Method Article

Bir In vitro 3D model ve hesaplamalı boru hattı PSC-türetilen endotel progenitors Vazculogenik potansiyelini ölçmek için

DOI:

10.3791/59342

⸱

May 13th, 2019

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Texas at Austin

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İndüklenen pluripotent kök hücrelerinden (IPSC-EPs) elde edilen endotel progenatörler, kardiyovasküler hastalık tedavilerinin devrimleştirilmesi ve daha sadık kardiyovasküler hastalık modellerinin oluşturulmasını sağlamak için potansiyele sahiptir. Burada, üç boyutlu (3D) kollajen mikroortamlarda IPSC-EPs kapsülleme ve bu hücrelerin vasculogenik potansiyelinin nicel Analizi açıklanmıştır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İndüklenen pluripotent kök hücreleri (iPSCs), herhangi bir somatik hücre tipine ayırt edilebilir bir hastaya özgü, proliferatif hücre kaynağıdır. Olgun, fonksiyonel damar montajı için gerekli hücre türlerine ayırt edilebilir bipotent endotel ataları (EPS), embriyonik ve indüklenen pluripotent kök hücrelerden elde edilmiştir. Ancak bu hücreler, üç boyutlu ortamlarda titizlikle değerlendirilmemiştir ve vasculogenik potansiyelinin nicel bir ölçüsüdür zor kalır. Burada, floresan-aktif hücre sıralama yoluyla IPSC-EPs üretimi ve yalıtım ilk özetlenmiştir, kollajen Hidrojeller içinde IPSC-EPs kapsülleme ve kültürün bir açıklamasını izledi. Bu hücre dışı matris (ECM)-mikroortamı taklit etmek, sağlam bir vasculogenik tepkisi teşvik eder; Kültür bir hafta sonra vasküler ağlar formu. Bu vasculogenik yanıtı ölçmek için açık kaynaklı yazılım kullanan bir hesaplama boru hattı oluşturulması belirlendi. Bu boru hattı özellikle dalların sayısını, dallanma noktalarını ve minimum kullanıcı girişine sahip toplam ağ uzunluğunu belirlemek için kılcal plekpların 3D mimarisini korumak için tasarlanmıştır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan göbek ven endotel hücreleri (huvecs) ve diğer primer endotel hücre tipleri iki yıldır kan damar çimlenme ve geliştirme in vitro1model için kullanılmıştır. Bu tür vasküler platformlar kardiyovasküler hastalığın moleküler ve doku seviyesi mekanizmalarını aydınlatmaya söz verir ve ilkel vasküler ağlar2,3' ün gelişmesine fizyolojik anlayış sunabilir. Vasküler modelleme alanı önemli gelişmeler tanık olmasına rağmen, niceliksel olarak model ve fizyolojik vasküler gelişimi değerlendirmek olabilir bir "altın standart" tahlil zor kalır. En çok yayınlanan protokoller, Olgun, fonksiyonel kan....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kültür Medya ve kaplama çözümlerinin hazırlanması

  1. Vitronektin kaplama çözeltisi hazırlamak için, Dulbecco fosfat-tampon tuz (DPBS) içinde seyreltmeli vitronektin 1:100.
    DIKKAT: seyreltilmiş bir kez, bu çözümün gelecekteki kullanım için depolanmasý önerilmez.
  2. Fenol kırmızı-ücretsiz aldıktan sonra, büyüme faktörü-azaltılmış jelatinli protein karışımı (bkz . malzeme tablosu) üreticiden, buz üzerinde çözülür 4 ° c karışımı şeffaf ve sıvı kadar. Karışımı bir laminar akış kaputu içinde buz üzerinde tutarak, pipet 75 μL karışımı bir 1,8 mL mikrosantrifüjü tüp içine ve donma-20 °C hemen. Bu plakaya bir yıl kadar depolanabilir.
    DIK....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Farklılaşma sonra (Şekil 1), FACS ve kollajen Hidrojeller Içinde IPSC-EPS kapsülleme, hücreler genellikle yuvarlanacak kalır 24 saat önce göç ve form ilk lümen başlamak için. Yaklaşık 6 gün sonra kültür, ilkel bir kılcal plekbe görünür olacak hidrojel aydınlık alan mikroskobu ile görünürken (Şekil 2). Bir Konfokal mikroskop üzerinde sabit, lekeli hücre yüklü hidrojellerin görüntüleme sonra (Film 1, ek film 1), ön.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, üç hücre kültürü ortamındaki hücrelerin uzun vadeli kültürünü içerir: E8, LaSR basal ve EGM-2. Bu nedenle, tüm malzemeleri uygun sterilize etmek için büyük bir özen yapılmalıdır. Laboratuvarın laminar akış kaputunda çalışırken Ayrıca, laboratuar Mont ve etanol temizlenmiş eldiven her zaman giyilmelidir. Sık Mikoplazma kontaminasyonu için test edilmesi tavsiye edilir; IPSC kültürü sırasında büyük miktarda enkaz gözlenirse veya farklılaşma verimliliğinde ani bir düşüş varsa, Mikoplazma kontaminasyonu muhtemel .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Amerikan Kalp Derneği (hibe numarası 15, 25740035, J.Z.), Ulusal Sağlık Enstitüsü Biyomedikal görüntüleme ve Biyomühendislik (NıBıB) Ulusal sağlığı (Grant numarası EB007507, C.C. tarafından verilir) tarafından destekleniyordu ve Rejeneratif rehabilitasyon araştırmaları & eğitimi (AR3T, Grant numarası 1 P2C HD086843-01, J.Z. ' a verilir) için Ittifak. Prof. Jeanne Stachowiak 'ı (Austin 'deki Texas Üniversitesi) Konfokal mikroskopiye yönelik teknik tavsiyelerini kabul etmek istiyoruz. Biz de Samuel Mihelic (Austin University of Texas), Dr Alicia Allen (Texas University of Austin), Dr Julie Rytlewski (Adaptive Biotech) ve Dr Leon Bellan (Vanderbilt Üniversites....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
µ-Slide AngiogenesisIbidiN/AYan duvarlı düz, cam tabanlı bir doku kültürü plakası, kolay konfokal görüntülemeyi mümkün kılar
96 kuyulu, yuvarlak tabanlı, ultra düşük bağlantılı mikroplaka, sterilCorning7007Hücre yüklü kollajen hidrojellerin hücre kültürü kabına bağlanmasını önler
AccutaseSTEMCELL Technologies7920Nazik hücre ayırma çözeltisi; FACS Advanced
DMEM/F12Thermo Scientific12634010iPSC-EP farklılaşması için temel ortamdır.
Barnstead GenPure xCAD Plus Thermo Fisher Scientific50136165Su arıtma sistemi; diğerleri kolayca ikame edilebilir
Sığır Serumu Albümin çözeltisi, DPBS'de% 7.5, steril filtreli, BioXtra, hücre kültürü için uygunFisher ScientificA8412FAC'ler CD34-PE'yi sıralarken hücre canlılığını korumak için
, insan (klon: AC136)Miltenyi Biotec130-098-140iPSC-EP'lerin
FAC izolasyonu için kullanılan antikorCHIR99021LC LaboratuvarlarıC-6556Pluripotent kök hücrelerden mezoderm oluşumunu indükler
Kollajen I Sıçan Kuyruğu Yüksek Protein 100 mgVWR3542493D mikro ortamın ana bileşeni
Konik santrifüj tüpleri (15/50 mL)Fisher Scientific14-959-49D/ANispeten büyük hacimli reaktifleri ve hücre kültürü ortamını
depolamak ve karıştırmak için kullanılırDAPI (4 ',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroklorür)Thermo Fisher ScientificD1306Hücre çekirdeklerini lekelemek ve görselleştirmek için
DMEM/F12Thermo Fisher Scientific11320-082Matrigel'in seyreltilmesi ve pluripotent kök hücrelerin çözülmesi için
Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS)ThermoFisher14190-250Tek katmanlı kültürleri yıkamak için
EDTASigma-AldrichE8008Pluripotent kök hücre kolonilerinin pasajı ve FAC'ler sıralanırken hücre agregasyonunu önlemek için
Endotel Hücre Büyüme Ortamı 2PromoCellC-22011Endotel hücre canlılığını ve proliferasyonunu destekler
Esansiyel 8 Orta ThermoFisher ScientificA1517001   Pluripotent kök hücrelerin bakımı için
Glisin, BioUltra, moleküler biyoloji için, >=%99.0 (NT)Sigma-Aldrich50046Kalan deterjanı nötralize eder
L-Askorbik asit 2-fosfat seskimagnezyum tuzu hidrat, >=%95Sigma-AldrichA8960iPSC-EP farklılaşma ortamının bileşeni
MATLABMathWorks1.8.0_152Çok paradigmalı sayısal hesaplama ortamı (çoğu akademik kurumda ücretsiz olarak mevcuttur)
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (jelatinimsi protein karışımı)Fisher Scientific356231iPSC-EP farklılaşması için plakaları kaplamak üzere DMEM/F12 içinde seyreltilmiş
Medium-199 10XThermo Fisher Scientific1825015Nihai hidrojel ozmolaritesini ve pH'ı dengelemek için kullanılır
Mikrosantrifüj tüpleri (1.7 mL)VWR87003-294Küçük hacimli reaktifleri depolar
Fosfat tamponlu salin (PBS)Sigma-AldrichP3813İmmün boyama solüsyonlarının ana bileşeni
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122FACS cihazından olası kontaminasyonu gidermek için sınıflandırmadan sonra kullanılan antibiyotik
Rekombinant İnsan VEGF 165 Protein R& D Systems293-VEEndotel hücre proliferasyonunu ve tubulogenezi uyaran mitojen
Rhodamine phalloidinThemo Fisher ScientificR415F-aktin birikimini tanımlamak ve dolayısıyla vasküler ağların sınırlarını ana hatlarıyla belirtmek için
Triton X-100 (noniyonik yüzey aktif madde)Sigma-AldrichX-100Hücreleri nazikçe geçirgen hale getirmek için kullanılan deterjan
Tween-20 (emülsifiye edici reaktif)Fisher ScientificBP337Eklenen antikorların bağlanma özgüllüğünü arttırır
VE-Cadherin (F-8)Santa Cruz Biotechnologysc-9989 Kollajen hidrojellerdeki 3D endotel lümenini tanımlamak için
VitronectinThermoFisherA14700Pluripotent kök hücrelerin bakımı için
Y-27632Selleck ChemicalsS1049Ayrıştığında ve yeniden tohumlandığında pluripotent kök hücre ve iPSC-EP canlılığını korur
için hayati önem taşıyan hücre dışı epitopları bozmaz. :

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, K., Lin, R. -Z., Melero-Martin, J. M. Bioengineering human vascular networks: trends and directions in endothelial and perivascular cell sources. Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-19 (2018).
  2. Kant, R. J., Coulombe, K. L. K.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

iPSC Derived Endothelial ProgenitorsFluorescent Activated Cell SortingCollagen Hydrogel EncapsulationVasculogenic Potential Quantification3D Vascular Network FormationConfocal Microscopy AnalysisOpen Source Computational PipelineEndothelial Growth Medium 2ROCK Inhibitor Y 27632Vascular Endothelial Growth Factor

Related Articles