Method Article

Tek Moleküllü İzleme Mikroskobu - Sitosolik Moleküllerin Diffüz Durumlarını Belirlemede Bir Araç

DOI:

10.3791/59387

⸱

September 5th, 2019

 , 
1Department of Chemistry, University of Virginia, 2Department of Molecular Physiology & Biological Physics, University of Virginia School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi, yaşayan bakteri hücrelerinde floresan olarak etiketlenmiş proteinlerin mekansal konumlarını ve hareket yörüngelerini araştırmak için kullanılır. Burada açıklanan deneysel ve veri analizi protokolü, sitosolik proteinlerin havuzhalinde ki tek moleküllü yörüngelere dayalı yaygın diffüzif davranışlarını belirler.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi, onlarca nanometre uzamsal ve milisaniye zamansal çözünürlükle canlı hücrelerdeki tek tek moleküllerin pozisyonunu ve hareketlerini inceler. Bu yetenekler, fizyolojik olarak ilgili ortamlarda moleküler düzeydebiyolojik fonksiyonları incelemek için tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu ideal hale getirmektedir. Burada, ilgi çekici bir proteinin sergileneebileceği farklı difüzif durumları ayıklamak için tek moleküllü izleme verilerinin hem elde edilmesi hem de işlenmesi/analizi için entegre bir protokol gösteriyoruz. Bu bilgiler canlı hücrelerdeki moleküler karmaşık oluşumu ölçmek için kullanılabilir. Kamera tabanlı 3D tek moleküllü yerelleştirme deneyinin ayrıntılı bir açıklamasını ve tek tek moleküllerin yörüngelerini sağlayan sonraki veri işleme adımlarını salıyoruz. Bu yörüngeler daha sonra floresan etiketli moleküllerin yaygın diffusive durumları ve bu devletlerin göreceli bolluk ayıklamak için sayısal bir analiz çerçevesi kullanılarak analiz edilir. Analiz çerçevesi, rasgele hücre geometrisi ile uzaysal olarak sınırlı olan hücre içi Browndifüzyon yörüngelerinin stokakstik simülasyonlarına dayanmaktadır. Simüle edilen yörüngelere dayanarak, ham tek moleküllü görüntüler deneysel görüntülerle aynı şekilde üretilir ve analiz edilir. Bu şekilde, deneysel olarak kalibre edilmesi zor olan deneysel hassasiyet ve doğruluk sınırlamaları, analiz iş akışına açıkça dahil edilir. Yaygın difüzyon katsayısı ve yaygın diffüzif durumların göreli popülasyon fraksiyonları, simüle edilmiş dağılımların doğrusal kombinasyonları kullanılarak deneysel değerlerin dağılımları uygun hale alınarak belirlenir. Bakteriyel bir patojenin sitosolunda homo- ve hetero-oligomerik kompleksler oluşturarak farklı diffusive durumları sergileyen bir proteinin diffüzif durumlarını çözerek protokolümüzün yararını gösteriyoruz.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyomoleküllerin diffüzif davranışlarının incelenmesi biyolojik işlevlerihakkında bilgi sağlar. Floresan mikroskobu tabanlı teknikler kendi doğal hücre ortamında biyomolekülleri gözlemlemek için değerli araçlar haline gelmiştir. Fotobeyazrlama (FRAP) ve floresan korelasyon spektroskopisi (FCS) 1 sonrası floresan iyileşme1 topluluk ortalama difüzif davranışlar sağlar. Tersine, tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük2,3,4ile bireysel floresan etiketli moleküllerin gözlem sağlar. İlgi çekici bir protein farklı diffüzi....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Çift sarlak noktası-yayma fonksiyonu kalibrasyonu

NOT: Bu ve aşağıdaki bölümlerde açıklanan görüntüler, Rocha ve ark.23'teaçıklandığı gibi, özel olarak oluşturulmuş ters floresan mikroskobu kullanılarak elde edilir. Aynı prosedür tek moleküllü lokalizasyon ve izleme mikroskobu 2,3,4için tasarlanmış farklı mikroskop uygulamaları için geçerlidir. Bu makalede açıklanan görüntü toplama ve veri işleme için tüm yazılımlar mevcuttur (https://github.com/GahlmannLab2014/Single-Molecule-Tracking-Analysis.git).

  1. Mik....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan deneysel koşullar altında (20.000 kare, yörünge uzunluğu en az 4 lokalizasyon) ve floresan etiketli füzyon proteinlerinin ifade düzeylerine bağlı olarak, yaklaşık 200-3.000 lokalizasyon 10-150 verim yörüngeler hücre başına oluşturulabilir (Şekil 2a,b). Belirgin difüzyon katsayıları iyi örneklenmiş bir dağılım üretmek için çok sayıda yörünge gereklidir. Burada toplanan FOV boyutu ~ 55 x 55 μm, deney başına toplanan 10 FOV ile........

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sunulan protokolün başarılı bir şekilde uygulanması için kritik bir faktör, tek moleküllü sinyallerin birbirinden iyi ayrılmasını sağlamaktır (yani, uzayda ve zamanda seyrek olmaları gerekir(Ek Mov. 1)). Bir hücrede aynı anda birden fazla floresan molekül varsa, lokalizasyon başka moleküllerin yörüngesine yanlış atanabilir. Bu bağlantı sorunu30olarak adlandırılır. Bağlanma problemini önlemek için protein ekspresyonu düzeyleri ve uyarma lazer yoğunluğu gibi deneysel durumlar seçile.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El yazmasının eleştirel okuması için Alecia Achimovich ve Ting Yan'a teşekkür ederiz. Biz Ed Hall, Virginia Üniversitesi'nde İleri Araştırma Bilgi İşlem Hizmetleri grubunda kıdemli personel bilim adamı, bu çalışmada kullanılan optimizasyon rutinleri kurma konusunda yardım için teşekkür ederiz. Bu çalışma için finansman Virginia Üniversitesi tarafından sağlanmıştır.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2,6-diaminopimelik asitChem Impex International5411Kullanılan Y. enterocolitica hücrelerinin büyümesi için gereklidir.
4f lenslerThorlabsAC508-080-Af = 80mm, 2 "
514 nm lazerTutarlıGenesis MX514 MTMFloresan uyarma
agarozInivtrogeniçin kullanın 16520100Sıvı bakteri örneğini mikroskoba monte etmek için jel pedler yapmak için kullanılır.
amonyum klorürSigma AldrichA9434M2G bileşeni.
bant geçiren filtreChromaET510 / bpUyarma yolu.
Beyin Kalp İnfüzyonuSigma Aldrich53286Y. enterocolitica için büyüme ortamı.
kalsiyum klorürSigma Aldrich223506M2G bileşenidir.
kameraGörüntüleme KaynağıDMK 23UP031Faz kontrast görüntüleme için kamera.
dielektrik faz maskesiÇift Sarmal, LLCN/ADHPSF sinyali üretir.
disodyum fosfatSigma Aldrich795410M2G bileşeni.
etilendiamintetraasetik asitFisher ScientificS311-100Şelatlar Ca2 + < / sup>. T3SS'de sekresyona neden olur.
çevirmeli aynaNewport8892-KFloresan ve faz kontrast yolları arasında geçiş yapılmasına izin verir.
fluosferlerInvitrogenF8792Floresan boncuklar. 540/560 eksikasyon ve emisyon dalga boyları. 40 nm çap.
cam kapak kaymaVWR16004-302# 1.5, 22mmx22mm
glikozChem Impex International811M2G bileşeni.
daldırma yağıOlympusZ-81025Objektif lens üzerine yerleştirilir.
demir(II) sülfatSigma AldrichF0518M2G bileşeni.
uzun geçiren filtreSemrockLP02-514RU-25Emisyon yolu.
magnezyum sülfatFisher ScientificS25414AM2G bileşenidir.
mikroskop platformuMad City Labstersmikroskop için özel Platform.
nalidiksik asitSigma AldrichN4382Y. enterocolitica Kullanılan hücreler nalidiksik aside dirençlidir.
objektif lensOlympus1-U2B99160X, 1.4 NA
Ozon temizleyiciNovascanPSD-UV4Cam kapak kaymalarında arka plan floresansını ortadan kaldırmak için kullanılır.
potasyum fosfatSigma Aldrich795488M2G bileşenidir.
Kırmızı LEDThorlabsM625L3Faz kontrast görüntüleme için numuneyi aydınlatır. 625 nm'dir.
Floresan görüntüleme içinsCMOS kameraHamamatsuORCA-Flash 4.0 V2
kısa geçiren filtreChromaET700SP-2P8Emisyon yolu.
Tüp lensThorlabsAC508-180-Af=180 mm, 2 "
Yersinia enterocolitica dHOPEMTasdN/AN/AGerinim AD4442, eYFP-YscQ
sıfır dereceli çeyrek dalga plakasıThorlabsWPQ05M-514Uyarma yolu.
Kamera.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kapanidis, A. N., Uphoff, S., Stracy, M. Understanding Protein Mobility in Bacteria by Tracking Single Molecules. Journal of Molecular Biology. , (2018).
  2. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule Tracking3D Localization MicroscopyDiffusive States AnalysisFluorescent Bead FiducialDouble Helix Point Spread FunctionMATLAB Data ProcessingApparent Diffusion CoefficientStochastic Simulation FrameworkCytosolic Protein ComplexesBacterial Pathogen Imaging

Related Articles