Bir In vitro 3D model ve hesaplamalı boru hattı PSC-türetilen endotel progenitors Vazculogenik potansiyelini ölçmek için

Özet

İndüklenen pluripotent kök hücrelerinden (IPSC-EPs) elde edilen endotel progenatörler, kardiyovasküler hastalık tedavilerinin devrimleştirilmesi ve daha sadık kardiyovasküler hastalık modellerinin oluşturulmasını sağlamak için potansiyele sahiptir. Burada, üç boyutlu (3D) kollajen mikroortamlarda IPSC-EPs kapsülleme ve bu hücrelerin vasculogenik potansiyelinin nicel Analizi açıklanmıştır.

Özet

İndüklenen pluripotent kök hücreleri (iPSCs), herhangi bir somatik hücre tipine ayırt edilebilir bir hastaya özgü, proliferatif hücre kaynağıdır. Olgun, fonksiyonel damar montajı için gerekli hücre türlerine ayırt edilebilir bipotent endotel ataları (EPS), embriyonik ve indüklenen pluripotent kök hücrelerden elde edilmiştir. Ancak bu hücreler, üç boyutlu ortamlarda titizlikle değerlendirilmemiştir ve vasculogenik potansiyelinin nicel bir ölçüsüdür zor kalır. Burada, floresan-aktif hücre sıralama yoluyla IPSC-EPs üretimi ve yalıtım ilk özetlenmiştir, kollajen Hidrojeller içinde IPSC-EPs kapsülleme ve kültürün bir açıklamasını izledi. Bu hücre dışı matris (ECM)-mikroortamı taklit etmek, sağlam bir vasculogenik tepkisi teşvik eder; Kültür bir hafta sonra vasküler ağlar formu. Bu vasculogenik yanıtı ölçmek için açık kaynaklı yazılım kullanan bir hesaplama boru hattı oluşturulması belirlendi. Bu boru hattı özellikle dalların sayısını, dallanma noktalarını ve minimum kullanıcı girişine sahip toplam ağ uzunluğunu belirlemek için kılcal plekpların 3D mimarisini korumak için tasarlanmıştır.

Giriş

İnsan göbek ven endotel hücreleri (huvecs) ve diğer primer endotel hücre tipleri iki yıldır kan damar çimlenme ve geliştirme in vitro¹model için kullanılmıştır. Bu tür vasküler platformlar kardiyovasküler hastalığın moleküler ve doku seviyesi mekanizmalarını aydınlatmaya söz verir ve ilkel vasküler ağlar^2,3' ün gelişmesine fizyolojik anlayış sunabilir. Vasküler modelleme alanı önemli gelişmeler tanık olmasına rağmen, niceliksel olarak model ve fizyolojik vasküler gelişimi değerlendirmek olabilir bir "altın standart" tahlil zor kalır. En çok yayınlanan protokoller, Olgun, fonksiyonel kan damarlarının oluşumunu teşvik etmek için damar niş veya niceliksel olarak değerlendirilen hücre türlerinin vasculogenik potansiyelini üç boyutta karşılaştırmak için bir yöntem yok yeterli özetlemek yok ( 3D).

Birçok mevcut damar modelleri fizyolojik vasküler niş taklit yeteneğini sınırlıdır. En sık kullanılan in vitro platformlardan biri jelatinli protein karışımı bazlı tüp oluşumu tahlil olduğunu. Kısaca, huvecs, murine sarkomu ekstrellüler matrisinden (ECM) hasat edilen proteinlerden oluşan ince bir jel katmanında tek hücreler olarak toplanır; bir ila iki gün içinde, HUVECs kendi kendine ilkel tüpler içine monte⁴. Ancak, bu süreç iki boyutlu oluşur (2D) ve endotel hücreleri (ECs) bu tahlil içinde kullanılan kapalı formu yok, boş lümen, böylece bu çalışmaların fizyolojik önemini sınırlandırmak. Daha yakın zamanda, ECS ve destekleyici hücreler (örn., mezenkimal kök hücreler (MSCS) ve perikayt), yerel ECM 'nin fibröz mimarisini simüle eden, kollajen veya fibrin hidrojellerin⁵gibi 3D mikro ortamlarda ortak kültürlü olmuştur. Bu mikroortamda vasküler gelişimi modellemek için, ECs ile kaplı polimerik boncuk genellikle⁶istihdam edilmektedir. Eksojen büyüme faktörleri ve/veya büyüme faktörleri interstitially hidrojel gömülü diğer hücreler tarafından salgılanan ek ECS, kaplama polimerik boncuklar, filiz ve tek lümen oluşturmak için; lahanası ve damarların sayısı ve çapı daha sonra hesaplanabilir. Ancak, bu lahanası tekil ve fizyolojik koşullarda görülen ve böylece daha fazla bir tümör damar modeli anımsatan bir kapalı, bağlı ağ oluşturmayın. Mikrofluidik cihazlar da vasküler niş taklit ve ak-yüklü Hidrojeller^7,8damar oluşumunu teşvik etmek için kullanılmıştır. Genellikle, bir anjiyojenik büyüme faktörü-gradyan ak göç ve sprouting teşvik etmek için dolaşım hücre kültür ortamına uygulanır. Geliştirilen damarların lümeni oluşturan ECs, mikrofluidik cihazla sıvı akışının uygulanması ile indüklenen kesme stresine duyarlıdır; Bu nedenle, bu mikrofluidik cihazlar statik modellerde erişilmeyen anahtar fizyolojik parametreleri yakalar. Ancak, bu cihazlar pahalı mikroimalat yetenekleri gerektirir.

En önemlisi, üç vasküler model (2D, 3D, microfluidic), birincil ECs 'nin yanı sıra primer destek hücresi tiplerini de ezici bir şekilde kullanır. Hücreler implantasyon üzerine bağışıklık tepkisi doğuracak çünkü Primer hücreler etkili bir kardiyovasküler tedavi haline olamaz; Ayrıca, HUVECs ve benzer primer hücre tipleri hasta spesifik değildir ve genetik bir eğilim veya önceden mevcut sağlık koşulları, örneğin, diabetes mellitus olan hastalarda meydana Vasküler anomaliler yakalamak değil. İndüklenen pluripotent kök hücreler (iPSCs) insan vücudunda tüm somatik hücrelere ayırt edilebilir bir hasta spesifik, proliferatif hücre kaynağı olarak son on yıl içinde ortaya çıkmıştır⁹. Özellikle, protokollerin oluşturulması ve IPSC-türetilen endotel ataları (IPSC-EPS)^10,11; IPSC-EPs bipotent ve olabilir, bu nedenle, daha fazla endotel hücreleri ve pürüzsüz Kas hücreleri/perikayt, Olgun, fonksiyonel damar yapı taşları ayırt edilebilir. Sadece bir çalışma, bir 3D mikro¹²' de IPSC-EPS ' d a k i primer kapiller plekpmanın gelişimini inandırıcı bir şekilde ayrıntılıdır; Bu çalışma, IPSC-EP montajının ve doğal ve sentetik hidrojellerin farklılaşması açısından kritik öneme sahip olsa da, elde edilen damardaki ağ topolojilerini niceliksel olarak karşılaştırmadı. Başka bir son çalışma huvecs ve IPSC-türetilen ECS⁵çimlenme karşılaştırmak için polimerik boncuk modeli kullandı. Bu nedenle, 3D mikro ortamlarda IPSC-EP vaskülojenez düzenleyen fiziksel ve kimyasal sinyalizasyon mekanizmaları daha fazla aydınlatmak ve bu hücrelerin iskemik tedavi ve kardiyovasküler hastalık için uygun olup olmadığını belirlemek için net bir ihtiyaç vardır Modelleme.

Son on yıl içinde, vasküler ağ uzunluğunu ve bağlantısını ölçmek ve karşılaştırmak için farklı açık kaynaklı Hesaplamalı boru hatları ve çerçeve yapısı çıkarma algoritmaları geliştirilmiştir. Örneğin, charwat et al. bir fibrin matriks^13,14, Adipose türetilen kök hücreleri ve büyüme ECS bir Co-kültürü türetilen vasküler ağlar süzülmüş, binarized görüntü ayıklamak için bir Photoshop tabanlı boru hattı geliştirdi. Belki de en yaygın olarak kullanılan topoloji karşılaştırma aracı AngioTool, Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından online yayınlanan bir program¹⁵; programın yaygın kabulü ve iyi belgelenmiş sadakat rağmen, program iki boyut ve diğer programlar, AngioSys ve Wimasis de dahil olmak üzere gemi benzeri yapıları analiz sınırlıdır, pay aynı dimensionality sınırlama¹⁶. Imaris, Lucis ve MetaMorph gibi güçlü yazılım paketleri, mühendislik microvasculature ağ topolojisini analiz etmek için geliştirilmiştir; Ancak, bu süitler en akademik laboratuvarlar için maliyet-yasaktır ve kaynak koduna erişimi sınırlamak, hangi Son Kullanıcı yeteneğini kendi özel uygulama algoritması özelleştirmek için engel olabilir. 3D dilimleyici, bir açık kaynak manyetik rezonans görüntüleme/bilgisayarlı tomografi paketi, etkili 3D vasküler ağlar topolojisi analiz edebilir bir vasküler modelleme Toolkit içerir¹⁷; Ancak, analiz Kullanıcı el ile büyük bir veri kümesi analiz ederken sıkıcı hale gelebilir ve kullanıcının bilinçaltı önyargıları tarafından etkilenebilir ağın son noktaları yerleştirerek bağlıdır. Bu yazıda, 3D vasküler ağları ölçebilir bir hesaplama boru hattı ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Yukarıdaki özetlenen sınırlamaları aşmak için, bu açık kaynak hesaplama boru hattı, 3B hacmi bir iskelet analizörüne yüklemek için elde edilen Konfokal görüntüleri önceden işlemek için ımagej kullanır. İskelet analizörü, paralel bir medial eksen inceltme algoritması kullanır ve aslen Kerschnitzki ve Al tarafından geliştirilmiştir. osteosit ağlarının uzunluğunu ve bağlantısını analiz etmek¹⁸; Bu algoritma, mühendislik microvasculature uzunluğu ve bağlantı karakterize etmek için etkili bir şekilde uygulanabilir.

Tamamen, bu protokol 3D mikroortamlarda mikrovasküler ağlar oluşturulmasını özetliyor ve kolayca IPSC-EPs vasculogenik potansiyelini karşılaştırmak için bir açık kaynak ve Kullanıcı-önyargı ücretsiz hesaplama boru hattı sağlar.

Protokol

1. Kültür Medya ve kaplama çözümlerinin hazırlanması

1. Vitronektin kaplama çözeltisi hazırlamak için, Dulbecco fosfat-tampon tuz (DPBS) içinde seyreltmeli vitronektin 1:100.
   DIKKAT: seyreltilmiş bir kez, bu çözümün gelecekteki kullanım için depolanmasý önerilmez.
2. Fenol kırmızı-ücretsiz aldıktan sonra, büyüme faktörü-azaltılmış jelatinli protein karışımı (bkz . malzeme tablosu) üreticiden, buz üzerinde çözülür 4 ° c karışımı şeffaf ve sıvı kadar. Karışımı bir laminar akış kaputu içinde buz üzerinde tutarak, pipet 75 μL karışımı bir 1,8 mL mikrosantrifüjü tüp içine ve donma-20 °C hemen. Bu plakaya bir yıl kadar depolanabilir.
   DIKKAT: Bu jelatinli protein karışımı, oda sıcaklığında tutulur ve yüksek sıcaklıklarda katkı sağlayacak kadar viskoz olur. Bu çözümü buz gibi tut.
3. Kaplama için bu karışımı hazırlamak için, buz üzerinde bir 75 μL kısım çözüyor ve 6 ml buz-soğuk Dulbecco modifiye kartal orta ile seyreltmeli: besin karışımı F-12 (dmem/F12). Bu hazırlanmış hacim bir 12 iyi plaka kat yeterlidir.
4. Hazırlamak bir 100 mg/ml hisse senedi çözeltisi askorbik asit magnezyum-2-fosfat (beyaz liyofilize toz) ultra saf suda ekleyerek 500 mg toz 5 ml su 10 ml cam scintite şişe. Çözelti tamamen saydamlaşana kadar bir karıştırma çubuğu ile karıştırma (Bu bir saate kadar sürebilir). Bu çözüm, bir yıla kadar-20 °C ' de depolanabilir.
5. 15 mL konik santrifüj tüpünde 1,9928 mL dimetil sülfoxid (DMSO) içinde 10 mg likofilize toz çözünerek 10 mM 'Lik CHIR99021 (CHıR) stoğu oluşturun ve çözüm saydamlaşıncaya kadar 37 °C ' lik boncuk (veya su) banyosundan ısının. Aliquot Into 1,8 mL mikrosantrifüjü tüpler ve mağaza-20 °C bir yıla kadar.
6. 15 mL konik Santrifüjlü tüpte 3,1225 mL dimetil sülfoxid (DMSO) içinde 10 mg likofilize toz çözünerek, bir ROCK inhibitörü (ROCKi), 10 mM Y-27632 stok oluşturmak ve bir 37 °C boncuk (veya su) banyo kadar sıcak çözüm saydamdır. Aliquot Into 1,8 mL mikrosantrifüjü tüpler ve mağaza-20 °C bir yıla kadar.
7. Essential 8 (E8) orta hazırlamak için, dondurulmuş takviyeleri çözüyor, 500 mL şişe bazal orta ekleyin ve filtre sterilize. Bu çözüm iki haftaya kadar 4 °C ' de depolanabilir.
   DIKKAT: Orta formülasyonda bulunan proteinlerin uzun süreli kullanımda düşmesine neden olduğu için, 37 °C ' de bu ortamı ısıtmak çok önemlidir. Bunun yerine, bu ortamı kullanmadan önce 15 ila 30 dakika oda sıcaklığında tutun.
8. Sıralama arabelleği hazırlamak için 1,33 mL 7,5% Sığır serum albümin (BSA) DPBS ve 200 μL, 0,5 mM etilen asit (EDTA) için 48,5% BSA ve 2 mM EDTA son bir çözüm oluşturmak için DPBS.
9. LaSR basal hazırlamak için, 300 μL 100 mg/mL askorbik asit magnezyum-2-fosfat ve 5 mL GlutaMAX için 500 mL gelişmiş DMEM/F12 ekleyin. Bu çözüm bir aya kadar 4 °C ' de depolanabilir.
10. Endotel hücre büyüme orta-2 hazırlamak için (EGM-2), çözülme takviyeleri ve eklemek 500 mL şişe bazal orta. Bu çözüm bir aya kadar 4 °C ' de depolanabilir.
11. Engelleme arabelleğini hazırlamak için 500 mg liyofilize Sığır serum albümin (BSA) ve 50 μL 'yi (bkz. malzeme tablosu), 48 ml 'ye kadar dpbs 'e ekleyin. BSA 'nın çözümden daha sonra ayırmadığından emin olmak için 37 °C ' de en az 15 dakika boyunca inküye yapın.

2. ıpscs 'nin çözülme, bakım ve geçiş işlemleri

1. Bir kriokonservirovannogo IPSC şişesini çözmeden önce, 1 ml vitronektin çözeltisi ile 6-kuyu plakasının tek bir kuyusu (adım 1,1 ' de açıklandığı şekilde hazırlanmıştır). Oda sıcaklığında bir h için inkübe. Plakaya E8 orta eklemeden önce bu kaplama havası kuru izin vermeyin.
2. Ipscs çözme için, sıvı nitrojen depolama konteynerinden ıpscs bir kriokonservirovannogo şişe almak ve 37 °c ' de küçük bir buz kristal kalır kadar çözülür. Dikkatle (dropwise) bir 15 mL konik Santrifüjlü tüp 8 mL buz soğuk DMEM/F12 içeren çözülmüş şişenin içeriğini aktarmak. Çözünmüş şişenin bir ilavesi ile yıkayın 1 mL buz-soğuk DMEM/F12 hücre kaybını en aza indirmek için. 300 x g'de 5 dakika Santrifüjü.
3. Santrifüjü beklerken, vitronektin çözeltisi Aspire ve 1 ml E8 Orta (adım 1,6 ' de açıklandığı gibi hazırlanmış) kuyu için ekleyin. Sonra, santrifüji konik tüpten dmem/F12 süpernatant kaldırmak ve 1 ml E8 orta Pelet yeniden askıya. Yeni kaplanmış plakaya hücreleri aktarın, kolonileri tohumlama üzerine küpten önlemek için süspansiyonu karıştırmaktan emin olun.
4. Çözmekten sonra genellikle önemli hücre ölümü vardır. Ertesi sabah, orta çıkarın ve taze E8 orta ile değiştirin.
   Not: en uygun koşullar altında bile, ıpscs ağoprezervasyon kötü kurtarma eğilimindedir. Bir yakın konfluent 6-iyi bir tek 6 içine gelecek tohumlama için cryopreserve için tavsiye edilir-iyi. Hücre enkaz varlığı hücre kurtarma sırasında ilk 2-3 gün için normaldir.
5. E8 orta günlük olarak hücreler paslanmaya hazır olana kadar değiştirin (% 70 –% 80 konflukans).
6. Önce vitronektin kaplı kuyuları hazırlayın (2,1. adımda açıklandığı gibi).
   1. Vitronectin kaplı kuyular hazır olduğunda (yaklaşık 1 saat), 1 ml dpbs ile iki kez geçmeli ve yıkanır E8 orta Aspire. 37 °C ' de 5 – 7 dakika için 1 mL 0,5 mM EDTA ile inküye yapın. Kulyenlerken, vitronektin çözeltisi yeni kaplanmış kuyunda çıkarın ve 1 – 2 mL E8 orta ile değiştirin.
   2. EDTA çözümünü kuyulardan çıkarın ve 1 mL E8 ile bir veya iki kez yavaşça yıkamak suretiyle kolonileri ayırın. 75-200 μL hücre süspansiyonunu yeni kaplı E8 içeren kuyulara aktarın, hatta kapsama alanı sağlamak için plakayı karıştırın ve hemen kuluçsa yerleştirin.
      DIKKAT: IPSC dekolmanı için kuluçka süresi hücre çizgisinin bağımlıdır; Bu protokol kullanıcısının, alınan/oluşturulan bir IPSC satırını yeterince genişleterek bir dizi kez sınamaları önerilir. 75 Cell süspansiyonunun μL genellikle geçimleri arasında 4 gün içinde sonuçlanır; 150 μL veya daha fazla yol geçimleri arasında 2 – 3 gün arasında olur.

3. IPSC türevi endotel progenatörler üretimi (Şekil 1).

1. IPhone 'ları korurken kolonilerin iyi sıkıştırılmasından ve kültürde düşük sayıda diferif hücrelerin olduğundan emin olun. Koloniler birbirleriyle temasa başlayırsa, hücreler büyük olasılıkla çok konfluent ve hemen paslanmış olması gerekir.
2. Ipscs% 70 –% 80 konfluent olduğunda, jelatinli protein karışımı (1.2/1.3 'de açıklandığı gibi hazırlanmış) ile 24 kuyu plakasını kat. Pipet 250 Bu karışımı μL 'ye her bir kuyunda yerleştirin ve oda sıcaklığında 1 saat tutun.
3. Yukarıdaki 1-h inkübasyon sırasında, E8 orta ve Y-27632 sırasıyla buzdolabında ve dondurucudan çıkarın. E8 orta ve Y-27632 oda sıcaklığına ulaştığında, 15 mL konik santrifüj tüpte 13 μL 10 μM Y-27632-13 mL E8 ekleyerek E8 + ROCKi hazırlayın.
4. E8 ortamını IPSC kuyularından çıkarın, 1 mL DPBS ile iki kez yıkayın ve 37 °C ' de 5-7 dk için 0,5 mM EDTA ile inküye yapın. Kuluçka döneminden sonra, EDTA 'yı çıkarın ve hücreleri 1 mL E8 + ROCKi orta olan P1000 pipet ucu ile tek hücreli bir süspansiyona hızlıca kesiniz.
5. Bir hemokytometer ile hücreleri saymak. Milyonlarca ıpscs içeren bir askıya alma için 20 μL hücre süspansiyonu 180 μL tripan mavi ekleyin. Tek hücreli süspansiyon toplam hücrelerin sayısını belirleyin.
6. 0,432 x 10⁶ -1,296 x 10⁶ hücre (10⁴ -3 x 10⁴ hücreler/cm²) için kalan E8 + rocki ortamına aktarın. Yeni kaplı 12-kuyu plakadan jelatinli karışım kaplamasını çıkarın ve her bir kuyu için hücre süspansiyon 500 μL ekleyin, hücrelerin iyi dağıtılmış ve küçük kümeleri oluşturmayın sağlamak.
   Not: Bu yoğunluk aralığı CD34 pozitif hücrelerin farklılaşması için idealdir; Ancak, bu tohumlama yoğunlukları hücre hattına bağımlıdır ve bu protokol kullanıcısı tarafından optimize edilmesi gerekebilir.
7. Kültür 24 h sonra, 500 μL taze E8 orta ile orta değiştirin. Aynı koşullar altında ek bir 24 h için inkübe.
8. E8 ortamını çıkarın ve 6-12 μM CHIR99021 ile tamamlayıcı LaSR bazal ile değiştirin. Bu zaman noktası, farklılaşma D0 olarak tanımlanır. Kültür 24 h sonra aynı hücre kültürü ortamı ile değiştirin.
   Not: daha önce açıklandığı gibi, bu ortama eklenen CHIR99021 miktarı kullanılan IPSC satırına bağlı olacaktır. En iyi sonuçları sağlamak için lütfen bir dizi CHIR99021 konsantrasyonunu test edin.
9. CHIR99021 ile inkübasyon 48 h sonra, 1 mL LaSR basal ile değiştirin.
10. 2-3 ek gün için 2 mL LaSR basal ile orta günlük değiştirin. Bu zaman noktasında (D5 farklılaşma), bu hücrelerin önemli bir kısmı CD34 ifade edecek ve endotel progenatörler olarak karakterize edilebilir. Bu protokol şeması Şekil 1 ' de temsili sonuçlar ile özetlenmiştir ve ilk olarak bu yöntemi ^11,19yayımlanan müfettişlerin tam olarak açıklanmıştır.
    Not: Bu endotel progenatörler bir endotel soy (% 35 –% 99) boyunca daha fazla farklılaşabilir veya pürüzsüz bir kas soy (1%-65%). Farklılaşma verimliliği ECM kaplamasının tipine ve farklılaşma sırasında kullanılan hücre kültürü ortamına göre farklılık gösterir ²⁰.

4. endotel progenatörler FACS

1. D5/D6 farklılaşmış hücreleri ayırmadan önce 1,8 adımda açıklandığı gibi sıralama arabelleği hazırlayın ve buz üzerinde tutun.
2. 37 °C ' de 10 dakika boyunca (bkz. malzeme tablosu) 250 μL hücre dekolmanı çözeltisi ile farklılaşmış hücreleri kulbe etme.
3. Hücreleri bir P1000 pipet ucu ile hücre dekolmanı çözümünde tek bir hücre süspansiyonu içine ayırmak. 15 mL konik Santrifüjlü tüpte hücre hücresi dekolmanı çözeltisi karışımını konsolide et ve 300 x g'de 5 dakika santrifüjle.
4. 200 μL 'de süpernatant ve pelletini 'i buz-soğuk sıralama tamponunu çıkarın (1,7 adımda açıklandığı şekilde hazırlanır. Hücre sıralama tampon süspansiyon için konsantre CD34-PE antikor 5 μL ekleyin ve 4 °C ' de 10 dakika boyunca inkübe.
5. 5 mL buz soğuk sıralama arabelleğinde yeniden askıya alın. Bu süspansiyonu, Sıralayıcı üzerine yerleştirmeden önce 40 μm kap ile bir hücre süzgeci ile filtreleyin.
6. Uygun floresan kanalda, bir floresan antikor ile etiketlenmemiş hücreleri sıralamak 10.000. Bu 10.000 hücrelerden hiçbirini içermeyen yüksek floresan yoğunlukta bir bölgeyi kapın (Şekil 1D). Bu negatif bir kontrol olarak hizmet verecektir.
7. Floresan çözeltisi ile etiketlenmiş IPSC-EPs içeren örneği çalıştırın ve sıralamayı başlar. CD34 son derece bu endotel ataları ifade edilir ve kolayca ana nüfusu ayrılır. Sıralamadan sonra, solüsyonu 15 mL konik Santrifüjlü tüpe aktarın ve 300 x g'de 5 dakika santrifüjün. Süpernatant çıkarın.
   Not: çözüm bir mikrosantrifüj tüpten daha büyük bir tüpte ise (örn., birçok FACs protokollerinde yaygın olarak kullanılan 5 mL polistiren tüpü), sıralı hücre Pelet değerini 1 mL 'Lik sıralama arabelleğinde yeniden askıya alın ve bu çözümü bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 300 x g 'de santrifüjün 5 dakika ve supernatant çıkarın.
   1. İsteğe bağlı: daha fazla IPSC-EP karakterizasyonu istenirse, CD34-PE ile aynı anda diğer primer antikorları (örn. CD31-APC) ekleyin. Farklı floresan kanallar arasındaki çapraz taramanin minimize edilmesini sağlayın.

5. IPSC-EP-yüklü kollajen Hidrojeller kapsülleme ve uzun vadeli kültür

1. 40 mL mikrosantrifüjte 10 μM Y-27632 ve buz üzerinde yer tüpü ile tamamlayıcı olarak, endotel büyüme ortamının (EGM-2)% 10X orta 199 1,8-400 μL 'yi ekleyerek tohumlama ortamını hazırlayın.
   Not: kök hücre kültürü ve farklılaşan hücrelerin bakımı için antibiyotik kullanımı önerilmez, ancak sıralama ortamında sterilitesi garanti etmek zor olduğundan, kalem/strep ile dozlama tavsiye edilir (Bu daha Eğer Sıralayıcı birçok laboratuar arasında paylaşıldığında) zorunludur.
2. Hücre süspansiyon tüm süpernatant çıkarın ve 10 μM Y-27632 ile tamamlayıcı 200 μL EGM-2 ekleyin. Hücre süspansiyonu orta tohumlama ve şiddetle karıştırın aktarın.
3. 5,2 adımda hazırlanan çözüme 350 μL kollajen ekleyin ve iyi karıştırın. Çözüm soluk sarı olacak.
   Not: kollajen son konsantrasyon kılcal pleksakın oluşumu üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Bu protokol, kollajen 10 mg/mL ve Hidrojeller 3,5 mg/mL son konsantrasyonuna sahip olduğunu varsayar. Son kollajen konsantrasyonlarını elde etmek için bu birimleri ayarlayın; Son kollajen konsantrasyonu sınırlamak için tavsiye edilir 2 mg/mL için 4 mg/mL.
4. 5,3 yılında hazırlanan çözüm için 1M NaOH 5 μL ekleyin ve iyi karıştırın, hava kabarcıkları giriş kaçınarak. Çözüm parlak pembe olacak.
5. Pipet 56 bir 96-iyi Ultra-düşük ek U-Bottom hücre kültürü plaka bireysel kuyuları içine 5,4 hazırlanmış nötralize kollajen hücre çözeltisi μL. 37 °C ' de 30 dakika boyunca inkübe Medya eklemeden önce, hücrelerin bir aydınlık alan mikroskop ile örnekleri inceleyerek eşit olarak dağıtıldığından emin olun.
6. 10 μM Y-27632 ve 50 ng/mL vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) ile takviye edilen EGM-2 ' d e k i 1 mL kültür ortamı hazırlayın ve her bir mikrosantrifüj tüpüne 1 μL her stok çözeltisi ekleyerek. İyi karıştırıldıktan sonra, bu hücre kültürü ortamının pipet 100 μL 'sini hücre yüklü hidrojellerin üzerine takın. Uzun süreli kültür için plaka 37 °C ' ye aktarın.
7. Kültür ortamını günlük olarak değiştirin, çalışma amacı ile dikte edildiği gibi ek anjiyojenik büyüme faktörleri veya küçük molekül inhibitörleri ekleme. En iyi şekilde medya kaldırmak için, plaka eğim ve yavaşça hidrojel rahatsız etmeden orta Aspire için bir P100 ipucu kullanın.

6. EP bazlı vasküler ağlar sabitleme, immünosterleme ve görselleştirme

1. Bir hafta kültürden sonra 48-kuyu plakasına 250 μL% 4 civarında formaldehite (PFA) çözeltisi ekleyin. Hidrojeller gibi birçok kuyu doldurun. Hidrojeller (PFA) orta çıkarın ve kuyu içeren PFA Hidrojeller aktarmak için ince uçlu cımbız kullanın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inküye yapın ve PBS ile hızla yıkayarak PFA 'yı çıkarın.
2. % 0,5 Noniyonik bir yüzey (bkz. malzeme tablosu) Oda sıcaklığında 5 dk 250 μL ekleyerek geçirgen. 300 mM gcine ile tamamlayıcı 250 μL PBS ile iki kez yıkayın. Aşırı deterjanın kaldırılmasını sağlamak için her bir yıkama adımı için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inküye yapın. 250 içinde hydrojels daldırarak blok 30 dakika tampon engelleme μL.
3. 4 °C ' de bir gecede engelleyici tamponda seyreltilmiş istenilen primer antikorlarla inküye yapın. Örneğin, phalloidin ve ve-cadherin ile immünosta, seyreltmeli 1:40 ve 1:200, sırasıyla engelleyici tampon.
4. Ertesi gün, birincil antikor solüsyonu çıkarın ve DPBS 'de% 0,5 Emülsiyonlama reaktif ile iki kez yıkayın. Alüminyum folyo ile kapak ve türe özgü ikincil antikor ile inkük (örn., 1:200 Alexa Fluor 488 PBS) Oda sıcaklığında 2 saat için.
5. İkincil antikor çözümünü çıkarın ve DPBS 'de% 0,5 Emülsiyonlama reaktif ile iki kez yıkayın. Ücretsiz fluorophorerlerin kaldırılmasını sağlamak için her bir yıkama adımında oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inküye yapın.
6. Hücre çekirdekleri görselleştirmek için, seyreltilebilir 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPı) 1:10000 PBS ve örnek (ler) ekleyin.
   1. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca kulbirer atın ve PBS ile iki kez yıkayın. Ücretsiz fluorophorerlerin kaldırılmasını sağlamak için her bir yıkama adımında oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inküye yapın.
7. Numuneleri anjiyogenez μ-Slide veya ince uçlu cımbız kullanarak cam alt Petri tabağı ile aktarın. Hidrojel altında hiç hava kabarcığı olmadığından emin olun.
8. Örnek üst alta genişletmek z-yığınları elde ederek bir Konfokal mikroskop üzerinde görüntü. Dedektörün doymamış olduğundan ve mevcut en düşük büyütmeyle kullanıldığından emin olun (büyük bir görüş alanı arzu edilir).
   Not: gelecekteki işleme Için z-yığınları en az sıkıştırma (örn. czi) ile kaydedildiğinden emin olun.

7. vasküler ağ topolojilerini analiz etmek ve karşılaştırmak için hesaplama ardışık düzenini kullanma

1. Dilimlerin yalnızca gemiler içerdiğinden emin olmak için her z yığınını inceleyin. Imagej 'de z yığınını açın ve görüntü > Ayarla > Parlaklık/kontrastseçeneğini tıklatarak kontrastı geliştirin. Gemi sınırları artık açıkça sınırlanmış ve arka plan seviyesi minimize edilmiştir. Genellikle, z-ölçümlendirmeler x/y boyutlarıyla eşleşmiyor. Bunu düzeltmek için, resim > Ayarla > boyutunu tıklatın ve her dilim arasındaki mesafeyi x/y 'de bir piksele eşdeğerdir böylece z-Slice sayısını değiştirin. ımagej otomatik olarak enterpolasyon olacaktır. Bu adım düzgün gerçekleştirilmezse, son 3B birimler sıkıştırılmış görünür.
   DIKKAT: ECs jel kenarlarına doğru göç edecek ve küçük Arnavut kaldırımlı koloniler oluşturacak. Bunlar hidrojel sınırlarını tahmin etmek yararlı olmakla birlikte, onlar son görüntü analizi ile müdahale edecek ve silinmesi gerekir.
   Not: ımagej, Ulusal Sağlık Enstitüleri ve optik ve hesaplamalı enstrümantasyon Laboratuvarı tarafından konser olarak geliştirilen Java tabanlı açık kaynak görüntü analiz yazılımıdır. Bu sadece ımagej yararlı eklentileri (https://fiji.sc/) ile birlikte Fiji, indirmek için tavsiye edilir.
2. Imagej 'de, 3 boyutlu tıklama işlemi > filtreleri ≫ Gaussian Blur 3D 'de görüntüyü bulanıklaştırın ve ardından tüm 3 boyutlardaki Sigma değerlerini 2,0 olarak ayarlayarak (Bu değerin Son Kullanıcı tarafından ayarlanması gerekebilir).
3. Imagej 'de, işlem > Ikili > ikili yap 'ı tıklatın ve ardından uygun bir eşik algoritması seçin. Li ve ark. tarafından geliştirilen Cross-entropi eşik algoritması, gemiler arka planda²¹ayıran etkilidir. Her görüntünün eşiğini hesaplayın ve arka planı "varsayılan" olarak ayarlayın.
4. Imagej 'de, sahte gürültüyü kaldırın ve işlem ≫ paraziti > kesintileri kaldır'ı tıklatarak lümen içindeki "delikleri" doldurun.
   Not: "parlak" aykırı değerleri çıkarmak bağlı gemilerin küçük deliklerinde doldurulacaktır; "karanlık" kesintileri kaldırmak ölü hücreleri kaldıracaktır. Kaldırma yarıçapı büyüklüğü damarların büyütme ve boyutuna göre farklılık gösterecektir. 512 x 512 piksel olan geniş alan hedefiyle elde edilen görüntüler için, yarıçaplı genellikle 4-6 pikselden değişir.
5. İşlem tüm ham (örn., CZI uzantısı) dosyaları ve adım 7,6 geçmeden önce. tif dosyalarına dönüştürmek. Bu işleme yardımcı olmak için, bir ımagej Script, "Binarize ve Filter. IJM" Bu makale eklenmiş.
6. İşlenmiş. tif dosyaları "BatchProcessSkeleton. m" dosyası ile aynı klasörde kaydedin, makalede indirebilirsiniz. Yazarlar tarafından geliştirilen bu script, Phillip Kollmannsberger²² tarafından yayınlanan fonksiyonları çağırır ve bazı ek dosya manipülasyon yürütmektedir.
7. İndirin ve iki ana fonksiyonları "Skel2Graph3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43527-skel2graph-3d) ve "Skeleton3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43400-skeleton3d) ile ilişkili tüm dosyaları unzip. Tüm işlevleri, açılmış işlenen z yığınıyla aynı klasöre kaydedin.
8. Çoklu paradigma sayısal bilgi işlem ortamını açın ( malzeme tablosunabakın) ve yukarıda açıklanan tüm dosyaların kaydedildiği klasöre gidin.
9. "BatchProcessSkeleton. m" komut penceresine batchprocessskeleton yazarak veya komut dosyasını açıp Çalıştır düğmesini (sağ bakan yeşil ok) düzenleyicide basarak çalıştırın.
   Not: tek bir komutla büyük bir veri kümesini çözümlemek Için, satır 6 ' da dir işlevinin içindeki dizenin bir yıldız işareti (örn. ' *. tif ') içerdiğinden emin olun. Aksi takdirde, tek bir dosyanın çözümlemesi istenirse yıldız işaretini dosya adıyla değiştirin.
10. Bu komut dosyası yürütmek için alacak süreyi önemli ölçüde kullanılabilir bilgi işlem gücüne göre değişir. Bu analiz en az 8 GB RAM ile bir bilgisayarda yürütmek için tavsiye edilir, böylece kullanıcı komut dosyası çalışırken diğer programlara erişebilir.
    Dikkat: kesinlikle gerekli değilken, orijinal Konfokal satın alma (gri) grafik ve iskelet matriks (kırmızı) ile bu görüntü matris ile overdöşeme çerçeve yapısı çıkarma algoritması performansını değerlendirmek yardımcı olabilir. Ayrıca, okuyucu bir nodal grafik oluşturabilirsiniz, Kollmannsberger ve Al tarafından uygulanan gibi., ağ analizinin doğruluğunu değerlendirmek için. Her iki grafik oluşturma, yararlı iken, önemli ölçüde komut dosyası çalışma süresini artırır ve ek bellek gerektirir; Kullanıcı sadece son topoloji Analizi gerektirir ve veri kümesini görselleştirmek istemiyorsanız, sadece 61 (iskelet grafiği) ve çizgiler 104 için 143 (topoloji grafik) 44 satırları dışarı yorum.
11. Tamamlandığında, veri Matrix, görünür Workspace, şimdi işlenen verileri içerir. Verileri çift tıklatın ve bu hücreyi değişken düzenleyicide açın.
    1. Bu matris, soldan sağa: 1) dosya adı, 2) düğüm sayısı (Şube noktaları + bitiş noktaları), 3) şube noktaları, 4) bağlantılar (örneğin, gemiler), 5) ağ uzunluğu (yalıtma gemiler dahil) ve 6) z-yığınında bulunan dilim sayısını içerecektir unutmayın. Bu verileri bir. csv dosyası olarak kaydedin ve istediğiniz herhangi bir yazılım için daha fazla analiz için dışa aktarın.

Sonuçlar

Farklılaşma sonra (Şekil 1), FACS ve kollajen Hidrojeller Içinde IPSC-EPS kapsülleme, hücreler genellikle yuvarlanacak kalır 24 saat önce göç ve form ilk lümen başlamak için. Yaklaşık 6 gün sonra kültür, ilkel bir kılcal plekbe görünür olacak hidrojel aydınlık alan mikroskobu ile görünürken (Şekil 2). Bir Konfokal mikroskop üzerinde sabit, lekeli hücre yüklü hidrojellerin görüntüleme sonra (Film 1, ek film 1), ön...

Tartışma

Bu protokol, üç hücre kültürü ortamındaki hücrelerin uzun vadeli kültürünü içerir: E8, LaSR basal ve EGM-2. Bu nedenle, tüm malzemeleri uygun sterilize etmek için büyük bir özen yapılmalıdır. Laboratuvarın laminar akış kaputunda çalışırken Ayrıca, laboratuar Mont ve etanol temizlenmiş eldiven her zaman giyilmelidir. Sık Mikoplazma kontaminasyonu için test edilmesi tavsiye edilir; IPSC kültürü sırasında büyük miktarda enkaz gözlenirse veya farklılaşma verimliliğinde ani bir düşüş varsa, Mikoplazma kontaminasyonu muhtemel ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
µ-Slide Angiogenesis	Ibidi	N/A	Yan duvarlı düz, cam tabanlı bir doku kültürü plakası, kolay konfokal görüntülemeyi mümkün kılar
96 kuyulu, yuvarlak tabanlı, ultra düşük bağlantılı mikroplaka, steril	Corning	7007	Hücre yüklü kollajen hidrojellerin hücre kültürü kabına bağlanmasını önler
Accutase	STEMCELL Technologies	7920	Nazik hücre ayırma çözeltisi; FACS Advanced
DMEM/F12	Thermo Scientific	12634010	iPSC-EP farklılaşması için temel ortamdır.
Barnstead GenPure xCAD Plus	Thermo Fisher Scientific	50136165	Su arıtma sistemi; diğerleri kolayca ikame edilebilir
Sığır Serumu Albümin çözeltisi, DPBS'de% 7.5, steril filtreli, BioXtra, hücre kültürü için uygun	Fisher Scientific	A8412	FAC'ler CD34-PE'yi sıralarken hücre canlılığını korumak için
, insan (klon: AC136)	Miltenyi Biotec	130-098-140	iPSC-EP'lerin
FAC izolasyonu için kullanılan antikorCHIR99021	LC Laboratuvarları	C-6556	Pluripotent kök hücrelerden mezoderm oluşumunu indükler
Kollajen I Sıçan Kuyruğu Yüksek Protein 100 mg	VWR	354249	3D mikro ortamın ana bileşeni
Konik santrifüj tüpleri (15/50 mL)	Fisher Scientific	14-959-49D/A	Nispeten büyük hacimli reaktifleri ve hücre kültürü ortamını
depolamak ve karıştırmak için kullanılırDAPI (4 ',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroklorür)	Thermo Fisher Scientific	D1306	Hücre çekirdeklerini lekelemek ve görselleştirmek için
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11320-082	Matrigel'in seyreltilmesi ve pluripotent kök hücrelerin çözülmesi için
Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS)	ThermoFisher	14190-250	Tek katmanlı kültürleri yıkamak için
EDTA	Sigma-Aldrich	E8008	Pluripotent kök hücre kolonilerinin pasajı ve FAC'ler sıralanırken hücre agregasyonunu önlemek için
Endotel Hücre Büyüme Ortamı 2	PromoCell	C-22011	Endotel hücre canlılığını ve proliferasyonunu destekler
Esansiyel 8 Orta Thermo	Fisher Scientific	A1517001	Pluripotent kök hücrelerin bakımı için
Glisin, BioUltra, moleküler biyoloji için, >=%99.0 (NT)	Sigma-Aldrich	50046	Kalan deterjanı nötralize eder
L-Askorbik asit 2-fosfat seskimagnezyum tuzu hidrat, >=%95	Sigma-Aldrich	A8960	iPSC-EP farklılaşma ortamının bileşeni
MATLAB	MathWorks	1.8.0_152	Çok paradigmalı sayısal hesaplama ortamı (çoğu akademik kurumda ücretsiz olarak mevcuttur)
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (jelatinimsi protein karışımı)	Fisher Scientific	356231	iPSC-EP farklılaşması için plakaları kaplamak üzere DMEM/F12 içinde seyreltilmiş
Medium-199 10X	Thermo Fisher Scientific	1825015	Nihai hidrojel ozmolaritesini ve pH'ı dengelemek için kullanılır
Mikrosantrifüj tüpleri (1.7 mL)	VWR	87003-294	Küçük hacimli reaktifleri depolar
Fosfat tamponlu salin (PBS)	Sigma-Aldrich	P3813	İmmün boyama solüsyonlarının ana bileşeni
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122	FACS cihazından olası kontaminasyonu gidermek için sınıflandırmadan sonra kullanılan antibiyotik
Rekombinant İnsan VEGF 165 Protein R	& D Systems	293-VE	Endotel hücre proliferasyonunu ve tubulogenezi uyaran mitojen
Rhodamine phalloidin	Themo Fisher Scientific	R415	F-aktin birikimini tanımlamak ve dolayısıyla vasküler ağların sınırlarını ana hatlarıyla belirtmek için
Triton X-100 (noniyonik yüzey aktif madde)	Sigma-Aldrich	X-100	Hücreleri nazikçe geçirgen hale getirmek için kullanılan deterjan
Tween-20 (emülsifiye edici reaktif)	Fisher Scientific	BP337	Eklenen antikorların bağlanma özgüllüğünü arttırır
VE-Cadherin (F-8)	Santa Cruz Biotechnology	sc-9989	Kollajen hidrojellerdeki 3D endotel lümenini tanımlamak için
Vitronectin	ThermoFisher	A14700	Pluripotent kök hücrelerin bakımı için
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	Ayrıştığında ve yeniden tohumlandığında pluripotent kök hücre ve iPSC-EP canlılığını korur