Method Article

Ex-Vivo Konfokal Mikroskopi ile Lenf Nodal Yapısı nın Ve Hücresel Lokalizasyonun Görselleştirilmesi

DOI:

10.3791/59335

⸱

August 9th, 2019

 ,  ,  , 
1Ann Romney Center for Neurologic Diseases, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Center for Gastrointestinal Biology, Federal University of Minas Gerais

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, organ yapısında değişiklik olmadan lenf düğümlerini boşaltmada farklı hücre popülasyonlarını görüntüleyen bir tekniği tanımlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lenf düğümleri (LNs) organlar vücuda yayılmış, doğuştan gelen bağışıklık yanıtları adaptif bağışıklık ile bağlayabilirsiniz nerede. Aslında, LNs stratejik lenfdamarların yolunda interposed, LN tüm yerleşik bağışıklık hücreleri ile doku antijenleri samimi temas sağlayan. Böylece, hücresel kompozisyon, dağılım, yer ve etkileşim ex vivo bütün LN görüntüleme kullanarak anlamak vücudun yerel ve sistemik bağışıklık yanıtları koordine nasıl bilgi katacak. Bu protokol, geleneksel konfokal mikroskoplar ve stok reaktifleri kullanılarak çok tekrarlanabilir ve kolay bir metodoloji sağlayan floresan etiketli antikorların in vivo uygulamasının ardından bir ex vivo görüntüleme stratejisi göstermektedir. Antikorların deri altı enjeksiyonu ile, geleneksel immünoreskans mikroskobu tekniği ile potansiyel olarak zarar görebilir doku yapılarını etkilemeden, nn'lerin boşaltılmasında farklı hücre popülasyonlarının etiketedilmesi mümkündür.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lenf düğümleri (LNs) doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık yanıtları köprü önemli işlevi ile vücutta yaygın olarak mevcut oval şekilli organlardır. NNs yabancı parçacıklar ve kanserli hücreleri tanımlamak için onlara karşı bir bağışıklık yanıtı monte etmek için lenf filtre1. Antijen sunan hücreler (AAP' ler), T hücreleri ve B hücreleri yabancı parçacıkları ve kanserli hücreleri ortadan kaldırmak için antijene özgü antikorlar (humoral bağışıklık) ve sitotoksik lenfositler (hücresel bağışıklık) oluşturmak için birlikte çalışır2. Böylece, lenfatik sistemde mevcut bağışıklık hücrelerinin dinamikleri anlamak aşı gelişimi ve ka....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol Harvard Tıp Fakültesi Hayvanlar Daimi Komitesi ve Brigham ve Kadın Hastanesi, protokol 2016N000230 tarafından onaylandı.

1. Deney için kullanılan fareler

  1. Antikor karışımı nı yönetmek için B6 arka planında 8 haftalık erkek ve dişi fareler kullanın.
  2. Ex vivo bütün LN görüntülemenin muhabir farelere antikor karışımı uygulanmadan uygulanıp uygulanamayacağını belirlemek ve antijen ibraz da dahil olmak üzere mononükleer hücrelerin varlığını araştırmak için CX3CR1GFP1 GFP/WTCCR2RFP/WT farelerini kullanın hücreler ve fagositler ve LN'deki dağılımları.
    NOT: CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu el yazması, bu organlardaki belirli hücre popülasyonlarını lekelemek için floresan etiketli antikorların enjeksiyonundan sonra yapılarına zarar vermeden inguinal ve popliteal lenf düğümlerini çıkarma tekniklerini göstermektedir (Şekil1 ve Şekil 2 ).

BV421 anti-CD4 ve BB515 anti-CD19 ve konfokal görüntüleme analizi ile LN hücrelerinin immünetiketleme güçlü kombinasyonu inguinal ve popliteal NNs T hücrelerinin lokalizasyonu tanımlana.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Moleküler biyoloji ve yüksek boyutlu immünofenotiotipleme de dahil olmak üzere diğer teknikler ile görüntüleme kombinasyonu kendi doğal bağlamda bağışıklık hücrelerini araştırmak için yeteneğimizi geliştirdi. Aslında, diğer yaklaşımlar doku sindirimi ve hücre izolasyonu gerektirebilir iken - doku bütünlüğünün kaybına yol açabilir - in vivo veya ex vivo görüntüleme kullanımı coğrafi bir şekilde farklı hücre alt tipleri araştırmada büyük bir avantaj sağlar3 , 16. H.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma NIH (R01 AI43458 - H.L.W.) tarafından desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BV421 anti-CD4BD Horizon562891GK1.5; 0.2 mg mL < sup>-1< / sup>
BB515 anti-CD19BD Horizon5645091D3; 0.2 mg mL < sup>-1< / sup>
BB515 Sıçan IgG2a, κ İzotip KontrolüBD Horizon564418R35-95; 0.2 mg mL-1< / sup>
BV421 Fare IgG2b, K İzotip KontrolüBD Horizon562603R35-38 0.2 mg mL-1
Cellview kültür kabıGreiner-Bio62786135x10 mm cam tabanlı
İnsülin şırıngalarıBD Plastipak-İnsülinU-100
KimwipesKimtech Bilim Markası7557boyut 21 x 20 cm / kutu başına 100 yaprak
Mikrocerrahi kavisli forsepsWEP Cerrahi Aletlerözel yapım12,5 cm
Mikrocerrahi kavisli makasWEP Cerrahi Aletlerözel yapım11,5 cm
İğneBD PrecisionGlide-30ölçer ve süreler; ½ inç
Nikon Eclipse Te + A1R konfokal kafaNikon-ana 4 lazer çizgisi (405, 488, 543 ve 647 nm) ile yüklü
PE anti-F4 / 80BD Pharmigen565410T45-2342; 0.2 mg mL < sup>-1< / sup
>PE Sıçan IgG2a, & kappa; İzotip KontrolüBD Pharmigen553930R35-95; 0.2 mg mL-1
Zeiss LSM 710 konfokal mikroskopAna 4 lazer çizgisi (405, 488, 543 ve 647 nm) ileZeiss
yüklü

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Willard-Mack, C. L. Normal structure, function, and histology of lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).
  2. Tas, J. M., et al. Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers. Science. 351, 1048-1054 (2016).
  3. David, B. A....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lymph Node ImagingEx Vivo Confocal MicroscopyFluorescent Antibody LabelingCellular LocalizationT Cell B Cell VisualizationLymph Node Structure AnalysisSubcutaneous Antibody InjectionMicrosurgery Lymph Node HarvestConfocal Microscopy ImagingImmunolabeling Analysis

Related Articles