Yöntem makalesi

Solvent-temizlenmiş beyin dokusu kuduz virüs enfeksiyonu yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme

DOI:

10.3791/59402

⸱

30 Nisan 2019

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular Virology and Cell Biology, Friedrich-Loeffler-Institut, Federal Research Institute for Animal Health

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yeni, immünostasyon uyumlu doku Temizleme teknikleri gibi solvent temizlenmiş organların nihai 3D görüntüleme kuduz virüsü beyin enfeksiyonu ve karmaşık hücresel çevre 3D görselleştirme sağlar. Kalın, antikor etiketli beyin dokusu dilimleri, görüntüleme derinliğini artırmak ve konfetik lazer tarama mikroskobu ile 3D analizini sağlamak için optik olarak şeffaf hale gelmiştir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enfeksiyon süreçlerinin doku ve organlarda immunolabeling tarafından görselleştirilmesi, modern enfeksiyon biyolojisinde önemli bir yöntemdir. Organ dokularının içindeki dağıtım, tropizm ve patojenlerin zenginliğini gözlemlemek ve incelemek yeteneği, hastalık gelişimi ve ilerlemesi hakkında önemli veriler sağlar. Konvansiyonel mikroskopi yöntemlerini kullanarak immünolabeling çoğunlukla parafin-katıştırılmış veya dondurulmuş örneklerden elde edilen ince bölümlerle sınırlıdır. Ancak, bu ince bölümlerin sınırlı 2D görüntü düzlemi, virüslü bir organın karmaşık yapısı ve enfeksiyonun hücresel bağlamında önemli bilgi kaybına yol açabilir. Modern çok renkli, immünostatif uyumlu doku Temizleme teknikleri şimdi virüs enfekte organ dokusu yüksek hacimli 3D görüntü yığınları incelemek için nispeten hızlı ve ucuz bir yol sağlar. Dokuyu organik çözücülere maruz bırakarak optik olarak şeffaflaşır. Bu, numunenin refraktif endeksler ile eşleşir ve sonunda ışık saçılma önemli bir azalma yol açar. Böylece, uzun serbest çalışma mesafesi hedefleri ile birlikte, yüksek çözünürlükte geleneksel Konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ile boyutu 1 mm 'ye kadar büyük doku bölümleri görüntülenmiş olabilir. Burada, virüs patogenezi, Spread, tropizm ve nöroinvazyon gibi konuları incelemek amacıyla enfekte beyinlerde kuduz virüsü dağıtımını görselleştirmek için doku temizledikten sonra derin doku görüntülemenin uygulanması için bir protokol açıklanmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konvansiyonel Histoloji teknikleri çoğunlukla karmaşık bir 3D ortama sadece 2D Öngörüler sağlayabilen organ dokularının ince bölümlerine güveniyor. Prensip olarak uygulanabilir olsa da, seri ince bölümlerden 3D yeniden yapılanma hem Dilimleme ve elde edilen görüntülerin silico hizalama sonraki için teknik boru hatları talep gerektirir1. Ayrıca, mikrotome Dilimleme işleminden sonra z-hacimlerin kesintisiz yeniden oluşturulması, hem mekanik hem de Hesaplamalı eserler nedeniyle örtüşmeyen görüntü düzlemleri, boyama varyasyonları ve fiziksel doku imha, örneğin, mikrotome bıçak. Buna karşılık, bozulmamış kalın doku örneklerinin saf optik Dilimleme çakışan görüntü düzlemleri (aşırı örnekleme) satın alma ve böylece, 3D yeniden yapılanma kolaylaştırır sağlar. Bu, sırayla, karmaşık hücre nüfuslarında enfeksiyon süreçlerinin analizi için son derece yararlıdır (örneğin, çevreleyen glial ve bağışıklık hücrelerinin bağlamında nöronal ağlar). Ancak, kalın doku bölümlerinin doğal engelleri doku içine ışık saçılma ve sınırlı antikor penetrasyonunu içerir. Son yıllarda, çeşitli teknikler geliştirilmiştir ve bu sorunların üstesinden gelmek için optimize edilmiştir2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 ' dan fazla , 11 ' i , 12 tane , 13. esasen, hedef dokular, sulu2,3,4,5,6,7 ile tedavi ile optik şeffaf olarak dönüşmüştür ,8,9 veya organik solvent bazlı10,11,12,13 çözümler. 3disco (solvent temizlenmiş organların 3B görüntüleme)11,12 ve onun halefi udisco (solvent temizlenmiş organların nihai 3D görüntüleme) tanıtımı13 , nispeten hızlı, basit ve ucuz bir araç sağladı mükemmel temizleme yetenekleri. Temizleme protokolünün ana bileşenleri organik çözücüler tert-Butanol (TBA), Benzil alkol (BA), Benzil benzoat (BB) ve difenil eter (DPE) ' dir. Geliştirme ve iDISCO eklenmesi (solvent temizlenmiş organların immünolabeling-etkin 3D görüntüleme)14, uyumlu bir immünostat protokolü, mevcut yöntemler üzerinde başka bir avantaj oluşturdu ve antijenlerin derin doku etiketleme etkin hem de immünosteli numunelerin uzun süreli depolanması. Böylece, iDISCO14 ve udisco13 kombinasyonu, geleneksel CLSM kullanarak büyük doku bölümlerinde (1 mm 'ye kadar) antikor etiketli proteinlerin yüksek çözünürlüklü görüntülemesinin sağlar.

Bir organın her üç boyutta kompleks yapısının korunması özellikle beyin dokusu için önemlidir. Nöronlar çok çeşitli 3D morfolojileri nörit projeksiyonlarına dayalı çok heterojen hücresel alt nüfus oluşturur (Masland tarafından gözden15). Ayrıca beyin, glial hücreler ve nöronlar (von Bartheld ve al.16tarafından gözden geçirilmiş) dahil olmak üzere farklı hücresel alt nüfus ve oranlardan oluşan bir dizi bölmeler ve alt bölmesinden oluşur. Bir nörotropik virüs olarak, kuduz virüsü (rabv, Fooks ve al.17tarafından gözden geçirilmiş) öncelikle nöronlar bozar, kendi taşıma makineleri kullanarak orta sinir sistemi (CNS) enfeksiyon birincil sitesinden akons boyunca retrograd yönde seyahat etmek. Burada açıklanan protokol (Şekil 1A) enfekte beyin dokusundan elde edilen büyük, tutarlı görüntü yığınlarında rabv ve rabv enfekte hücrelerin immünostal destekli algılama ve görselleştirme için izin verir. Bu, enfeksiyon ortamının tarafsız, 3D yüksek çözünürlüklü değerlendirmesini sağlar. Bu türlerin çeşitli beyin dokusu için uygulanabilir, tespit sonra hemen yapılabilir veya civarında formaldehite numunelerin uzun süreli depolama sonra (PFA), ve depolama ve ay için lekeli ve temizlenmiş numunelerin yeniden görüntüleme sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RABV-enfekte, PFA-sabit arşivlenmiş beyin malzemesi kullanıldı. İlgili hayvan deneysel çalışmaları Mecklenburg-Batı Pomerania (LALFF M-V) Devlet Tarım, gıda güvenliği ve balıkçılık eyalet ofisi sorumlu hayvan bakımı, kullanımı ve Etik Komitesi tarafından değerlendirildi ve izinler ile onay kazandı 7221.3-2.1-002/11 (fareler) ve 7221.3-1-068/16 (Ferrets). Hayvan deneylerinde kullanılan genel bakım ve Yöntemler onaylanmış yönergelere göre yürütülmüştür.

DIKKAT: Bu protokol PFA, metanol (MeOH), hidrojen peroksit (H2O2), sodyum azid (NaN3), TBA, ba, BB ve DPE dahil olmak üzere çeşitli toksik ve/veya zararlı maddeler kullanır. MeOH ve TBA son derece yanıcı. Uygun kişisel koruyucu ekipman (bir laboratuar ceket, eldiven ve göz koruması) giyen ve bir duman kaputu deneyler yaparak maruz kalma kaçının. Uygun konteynerlerde ayrı olarak atık toplayın ve yerel yönetmeliklere göre bertaraf edin. Kuduz virüsü bir Biyogüvenlik seviyesi olarak sınıflandırılır (BSL)-2 patojen ve bu nedenle, genellikle BSL-2 koşulları altında ele alınabilir. Aerosoller oluşturabilir, yüksek virüs konsantrasyonlarına sahip veya yeni lyssaviruses ile çalışabilir prosedürler de dahil olmak üzere bazı faaliyetler, BSL-3 sınıflandırma gerektirebilir. Ön pozlama profilaksisi, animal Caretakers ve laboratuar işçileri de dahil olmak üzere yüksek riskli personel için tavsiye edilir18,19. Yerel yetki yönetmeliklerine bakın.

1. beyin dokusunun ve sekleme fikreme

  1. Beyin örneklerini, 4 °C ' de en az 48 h (1:10 [v/v] ' nin yaklaşık doku-fikratif oranı ile) için fosfat-tamponlu tuz (PBS [pH 7,4]) içinde% 4 PFA uygun bir hacimde düzeltin.
  2. PBS 'de 3 adet doku örneğini en az 30 dakika yıkayın ve% 0,02 NaN3/PBS 'de 4 °c ' de kullanıma kadar saklayın.
  3. Dokuyu bir vibratome (Blade ilerleme oranı: 0.3 – 0.5 mm/s, genlik: 1 mm, dilim kalınlığı: 1.000 μm) kullanarak 1 mm kalınlığında bölüme yerleştirin.
  4. Doğru dilim sırasını korumak için, her doku bölümünü ayrı bir multiwell hücre kültürü plakasının iyi olarak saklayın. 0,02% NaN3/PBS ekleyin ve doku bölümlerini kullanım kadar 4 °c ' de saklayın.

2. metanol ile numune ön tedavisi

Not: tüm inkübasyon adımlarını nazik salınımla ve aksi belirtilmediği takdirde oda sıcaklığında gerçekleştirin. Örnekleri ışığa karşı koruyun. Örnek ön tedavi, antikor difüzyon iyileştirilmesi ve MeOH ve H2O2, sırasıyla14pozlama ile doku otofloresans azaltılması genel amacı hizmet vermektedir.

  1. Damıtılmış suda% 20 (v/v),% 40,% 60 ve% 80 MeOH çözeltileri hazırlayın. Örneğin,% 20 MeOH için, 10 mL 100% MeOH 40 mL damıtılmış su uygun bir mühürlenebilir gemi ve mix için ters çevirme ile ekleyin.
  2. Numuneleri makul boyutta gemiler (örn. 5 mL reaksiyon tüpleri) ile aktarın. Bu protokolde kullanılan reaktiflere kimyasal olarak dayanıklı materyalleri kullanmak için özen yapın. Örneğin, Polipropilen uygun iken, polistiren değildir unutmayın.
    Not: bu protokoldeki hacim spesifikasyonları 5 mL reaksiyon tüpüne başvurur. Farklı bir gemi kullanılırsa, hacimleri buna göre ayarlayın.
  3. Her biri 1 h için artan düzende MeOH çözümlerinin hazırlanmış serisinin her konsantrasyonunun 4 mL 'de örneklerini inküt.
  4. Her biri saf (% 100) 1 saat için 2x örnekleri inküt MeOH.
  5. Numuneleri 4 °C ' ye (örn. laboratuar-güvenli buzdolabında) soğutur.
  6. Hazırlamak beyazlatma çözeltisi (5% H2o2 içinde MeOH) tarafından, örneğin, seyreltme bir 30% h2o2 stok çözüm 1:6 saf (100%) Ve 4 °C ' de sakin ol.
  7. 100% MeOH 'ini soğutulmuş örneklerden çıkarın ve 4 mL prechilled beyazlatma çözeltisi (% 5 H2O2 in MeOH) ekleyin. Gece 4 °C ' de inküyün.
  8. 80% MeOH 4 mL için beyazlatma solüsyonu değişimi ve 1 h için inkük. 1 h her biri için azalan düzende MeOH çözümleri hazırlanmış dizi kullanmaya devam edin örnekleri 1 saat 4 mL içinde% 20 MeOH.
  9. 4 mL PBS ile 1 saat için 1x örnekleri yıkayın.

3. immünostakajlı

Not: tüm inkübasyon adımlarını nazik salınımla ve aksi belirtilmediği takdirde oda sıcaklığında gerçekleştirin. Örnekleri ışığa karşı koruyun. Mikrobiyal büyümesini önlemek için, bu bölümdeki çözümlere% 0,02 oranında son konsantrasyona NaN3 ekleyin. Doku örnekleri, Noniyonik deterjanlar Triton X-100 ve Tween 20 ile tedavi ile daha fazla geçirgen. Normal serum, spesifik olmayan antikor bağlayıcılığı engellemek için kullanılır. Gcine ve heparin immünolabeling arka plan azaltmak için eklenir14.

  1. 4 mL 0,2% Triton X-100/PBS 'de her biri 1 saat için 2x örnekleri yıkayın.
  2. Örnekleri 2 gün 37 °C ' de 4 mL 0,2% Triton X-100/20% DMSO/0.3 M Glycine/PBS ile geçirebilin.
  3. 4 mL 0,2% Triton X-100/10% DMSO/% 6 normal serum/PBS olarak 37 °C ' de 2 gün boyunca numuneleri kulyatlayarak antikorların spesifik olmayan bağlayıcılığı engelleyin.
    Not: İkinci antikor ideal engelleme sonuçları elde etmek için yükseltilmiş aynı türden normal serum kullanın.
  4. Numuneleri 2 mL primer antikor çözeltisi içinde (3% normal serum/5% DMSO/PTwH [PBS-Tween 20 ile heparin] + primer antikor/antikorlar) 37 °C ' de 5 gün boyunca inküserin. 2,5 gün sonra primer antikor çözümünü yenileyin.
    1. PTwH için, 10 mg/mL stok çözeltisi yapmak için distile suda heparin sodyum tuzunu yeniden oluşturur (Bu çözümü 4 °C ' de yer alan bir şekilde saklayın). 10 μg/mL 'Lik son konsantrasyona% 0,2 ara 20/PBS 'ye stok çözümünü ekleyin.
      Not: doğru antikor seyreltme seçiminde optimizasyon gerekebilir. Genel olarak, standart immünhistokimya konsantrasyonları iyi bir başlangıç noktasıdır.
  5. Numuneleri 1 gün boyunca 4 mL PTwH 'de yıkayın, yıkama tamponunu gün boyunca en az 4X – 5x olarak değiş tokuş yapın ve gecede son yıkamayı bırakınız.
  6. Numuneleri 2 mL ikincil antikor çözeltisi içinde (% 3 normal serum/PTwH + ikincil antikor/antikorlar) 37 °C ' de 5 gün boyunca inküserin. 2,5 gün sonra ikincil antikor çözümünü yenileyin.
    1. Sekonder antikor/antikorları 1:500 at ikincil antikor çözeltisi (örn., 2 mL 'de 4 μL) seyreltin.
  7. Numuneleri 1 gün 3,5 adımda açıklandığı gibi yıkayın, son yıkamayı gecede bırakınız.

4. nükleer boyama

Not: tüm inkübasyon adımlarını nazik salınımla ve aksi belirtilmediği takdirde oda sıcaklığında gerçekleştirin. Örnekleri ışığa karşı koruyun. Hiçbir nükleer boyama gerekli veya uyarılma dalga boyu/emisyon spektrum TO-PRO-3 uyarılma veya başka bir fluorophore tespiti için gereklidir, bu adımı atlayın.

  1. PTwH içinde 1:1000 ' de nükleik asit lekesini-PRO-3 ' e seyreltin ve 5 h için 4 mL nükleer boyama çözeltisi içinde numuneleri inkük.
  2. Numuneleri 1 gün 3,5 adımda açıklandığı gibi yıkayın, son yıkamayı gecede bırakınız.
    Not: yıkama işleminden sonra, örnekler optik temizleninceye kadar 4 °C ' de PBS 'de depolanabilir.

5. doku Temizleme

Not: tüm inkübasyon adımlarını nazik salınımla ve aksi belirtilmediği takdirde oda sıcaklığında gerçekleştirin. Örnekleri ışığa karşı koruyun. Doku numuneleri, kademeli bir TBA çözeltileri serisinde susuz kalmış durumdadır. İmmünosteme sulu çözümler gerektirdiğinden, tüm boyama prosedürleri doku temizliğiyle önce bitmiş olmalıdır. Optik boşluk ve Refraktif endeks eşleştirme, BA, BB ve DPE karışımı ile tedavi ile elde edilir. Temizleme çözümü, bir antioksidan olarak DL-α-tocopherol ile desteklenmektedir13.

  1. Damıtılmış suda% 30 (v/v),% 50,% 70,% 80,% 90 ve% 96 TBA çözeltileri hazırlayın. Örneğin,% 30 TBA için, uygun bir mühürlenebilir damar içinde 35 mL distile su için% 100 TBA 15 mL ekleyin ve ters çevirme ile karıştırın.
    Not: TBA 'nın erime noktası 25 – 26 °C; Böylece, oda sıcaklığında katı olma eğilimindedir. TBA çözümlerini hazırlamak için, iyi mühürlü şişeyi 37 °C ' de bir kuluçba veya su banyosunda ısıtın.
  2. 2 h her için artan düzende TBA çözümleri hazırlanmış serisinin her konsantrasyon 4 mL ile numuneleri kurutmak. Gece 96% TBA bırakın.
  3. Numuneleri saf (% 100) daha fazla kurutmak TBA için 2 h.
  4. BABB-D15 Temizleme çözümünü hazırlayın.
    Not: BABB-D15, x: 1 oranında DPE ile karışık olan BA ve BB (BABB) ' nın bir kombinasyonudur ve bu durumda 15 ' in çözümün adıyla x belirtilir.
    1. BABB için, iki parça BB ile tek parçalı BA karıştırın.
    2. 15:1 oranı ile BABB ve DPE karıştırın.
    3. Ekle 0,4 Vol% DL-α-tocopherol (vitamin E).
      Not: Örneğin, 20 mL BABB-D15 için, mix 6,25 mL, BB 12,5 mL ile BA. 1,25 mL DPE ekleyin ve 0,08 mL DL-α-tocopherol ile ek.
  5. Temizleme çözeltisi içindeki numuneleri optik olarak saydam olana kadar temizleyin (2 – 6 saat).
  6. Numuneler BABB-D15 ' d e 4 °C ' de saklanabilir, ışık korumalı, montaj ve görüntüleme kadar.

6. numune montajı

  1. 3D yazıcı kullanarak, görüntüleme odası ve kapak baskı (malzeme: kopolyester [CPE], nozul: 0,25 mm, katman yüksekliği: 0,06 mm, duvar kalınlığı: 0,88 mm, duvar sayısı: 4, dolgu: 100%, hiçbir destek yapısı; karşılık gelen. STL dosyası bu protokolün ek malzemelerinde bulunabilir).
  2. Görüntüleme bölmesini birleştirin (Şekil 2).
    1. RTV-1 (tek bileşenli oda-sıcaklık-vulkanizasyon) silikon kauçuk ile görüntüleme odasına bir yuvarlak lamel magazini (çapı: 30 mm) monte edin. Bir su ıslatılmış pamuk çubukla ile aşırı silikon kauçuk çıkarın ve gecede tedavi.
    2. RTV-1 silikon kauçuk kapağında yuvarlak lamel magazini (çap: 22 mm) monte edin. Bir su ıslatılmış pamuk çubukla ile aşırı silikon kauçuk çıkarın ve gecede tedavi.
  3. Numuneyi bir görüntüleme odasına yerleştirin, küçük bir hacmine BABB-D15 ekleyin ve kapağı takın. Bir Hipodermik iğne kullanarak, giriş yoluyla BABB-D15 ile odası doldurun (27 G x 3/4 inç [0,40 mm x 20 mm]).
  4. Giriş fişini takın ve görüntüleme bölmesini RTV-1 silikon kauçukla mühürleyin. Karanlık bir gecede Cure.

7. görüntüleme ve görüntü işleme

  1. Kullanılan fluorophores eşleştirmek için ilgili lazer hatları seçerek görüntü edinme ayarlayın. Kanallar arasında sinyal çakışmayı önlemek için her dedektör algılama aralığını ayarlayın.
    Not: Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 ve TO-PRO-3 için örnek algılama aralıkları sırasıyla 500 – 550 nm, 590 – 620 nm ve 645 – 700 nm arasındadır.
  2. Edinme parametrelerini seçin, z yığınının üst ve alt kenarlığını tanımlayın ve görüntü yığınını edinin.
    Not: örnek edinme parametreleri 60-90 nm piksel boyutunda, 0,5 μm z-Step boyutu, 1 satır ortalaması, 400 Hz tarama hızı ve 1 havadar birimin iğne deliği boyutu ile sıralı bir taramalıdır.
  3. 3B projeksiyonları oluşturmak veya derinlemesine analizler yapmak için uygun görüntü analiz yazılımını (örneğin, Fiji) kullanarak görüntü yığınını işlemektir.
    Not: elde edilen görüntü dosyalarının büyük boyutu nedeniyle, bir iş istasyonu kullanımı genellikle gereklidir.
    1. Fiji 'deki edinme veya görüntü dosyalarını (Dosya | Açık | Dosyaları seçin).
      1. Örneğin, kullanıyorsanız. LıF dosyaları, Bio-biçimler iletişim penceresinde istediğiniz seçenekleri seçin veya seçimini kaldırın. Hyperstackile görünüm yığını. Bunun dışında, belirli seçimler veya Ticks gerekli değildir. Oktuşuna basın.
      2. Dosya birden fazla görüntü yığını içeriyorsa, analiz edilecek olanları seçin ve oktuşuna basarak onaylayın.
    2. Birleştirilmiş görüntüyü ayrı kanallara bölerek çamaşır suyu düzeltmesi gerçekleştirin (resim | Renk | Kanallar aracınıseçin ve daha fazla | Bölünmüş kanallar). Her kanal için, çamaşır suyu düzeltmesi seçin (resim | Adjust | Bleach düzeltme) ve basit oran (arka plan yoğunluğu: 0,0) seçin.
      Not: bazı durumlarda, örneğin, sinyalin doğrusal çürümesi olmadığında veya sinyal genel olarak çok zayıfsa, basit oran başarısız olabilir. Alternatif olarak, üstel Sığdır 'ı deneyin veya çamaşır suyu düzeltmesi atlayın.
    3. Kaydırıcıları kullanarak her kanal için parlaklığı ve kontrastı ayarlayın (resim | Ayar | Parlaklık | Kontrast).
    4. Kanalları Birleştir (resim | Renk | Birleştirme kanalları), bileşik yapmak (resim | Renk | Kanallar aracınıseçin ve daha fazla | Bileşik olun) ve RGB biçimine dönüştürmek (resim | Renk | Kanallar aracınıseçin ve daha fazla | RGB 'ye Dönüştür).
    5. Gerekirse, hesaplama süresini ve dosya boyutunu azaltmak için görüntü yığınını yeniden boyutlandırın (resim | Adjust | Boyutu, her iki seçenek de çift doğrusal interpolasyon işaretli).
    6. 3B projeksiyon oluşturma (resim | Yığınları | 3D projesi). En parlak nokta olarak projeksiyon yöntemi seçin ve dilim aralığını, elde edilen görüntü yığınının z-Step boyutuna uyacak şekilde ayarlayın. Maksimum kalite için döndürme açısı artışını 1 olarak ayarlayın ve interpolasyonu etkinleştirin. Toplam döndürme, saydamlık eşikleri ve opaklık gerektiği gibi değiştirin.
    7. Gerekirse, 3D projeksiyon geri 8-bit biçimine dönüştürerek kontrast ve parlaklık yeniden (görüntü | Türü | 8-bit). İlgili sürgüleri kullanın (resim | Adjust | Parlaklık | Kontrast) ve adım 7.3.4 ' de açıklandığı gibi görüntü yığınını RGB biçimine yeniden dönüştürün.
    8. 3D projeksiyon olarak kaydedin. TıF dosyası (görüntü dosyası formatı) ve. AVI dosyası (video dosyası formatı).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek çözünürlüklü CLSM ile birlikte iDISCO14 ve udisco13 kombinasyonu, beyin dokusunun ve çevreleyen hücresel bağlamda rabv enfeksiyonunun uzamsal çözünürlüğü ve plastisite içine derin öngörüler sağlar.

RABV fosfoprotein (P) immünostasyon kullanarak, enfekte nöronal hücrelerin karmaşık katmanları fare beynin kalın bölümlerde görselleştirilebilir (Şekil 3). Daha sonra, elde edilen görüntü yığınlarının Dikişsiz 3D pr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sonyıllarda doku Temizleme tekniklerini canlandırmak ve daha da geliştirilmesi2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10 ' dan fazla , 11 ' i , 12 tane ,

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, yazının eleştirel okunması için Thomas C. Mettenleiter ve Verena te kamp 'a teşekkür ederler. Bu çalışma Mecklenburg Batı Pomerania Federal mükemmellik girişimi ve Avrupa Sosyal Fonu (ESF) Grant KoInfekt (ESF/14-BM-A55-0002/16) ve Lyssaviruses bir intramural işbirlikçi araştırma hibe tarafından destekleniyordu Friedrich-Loeffler-Enstitüsü (RI-0372).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktifler< / güçlü >
Benzil alkolAlfa Aesar41218Temizleme reaktifi
Benzil benzoatSigma-AldrichBB6630-500MLTemizleme reaktifi
Dimetil sülfoksitCarl Roth4720.2Çeşitli tamponlar
Difenil eterSigma-Aldrich240834-100GTemizleme reaktifi
DL-&alfa;-TokoferolAlfa AesarA17039Antioksidan
Eşek serumuBio-RadC06SBZBloke edici reaktif
GlisinCarl Roth3908.2Arka plan azaltma
Keçi serumuMerckS26-100MLBloke edici reaktif
Heparin sodyum tuzuCarl Roth7692.1Arka plan indirgeme
Hidrojen peroksit çözeltisi (% 30)Carl Roth8070.2Numune ağartma
MetanolCarl Roth4627.4Numune ön işlemi
ParaformaldehitCarl Roth0335.3Fiksatif çözelti yapmak için kristal toz
Sodyum azidCarl RothK305.1Stok çözeltilerde
mikrobiyal büyümenin önlenmesitert-ButanolAlfa Aesar33278Doku temizleme için numune dehidrasyonu
TO-PRO-3Thermo FisherT3605Nükleik asit lekesi
Triton X-100Carl Roth3051.2Deterjan
Tween 20AppliChemA4974,0500Deterjan
Çeşitli
5 mL reaksiyon tüplerEppendorf0030119401Numune tüpleri
Lamel, dairesel (çap: 22 mm)Marienfeld0111620Görüntüleme odasının bir parçası
Lamel (çap: 30 mm)Marienfeld0111700Görüntüleme odasının bir parçası
Hipodermik iğne (27 G x ¾ ” [0,40 mm x 20 mm])B. Braun4657705Görüntüleme odasının temizleme solüsyonu
RTV-1 silikon kauçukWackerElastosil E43Görüntüleme odasının montajı için yapıştırıcı
Ultimaker CPE 2,85 mm şeffafUltimaker8718836374869Görüntüleme odasının parçalarını yazdırmak için 3D yazıcı için kopolyester filament
Teknik ekipman ve yazılım< / güçlü>
3D yazıcıUltimakerUltimaker 2+Görüntüleme odası baskısı
Otomatik suya daldırma sistemiLeica15640019Yazılım kontrollü su pompası
Tezgah üstü orbital çalkalayıcıElmiDOS-20MOda sıcaklığında numune inkübasyonu (~ 150 rpm)
Tezgah üstü orbital çalkalayıcı, ısıtmalıNew Brunswick ScientificG24 Çevresel ÇalkalayıcıNumune inkübasyonu 37 ° C'de; C (~ 150 rpm)
Konfokal lazer tarama mikroskobuLeicaDMI 6000 TCS SP5Örnek görüntüleme için ters konfokal mikroskop
FijiNIH (ImageJ)açık kaynaklı yazılım (v1.52h)ImageJ tabanlı görüntü işleme paketi
Uzun çalışma mesafesi suya daldırma objektifiLeica15506360HC PL APO 40x/1,10 W motCORR CS2
VibratomLeicaVT1200SÖrnek dilimleme
İş İstasyonuDellPrecision 7920CPU: Intel Xeon Gold 5118
GPU: Nvidia Quadro P5000
RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4
SSD: 2 TB
Birincil antikorlar
keçi anti-RABV NFriedrich-Loeffler-InstitutBakulovirüs eksprese edilen ve His-tag ile saflaştırılmış RABV nükleoprotein N
ile keçi bağışıklaması ile üretilen monospesifik poliklonal keçi anti-RABV N serumu Seyreltme: 1:400
Tavşan anti-GFAPDakoZ0334Poliklonal antikor (RRID: AB_10013382) < br / > Seyreltme: 1:100
Tavşan anti-MAP2Abcamab32454Poliklonal antikor (RRID: AB_776174)
Seyreltme: 1:250
Tavşan anti-RABV P 160-5Friedrich-Loeffler-InstitutBakulovirüs eksprese edilen ve His-tag ile saflaştırılmış RABV fosfoprotein P ile tavşan bağışıklaması ile üretilen monospesifik poliklonal tavşan anti-RABV P serumu (bkz. referans 23: Orbanz ve diğerleri, 2010)
Seyreltme: 1: 1.000
< güçlü > İkincil antikorlar< / güçlü >
Eşek anti-keçi IgG ThermoFisher Scientifickonjuge bağlı olarak floroforYüksek oranda çapraz emilir
Seyreltme: 1:500
Eşek anti-fare IgGThermo Fisher Scientifickonjuge florofora bağlı olarakYüksek oranda çapraz emilir
Seyreltme: 1:500
Eşek anti-tavşan IgGThermo Fisher Konjugeflorofora bağlı olarakBilimsel Yüksek çapraz emilimli
Seyreltme: 1:500
Keçi anti-fare IgGThermo Fisher Konjugeflorofora bağlı olarakYüksek oranda çapraz emilimli
Seyreltme: 1:500
Keçi anti-tavşan IgGThermo Fisher Konjugeflorofora bağlıbilimsel Yüksek çapraz emilimli
Seyreltme: 1:500
ile doldurulması bilimsel olarak

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pichat, J., Iglesias, J. E., Yousry, T., Ourselin, S., Modat, M. A Survey of Methods for 3D Histology Reconstruction. Medical Image Analysis. 46, 73-105 (2018).
  2. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  3. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
  4. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  5. Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
  6. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  7. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  8. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  9. Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).
  10. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  11. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-171 (2011).
  12. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  13. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
  14. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  15. Masland, R. H. Neuronal cell types. Current Biology. 14 (13), 497-500 (2004).
  16. von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
  17. Fooks, A. R., et al. Rabies. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17091(2017).
  18. WHO. WHO Expert Consultation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. , No. 1012 (2018).
  19. CDC. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5th Edition. US Department of Health and Human Services. , (2009).
  20. Arnold, M. M., et al. Effects of fixation and tissue processing on immunohistochemical demonstration of specific antigens. Biotechnic & Histochemistry. 71 (5), 224-230 (1996).
  21. Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
  22. Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry. The American Journal of Surgical Pathology. 24 (7), 1016-1019 (2000).
  23. Orbanz, J., Finke, S. Generation of recombinant European bat lyssavirus type 1 and inter-genotypic compatibility of lyssavirus genotype 1 and 5 antigenome promoters. Archives of Virology. 155 (10), 1631-1641 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kuduz Vir s G r nt lemeDoku Berrakla t rmaKonfokal Mikroskopi3B Projeksiyonmm nboyama ProtokolBABB D15 Berrakla t rmaSolvent Tabanl Berrakla t rmaDerin Doku G r nt lemeVir s Tropizm AnaliziN roinvazyon al mas

İlgili makaleler