 543 ve 647 nm) ile yüklü |
| PE anti-F4 / 80 | BD Pharmigen | 565410 | T45-2342; 0.2 mg mL < sup>-1< / sup |
| >PE Sıçan IgG2a, & kappa; İzotip Kontrolü | BD Pharmigen | 553930 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| Zeiss LSM 710 konfokal mikroskop | Ana 4 lazer çizgisi (405, 488, 543 ve 647 nm) ile | Zeiss |
Kaynaklar
- Willard-Mack, C. L. Normal structure, function, and histology of lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).
- Tas, J. M., et al. Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers. Science. 351, 1048-1054 (2016).
- David, B. A....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
