Yöntem makalesi

Bütün Mount Epifluorescence kullanarak fare embriyogenez sırasında kalp odası gelişimin analizi

DOI:

10.3791/59413

⸱

17 Nisan 2019

 , 
1Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University, 3Vanderbilt Center for Stem Cell Biology, Vanderbilt University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz bütün Dağı epifluorescent mikroskobu ventrikül belirli MLC-2v-tdTomato muhabir çakma fareler disseke fare embriyosu üzerinde kullanarak fare kalp geliştirme incelemek için protokolleri mevcut. Bu yöntem her aşamasında emek yoğun histochemical yöntemleri olmadan fare kalp geliştirme sırasında ventrikül oluşumu doğrudan görselleştirmek için bize izin verir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralının amacı fare embriyo diseksiyon ve ventrikül belirli floresan muhabir çakma fareler (MLC-2v-tdTomato fareler) kullanarak kalp geliştirme sırasında embriyonik fare ventrikül odalarının görselleştirme için bir yöntem tarif etmektir. Kalp Geliştirme doğrusal kalbini tüp oluşumu, döngü kalbini tüp ve dört odası septation içerir. Bu karmaşık işlemler son derece tüm omurgalıların korunmuş. Fare embriyonik kalp kalp gelişim çalışmaları için yaygın olarak kullanmıştır. Ancak, kendi son derece küçük boyutu nedeniyle, fare embriyonik kalp anatomi teknik olarak zordur. Buna ek olarak, In situ hibridizasyon, beta galaktozidaz LacZ muhabir fareler veya immunostaining kesitli embriyonik kalplerin kullanarak boyama görselleştirme kez kardiyak odası oluşumu ihtiyacı var. Burada, fare embriyonik kalp incelemek ve doğrudan ventrikül odası oluşumu MLC-2v-tdTomato farelerin bütün Dağı epifluorescent mikroskobu kullanarak görselleştirmek nasıl açıklar. Bu yöntemle, doğrudan kalp tüp oluşumu ve döngü ve dört odası oluşumu fare embriyolar daha deneysel manipülasyon olmadan incelemek mümkündür. Ne kadar MLC-2v-tdTomato muhabir çakma fare çizgi bu protokol için bir örnek olarak kullanılır, bu iletişim kuralı diğer kalp özgü floresan muhabir transgenik fare satırlarına uygulanır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odası oluşumu kalp geliştirme sırasında birkaç morfolojik ayrı embriyonik aşamaları1,2ile geçiş karmaşık bir süreçtir. Kardiyak progenitör nüfus hücreleri hilal şeklinde bir doğrusal kalbini tüp oluşturur ve uzama ve gelişmekte olan kalp sarmal şekli oluşturmak için döngü sonra uğrar. Onun septation işleminden sonra gelişen kalp dört odacıklı kalp içine aktarılır. Bu işlemlerden herhangi bir kesinti gelişimsel kalp kusurları kaynaklanır. Böylece, odası oluşumu kalp geliştirme sırasında temel moleküler mekanizmaları anlamak önemlidir. Kalp geliştirme konusunda çok sayıda önceki çalışmalarda rağmen anlayışımız b....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan yordamları Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi Kurumsal hayvan bakım ve kullanım kurulu onayı ile gerçekleştirilmiştir.

1. fare embriyo koleksiyonu ve diseksiyonu

  1. 8-10 hafta yaşlı kadın MLC-2v-tdTomato+/- ile fareler MLC-2v-tdTomato elde etmek için 8-10 hafta eski erkek MLC-2v-tdTomato+ /- fareler dostum+/ +, MLC-2v-tdTomato+/- ve MLC-2v-tdTomato- / - embriyo.
  2. Vajinal fişler için baraj her sabah kontrol. Vajinal tak algılama gününde öğle E0.5 kabul edilir.
    Not:-meli var olmak kılınmak vajinal bir fiş algılamak için vajinal muayene (içinde 8-24 h sonra c....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kalp Geliştirme sırasında MLC-2v ventrikül odası belirtimi17için en erken marker olarak kabul edilir. Şekil 1' de gösterildiği gibi biz disseke fare tüm embriyo ve çakma MLC-2v-tdTomato muhabir fareler gelen embriyonik kalp ve kalp geliştirme sırasında MLC-2v-tdTomato muhabir ifade inceledi. MLC-2v-tdTomato muhabir çakma farelerde, epifluorescence bütün Dağı görüntüleme ile gelişen kalp bünye tdTomato ifade görüntülenir olarak erken E8.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan ventrikül veya kalp özgü yapısal genler veya proteinler etiketlemek için emek yoğun deneyler uygulamadan ventrikül odası geliştirme, incelemek nispeten basit yöntemdir. Bu nedenle, bu yöntemi sık sık immunostained kalp bölümlerde bulunan teknik variabilities en aza indirir.

Farelerin embriyonik yaş ve diseksiyon embriyonik kalplerin kesin tahmin dahil olmak üzere bu yöntemi başarıyla gerçekleştirmek için iki önemli adım vardır. Pratik olarak vajinal tanımlayan tarafından farel.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser NIH R03 HL140264 tarafından desteklenmiştir (Y.-J. N) ve Gilead Sciences araştırma bilim adamı programı (Y.-J. N).

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
diseksiyon mikroskobuLeicaMZ125
DNA merdiveni (100 bp)PromegaG2101
epifloresan diseksiyon mikroskobuLeicaM165 FC
GoTaq Green master MixPromegaM712
PCR makinesi (master cycler)Eppendorf6336000023

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. Myocardial lineage development. Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).
  2. Paige, S. L., Plonowska, K., Xu, A., Wu, S. M. Molecular regulation of cardiomyocyte differentiation. Circulation Research. 116 (2), 341-353 (2015).
    3. ....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fare Embriyonik Kalp DiseksiyonuMLC 2v tdTomato ReporteriKalp T p Olu umuOdac k SeptasyonuEmbriyo GenotiplemeFloresan MikroskobiVentrik ler Odac k G r nt leme

İlgili makaleler