Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Opsonophagocytic öldürme tahlil bakteriyel patojenlere karşı immünolojik yanıt değerlendirmek için

13K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/59400

⸱

5 Nisan 2019

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center for Molecular Medicine and Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

Bu makalede

Özet

Bu opsonophagocytic öldürme tahlil yeteneği yanıt ve farklı tedaviler ve/veya koşullar üzerinde temel bakterileri öldürmek için fagositik bağışıklık hücrelerinin karşılaştırmak için kullanılınır. Klasik, bu tahlil bir bakteri bağlar olarak karşı kaldırdı antikorlar efektör fonksiyonları değerlendirmek için altın standart olarak hizmet vermektedir.

Özet

Bir anahtar için ev sahibi bakteriyel kolonizasyon bağışıklık yanıtının fagositoz yönüdür. Bir opsonophagocytic öldürme tahlil (OPKA) Fagositlerlerce bakteriyel birimleriyle işbirliği kültürlü olan deneysel bir işlemdir. Bağışıklık hücreleri phagocytose ve bakteri kültürleri bir tamamlayıcı bağlı şekilde öldürmek. İmmün aracılı hücre öldürme verimliliğini bir dizi faktöre bağlıdır ve ne kadar farklı bakteriyel belirlemek için kullanılan kültürler karşılaştırmak direnç hücre ölümü ile ilgili olarak. Bu şekilde, potansiyel bağışıklık tabanlı tedavi etkinliğinin belirli bakteri suşları ve/veya serotipleri karşı tespit edilebilir. Bu protokol için temel kültür koşulları ve tedavi koşulları ve HL-60 bağışıklık hücreleri ile ortak kültür sonra bakteri hücre canlılığı belirlemek için sayma hücre kullanır bir basitleştirilmiş OPKA açıklar. Bu yöntem başarılı bir şekilde birkaç farklı pnömokok serotipleri, kapsül ve acapsular suşları ve diğer bakteriyel türler ile kullanıldığında vardır. (Bu tahlil antikor tedavisi opsonins olarak sınırlı değildir) bu OPKA Protokolü avantajları sadeliği çok yönlülük şunlardır ve zaman ve temel deneysel grupları değerlendirmek için reaktif indirilmesi.

Giriş

Tahlil (OPKA) öldürme opsonophagocytic bağışıklık yanıtı ve fonksiyon sonraki değişiklikler değişiklikler bakteriyel yapısı veya işlev bağlamak için önemli bir araçtır. Bu nedenle, bu sık sık antikor tedavisi, aşı adaylar, enzim optimizasyonu, vb bağışıklık tabanlı etkinliğini belirlemek için tamamlayıcı bir tahlil olarak kullanılır. İçinde vivo deneyleri etkili temizleme veya koruma bir bakteriyel enfeksiyon modeli belirlemek gerekli olmakla birlikte, OPKA bakteriyel hücre ölümü bağışıklık katkısı en temel bileşenleri değerlendirmek için kullanılabilir: bakteri, bağışıklık hücreleri ve deneysel tedaviler. Önceki çalışmalarda OPKAs değiştiren ve bakteri ve serotipleri, Streptococcus pneumoniae1, Staphylococcus aureus2, Pseudomonas aeruginosa3de dahil olmak üzere çeşitli için kullanılan göstermiştir. Ayrıca, bu en iyi duruma getirilmiş deneyleri bakteri Kompleman aracılı bağışıklık hücreleri4 ve antikor tedavileri geliştirmek için daha erişilebilir kılan bir enzim da dahil olmak üzere farklı deneysel tedaviler değerlendirmek için kullanılabilir opsonizasyonla5. Klasik, OPKA tahlil başarıyla temel ve klinik araştırmada kullanılmıştır ayarları korumak için güçlü bir göstergesi olarak indüklenen patojen özel antikorlar6,7,8tarafından,9 .

Bağışıklık hücreleri türleri opsonophagocytic öldürme değerlendirilmesi için kullanılan. Bir sık kullanılan fagositik nüfus HL-60 insan lösemik hücre çizgidir. Bu hücre kültürünü Inaktif promiyelosit kültür olarak tutulabilir; Ancak, onlar farklı ilaç tedavisi10,11ile çeşitli aktif Birleşik Devletleri içine farklı. Tedavisi HL60 n, N-dimethylformamide içine güçlü fagositik aktivite11ile aktif nötrofil hücre ayırır. HL-60 hücreleri optimize edilmiştir ve bu fagositoz deneyleri10için sık sık kullanılır, diğer birincil polimorfonükleer lökosit12deneme bağışıklık kolu olarak kullanılabilir.

Ayrıca, bu deneyleri Basitleştirilmiş13 olabilir veya test edilecek bakterilerin birden çok antibiyotik dirençli suşların bakmak için14 multiplexed. Çoğaltılmış yöntemi daha verimli bir şekilde bakteriyel koloni başına bir agar plaka15oracıkta birimleri (CFUs) oluşturan güvenebilirsiniz yazılım geliştirme yoluyla uygun hale getirilmiştir. Burada, bir bakteriyel zorlanma, HL-60 hücreleri, bebeği tavşan tamamlayıcı ve kan Ağar kaplamalar kullanarak akıcı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntemle, birden fazla tedavi hızlı bir şekilde nasıl bakteriyel enfeksiyon doğuştan gelen bağışıklık yanıtı modülasyonlu üzerinde belirli araştırma soruları gidermek tespit edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Kültür, farklılaşma ve HL-60 hücre doğrulama

  1. HL-60 hücre kültür medya 500 mL RPMI L-glutamin ve 50 mL ısı inaktive fetal sığır serum ile oluşan hazırlayın. Bu HL-60 hücrelere farklılaşma etkileyebilir gibi antibiyotikler eklemeyin.
  2. HL-60 hücrelerinin yayılma/bakım için kültür 5 x 106 hücre HL-60 hücre kültür medya 75 cm2 ' deki 10 ml şişe 37 ° C ve % 5 CO2Bacalı. Geçiş hücreleri 3−4 günde optimum hücre konsantrasyonları korumak için.
    Not: Hücre konsantrasyonu 5 x 106/mL aşmaması gerekir.
  3. HL-60 hücrelerinin çalışma stokları aliquoting yaklaşık 1 x 106 hücre/mL % 10 Dimetil sülfoksit (DMSO) ile HL60 kültür medya tarafından 1 mL kriyojenik tüpler içine oluşturur.
    Not: Çalışan hisse senetleri-80 ° C'de depolanmış olabilir Ana stok-120 ° C'de muhafaza edilmelidir
  4. HL-60 hücreleri kodlamayla 1.5 x 107 hücrelerde 15 mL %0,6 N, N-dimethylformamide (DMF) ile HL-60 hücre kültür medya tarafından 37 ° C ve % 5 CO2 filtre şapkalı steril 75 cm2 şişe'de 3 gün önce OPKA için ayırt etmek.
  5. HL-60 hücreleri başarıyla ayrıştırılan ve canlılık ve hücre yüzey işaretleyicileri kurulan Akış Sitometresi protokolleri16,17göre test ederek OPKA tahlil kullanımına uygun doğrulamak, 18,19. Farklılaşma sonra HL-60 hücre hasat ve CD71, CD35, annexin V ve propidium iyodür için yaklaşık 1 x 104 hücreleri ile fluorescently Birleşik antikorlar/lekeleri leke.
    Not: Farklılaşmış hücreler-meli var olmak ≥65% uygun, ≥55% CD35+ve ≤20% CD71aracılığıyla belirlenen + kurulan doğrulama protokolleri14 (şekil 1).

2. OPKA arabellekleri ve Kimyasalları hazırlanması

  1. Steril opsonizasyonla arabelleği B (OBB) 50 mL steril 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x 42,5 mL Ca2 +/Mg2 +, ısı inaktive fetal sığır serum 5 mL ve 2.5 mL % 0.1 ile steril jelatin karıştırarak hazırlayın. 4 ° C'de mağaza
  2. Bebeği tavşan tamamlayıcı almak ve-80 ° C'de depolamak
  3. Elde etmek veya bakteriyel kültür Tabaklar (yani, 15 x 100 mm%2 5 koyun kan agar tabaklar) hazırlamak.

3. bakteriyel hisse senedi örnekleri hazırlanması

  1. Test edilecek bakteriyel strain(s) bir hisse senedi alın.
    Not: Bu iletişim kuralı için serotip 3 pnömokok (WU2, Dr. Moon Nahm tarafından cömertçe karşılanmıştır) kullanılır.
  2. Yaklaşık olarak 37 ° C'de s 2−4 için (yani, Todd-Hewitt suyu + %0.5 Maya özü bu WU2 zorlanma için) uygun bir suyu bakteriyel zorlanma büyümek
    Not: Optik yoğunluk 600 nm (OD600) kültür 0.6 ve 0.8 arasında olmalıdır.
  3. Santrifüjü 6.000 x g 2 min için de tarafından bakteri cips ve uygun suyu % 15 gliserol 10−30 mL hücrelerde resuspend. Aliquot steril 1,5 mL santrifüj tüpleri ve-80 ° C'de mağaza içine bakteri kültürü (aliquot başına 500 µL)
  4. Bakteriyel bir 37 ° C su banyosu stokta bir şişe dışarı çözülme. Bakteri hücreleri cips ve OBB 500 µL steril koşullar altında resuspend.
  5. OBB (yani, hiçbir seyreltme 10 µL, 10 µL 1:10, 1: 100, vb 10 µL) bakteriyel stokunun farklı dilutions hazırlayın. OPKA tahlil (Bölüm 4-6, dahil HL-60/tamamlayıcı ortak kültür) tedavi edilmezse bakteri stokunun çeşitli dilutions kullanarak aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirin. Plakayı gecede 30 ° C'de (hiçbir CO2) kültür.
    Not: Sıcaklığı 30 ° C WU2 aşırı büyüme önlemek özeldir; diğer suşların/serotipleri 37 ° C'de en iyi şekilde ulaşması
  6. Colonies için her seyreltme tedavi edilmezse bakteri stokunun HL-60 hücreleri ve tamamlayıcı ile birlikte kültürlü saymak. Belirlemek hangi seyreltme bakterilerin sayılabilir koloniler (yaklaşık 80−120 CFUs tedavi edilmezse bakteri HL-60 hücrelerle birlikte kültürlü için) en iyi sayısını verir. Bu seyreltme için gelecekteki OPKAs bakteriyel bu hisse senedi içeren dikkat edin.

4. bakteriyel tedavi ve kültür

  1. 3.3. adımda hazırlanan bakteriyel stokunun bir tüp çözülme. Bakteri (6.000 x g için 2 dk) cips ve hücre Pelet 3.6. adımda belirlenen en uygun seyreltme, OBB içinde resuspend.
  2. Resuspended bakteriyel seyreltme iyi bir yuvarlak alt 96-şey hücre kültür plaka başına 10 µL pipet.
  3. Uygun antikor veya uyuşturucu tedavi 20 µL yinelenen deneysel her kuyuya ekleyin.
    Not: Bu iletişim kuralı, farelerde oluşturulan bir serotip özgü antikor tedavisi X eklenir ve serotip 3 polisakkarit kapsülü aşağılamak için bilinen bir glikozid hidrolaz enzim tedavisi olarak Y (Şekil 2)4,20eklenir. Denetim kuyular için PBS veya OBB, x 1 tedavi kuyular için kullanılan arabellek bağlı olarak kullanın.
  4. Oda sıcaklığında 1 h için yaklaşık 90 devirde örnek plaka sallamak. Bu koşullara bağlı olarak en uygun sıcaklık veya test edilen tedavilerin sallayarak koşulları ayarlayın.

5. HL-60 bakteriyel ortak kültür

  1. HL-60 hücreleri DMF ile üç gün önceden (bkz. Adım 1.4) 15 mL konik tüpler içine kabul edilir HL-60 farklılaşmış hücre hasat tarafından hazırlayın. Hücreler (500 x g, 3 dk) cips, süpernatant atmak ve en az 10 mL 1 x PBS yıkayın.
  2. Yıkanmış hücreler (500 x g, 3 dk) cips, süpernatant atmak ve OBB hücrelerde resuspend (1 mL OBB ile başlatmak ve 1 x 107/mL Hücre sayımı sonra son bir konsantrasyon için ayarlayabilirsiniz).
  3. Bebeği tavşan tamamlayıcı (steril, su katılmamış bebeği tavşan serum, Yaş 3−4 hafta) 1:5 son seste ekleyin.
    Not: HL-60-tamamlayıcı karışımı son konsantrasyonu 1 x 107/mL olmalıdır. Tamamlayıcı bağımlılık sınama olumlu sonuçlanırsa, ısı inaktive tamamlayıcı ile etkin HL-60 hücreleri içeren ikinci bir çözüm kullanılabilir (tamamlayıcı inaktive olur bir su banyosunda kuluçka > için en az 30 dk. 55 ° C).
  4. 1 h bakteri kültürü tam (4.4) adımdır sonra yinelenen kuyular iki grup (yani, kullanım sadece 20 µL pipetting hata için hesap için orijinal 30 µL ortak kültür) için her örnek (yani, her 30 µL örneği de iki yeni kuyu içine 10 µL) bölün : bir set HL-60-tamamlayıcı ile birlikte kültürlü olacak ve bir bakteri yalnızca yer alacak. 50 µL wells deneysel her dizi için (Kimden adım 5.3) HL-60-tamamlayıcı karışımı ekleyin (temsilci seçilen + HL-60); OBB yalnız 50 µL bakteri sadece (temsilci seçilen -HL-60) kuyu için ekleyin.
    Not: Bu örnekte, yaklaşık 800 bakteriyel CFUs 5 x 105/50 µL HL-60 hücrelerle ilk ortak kültürü için kullanılır. Bu çeşitlilik enfeksiyon çok yüksek veya çok düşük son koloni numaraları tarafından belirtildiği şekilde ise, ilk bakteriyel seyreltme HL-60 hücre sayısı olarak ayarlayın.
  5. 96-şey plaka için 1 h (hiçbir CO2) 37 ° C'de sallamak.

6. örnek kaplama ve gecede kuluçka

  1. Her örnek en az 50 µL hacmi böylece her şey 1:5 ile OBB, oranında seyreltin.
  2. Doğrudan üzerine örnekleri arasında yeterli boşluk sağlanması bakteriyel kültür plaka, belirlenmiş bir alanda her örneğinin 50 µL pipet. 15 x 100 mm için2 yuvarlak Ağar Kaplamalar, damlalıklı yaklaşık 4 örnekleri üzerine bir tabak.
  3. Kapak ve örnekleri, oda sıcaklığında yaklaşık 15 dakika kurumasını bekleyin.
  4. Kaplamalar ve kültür gecede 30 ° C'de (hiçbir CO2) tersine çevirin. Alternatif olarak, tabak anoksik koşulların Bakteriyel büyüme etkiler olup olmadığını sınamak için anaerobik kavanoz veya denetime Morfoloji için kültür.
  5. Gecede kültür sonra her belirlenen örnek alanı kolonilerde saymak. Her sette karşılık gelen denetim ve/veya HL-60 cep ortak kültür almazsınız örnekleri canlı hücre sayısı karşılaştırarak veri analiz (gösterge % %0 100 hücre kurtulma hücre öldürme).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Doğrulama HL-60 farklılaşma OPKA başlamadan önce gerçekleştirilmelidir. Bu hücre dışı ifade CD11b, CD35, CD71 ve annexin V (şekil 1) belirlemek için Akış Sitometresi kullanılarak gerçekleştirilebilir. Propidium iyodür bir canlılık marker olarak da kullanılabilir. DMF ile 3 gün sonra tedavi altına, CD35 ifade artırılmalıdır (tüm hücreleri ≥55%) ve CD71 ifade düşmüştür (tüm hücreleri ≤20%). Annexin V + ve propidium iyodür (PI +) hücreleri birlikte yüzdesi olmalıdır < % 35 yeterli sağlamak i...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

OPKAs antikor aracılı bağışıklık yanıtı aşılar6,8tarafından indüklenen değerlendirmede önemli roller hizmet. Adaptasyon koşullarında test edilecek bu Basitleştirilmiş OPKA ana önemi nedir (antikorlar, enzim tedavisi, vs.). Bu tahlil opsonins (yani, antikorlar) katkısını fagositoz içinde test etmek için kullanılan bu anlamda, bu da normalde fagositik yolları inhibe virülans faktörleri (yani kapsüler polisakkaritler) aşmak için yollar değerlendirmek için kullanılab...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Dr. Moon Nahm (University of Alabama Birmingham) bizim laboratuvar deneyleri OPKA kurulmasında çok değerli onun yardım için teşekkür. Bu eser FYA için Ulusal Sağlık Enstitüleri Grant 1R01AI123383-01A1 tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Annexin V (APC konjuge)BioLegend640919
anti-CD35, insan (PE konjuge)BioLegend333405
anti-CD71, insan (PE konjuge)BioLegendkullanılacak
(yani, Streptococcus pneumoniae, WU2)Bakteriyel Solunum Referans Laboratuvarı (Dr. Moon Nahm) 
kan agar plakalarıHardy DiagnosticA10
Fetal Klon serumHyCloneSH30080.03
gliserolSigmaG9012-1L
HL-60 hücreleriATCCCCL-240
IgG İzotip Kontrolü (PE konjuge)BioLegend400907
N,N-dimetilformamid (DMF)Fisher
propidyum iyodürSigmaP4864
RPMI ortamı
bakteri suşu 334105 L-glutamin Corning 10-040-CV ile kimyasal UN2265

Kaynaklar

  1. Romero-Steiner, S., et al. Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).
  2. Nanra, J. S., et al. Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).
  3. Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin. Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).
  4. Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense. Infection and Immunity. , (2018).
  5. Baker, C. J., Noya, F. J. Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection. Reviews of Infectious Diseases. 12, Suppl 4 476-482 (1990).
  6. Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice. Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).
  7. Parameswarappa, S. G., et al. A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection. Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).
  8. Jackson, L., et al. Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine. Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).
  9. Cywes-Bentley, C., et al. Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).
  10. Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
  11. Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).
  12. Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).
  13. Dwyer, M., Gadjeva, M. Opsonophagocytic assay. Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).
  14. Burton, R. L., Nahm, M. H. Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20. Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).
  15. Clarke, M. L., et al. Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies. Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).
  16. Aanei, C. M., et al. Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation. Journal of Visualized Experiments. (141), e57867(2018).
  17. Hirz, T., Dumontet, C. Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents. Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846(2016).
  18. Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death. Journal of Visualized Experiments. (50), 2597(2011).
  19. Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry. Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).
  20. Middleton, D. R., et al. Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352. Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

HL60 Hücre DiferansiyasyonuBakteriyel FagositozAkış Sitometrisi AnaliziStreptococcus PneumoniaeKomplaman Bağımlı ÖldürmeKoloni Oluşturan Birimlerİmmün Hücre Ko-kültürüİlaç Tedavisi EtkileriBakteriyel Temizleme Değerlendirmesi
Opsonophagocytic öldürme tahlil bakteriyel patojenlere karşı immünolojik yanıt değerlendirmek için
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.