Yöntem makalesi

iPSC Kaynaklı Kas Atalarında Distrofin Ekspresyonunun Geri Kazanilmesinde CRISPR/Cas9 Teknolojisi

7.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/59432

⸱

14 Eylül 2019

 ,  ,  ,  , 
1Medical College of Georgia, Augusta University

Bu makalede

Özet

Burada, Dmdmdx fare kaynaklı deri fibroblastlarından iPSC'de distrofin ekspresyonunu geri yüklemek ve Tet-on MyoD aktivasyon sistemini kullanarak iPSC'leri doğrudan miyojenik progenitor hücrelerine (MPC) ayırmak için Cas9 tabanlı ekson23 silme protokolü salıyoruz.

Özet

Duchenne musküler distrofi (DMD) distrofin genimutasyonları nedeniyle ciddi bir ilerleyici kas hastalığıdır, sonuçta kas atalarının tükenmesine yol açar. Kümelenmiş düzenli olarak uzaydan kısa palindromik tekrarlar/CRISPR ilişkili 9 (CRISPR/Cas9) gen düzenleme distrofin geninin ekspresyonunu geri getirme potansiyeline sahiptir. Otolog indüklenen pluripotent kök hücreler (iPSCs)-türetilmiş kas progenitor hücreleri (MPC) kök / progenitor hücre havuzu doldurmak, onarım hasarı, ve bir bağışıklık yanıtı neden olmadan DMD daha fazla komplikasyonları önlemek. Bu çalışmada, recovered distrofin protein ekspresyonu ile kas ataları elde etmek için CRISPR/Cas9 ve entegre olmayan iPSC teknolojilerinin bir kombinasyonunu sokulduk. Kısaca, Dmdmdx farelerin dermal fibroblastlarından bir iPSC hattı oluşturmak için entegre olmayan bir Sendai vektörü kullanıyoruz. Daha sonra, yeniden çerçevelenmiş distrofin geninin homolog olmayan bir uçla distropin ekspresyonunu geri yüklemek için CRISPR/Cas9 silme stratejisini kullanırız. 94 seçilmiş iPSC kolonisinden üç kolonide exon23 tükenmesinin PCR doğrulanmasından sonra, kas farklılaşmasının düzenlenmesinde önemli rol oynayan önemli bir transkripsiyon faktörü olan MyoD'nin doksisiklin (Dox) indüklenen ekspresyonu ile iPSC'yi MPC'ye ayırırız. Sonuçlarımız, DMD tedavisi için gelecekteki tedavilerin geliştirilmesi için önemli bir potansiyele sahip olan iPSC kaynaklı MPC'de distrofin ekspresyonunu geri yüklemek için CRISPR/Cas9 silme stratejisini kullanmanın fizibilitesini göstermektedir.

Giriş

Duchenne musküler distrofi (DMD) en sık görülen kas distrofilerinden biridir ve distrofin yokluğu ile karakterizedir, dünya çapında yaklaşık 5.000 yenidoğan erkek 1 etkileyen1. Distrofin gen fonksiyonunun kaybı ilerleyici miyofiberdejenerasyona yol açan yapısal kas defektleri ile sonuçlanır1,2. Rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAV) aracılı gen terapi sistemi, distrofin ekspresyonunu geri getirmek ve mikro-distrofinler (μ-Dys) kullanılarak gen replasmanı gibi kas fonksiyonlarını iyileştirmek için test edilmiştir. Ancak, rAAV yaklaşımı fonksiyonel protein ekspresyonunu sürdürmek için tekrarlanan enjeksiyonlar gerektirir3,4. Bu nedenle DMD'li hastalarda distrofin gen ekspresyonunu etkin ve kalıcı olarak kurtarabilecek bir stratejiye ihtiyacımız var. DMD için bir fare modeli olan Dmdmdx fare, erken sonlandırma kodonu ile sonuçlanan ve C-terminal distroglisan bağlayıcı etki alanından yoksun fonksiyonel olmayan bir kesilmiş proteinle sonuçlanan distrofin geninin ekson 23'ünde bir nokta mutasyonuna sahiptir. Son çalışmalar, küçükve büyük hayvan5,6,7doğru gen düzeltme veya mutant ekson silme ile distrofin gen ekspresyonunu geri yüklemek için CRISPR/Cas9 teknolojisinin kullanımını göstermiştir. Long ve ark.8 homoloji yönelimli onarım (HDR) tabanlı CRISPR/Cas9 genom düzenleme ile Dmdmdx fare germline disttrophin gen mutasyonu düzeltmek için yöntem bildirdi. El Refaey ve ark.9 rAAV'nin distrofik farelerde mutant ekson 23'ü verimli bir şekilde çıkarabileceğini bildirdi. Bu çalışmalarda, gRNA'lar intronlar 20 ve 23'te çift iplikli DNA kırılmalarına neden olacak şekilde tasarlanmıştır ve bu da homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) yoluyla DNA onarımı sonrası distrofin ekspresyonunu kısmen düzeltmiştir. Daha da heyecan verici, Amoasii veark. 10 son zamanlarda caninmodelleri, gelecekteki klinik uygulamada önemli bir adım distrofin ekspresyonu geri rAAV aracılı CRISPR gen düzenleme etkinliğini ve fizibilite bildirdi.

DMD de kök hücre bozukluklarına neden olur11. Kas hasarı için, konut kas kök hücreleri kas farklılaşması ndan sonra ölmekte olan kas hücrelerini doldurmak. Ancak, yaralanma ve onarım ardışık döngüleri kas kök hücrelerinde telomerlerin kısaltılmasına yol12, ve kök hücre havuzlarının erken tükenmesi13,14. Bu nedenle, distrofin ekspresyonunu geri yüklemek için genom düzenleme ile otolog kök hücre tedavisinin bir kombinasyonu DMD tedavisinde pratik bir yaklaşım olabilir. CRISPR/Cas9 teknolojisi, fonksiyonel kas rejenerasyonu için genetik olarak düzeltilmiş indüklenen pluripotent kök hücreler (iPSC) üretme ve immün reddedilmeye neden olmadan DMD'nin daha fazla komplikasyonunu önleme olanağı sağlar. Ancak, iPSC'lerin tümör oluşumu riski vardır, bu da iPSC'nin miyojenik progenitor hücrelere farklılaşması ile hafifletilebilir.

Bu protokolde, Dmdmdx farelerin dermal fibroblastlarının iPSC'lere yeniden programlanması ve daha sonra CRISPR/Cas9 genom deletion ile distrofin ekspresyonunun kurtarılması için sendai virüsünün entegre olmayan kullanımını açıklıyoruz. IPSC'de Exon23 deleasyonunun genotipleme ile doğrulanmasından sonra, genom düzeltilmiş iPSC'yi MyoD kaynaklı miyojenik farklılaşma yoluyla miyojenik progenitörlere (MPC) ayırdık.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan işleme ve cerrahi işlemler Augusta Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan bir protokol ile gerçekleştirildi. Fareler standart diyet ve su reklam libitum beslendi.

1. Erişkin Dmdmdx farelerden birincil fare fibroblastlarının izolasyonu

  1. Eutaize yetişkin Dmdmdx fareler (erkek, 2 aylık) CO2 boğulma ve torakotomi Tarafından IACUC Göre Georgia Tıp Koleji tarafından onaylanan, Augusta Üniversitesi. Laminar başlık altında steril bir durumda steril bir neşter ile kuyruk kesin. 5 dakika boyunca% 70 etanol ile kuyruk durulayın ve sonra steril fosfat tamponlu salin ile yıkayın (PBS) 6 cm çanak.
  2. Kuyruk derisini tabandan kuyruk derisi boyunca kuyruk ucuna keskin bir kesi ile soyun ve ardından cımbızla kuyruk derisini hafifçe soyun. Steril bir neşter kullanarak 1 mm3 boyutunda cilt kıyma ve dulbecco minimal temel orta / Ham's F12 (DMEM / F12) içeren 6 cm çanak için kıyma cilt dokusu taşımak 0.1% kollajenaz IV ve 1 U / mL dispase.
  3. Bir kültür kabındaki deri dokusunu %5 CO2 kuluçka makinesinde 37 °C'de 2 saat boyunca sindirin.
  4. Kap fibronektin ve 0.2% jelatin ile 6-iyi plaka (1 99 mL fibronektin 1 mL% 0.2 jelatin; Malzeme Tablosu) ve 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
  5. Sindirilmiş deri dokusunu 1 mL pipet ucu ile ayırın ve dokuyu ve süpernatantı steril 15 mL konik santrifüj tüpüne aktarın. Oda sıcaklığında 3 dakika için 217 x g santrifüj, supernatant atın ve fibroblast orta 1,5 mL pelet resuspend(Malzeme Tablosu).
  6. Kültür 6-iyi plaka fibronektin ile kaplanmış 6-iyi plaka üzerinde adım 1.5 ve 37 ° C, 5% CO2 kuluçka adım 1.4 gelen% 0.2 jelatin eksik sindirilmiş deri dokusu içeren pelet. İlk kaplamadan sonra 24 saat ortayı değiştirin ve her 48 saatte bir ortayı değiştirin.

2. Fare derisi fibroblastlarının iPSC'lere yeniden programlanması

  1. Transdüksiyondan iki gün önce, 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde hücre ayırma çözeltisi(Malzeme Tablosu)ile 1.6 adımdan fare dermal fibroblastlarını sindirin ve 5 dakika boyunca %5 CO2 nemli bir atmosfere sahip.
  2. 3 dk için 217 x g bir hemacytometer ve santrifüj kullanarak hücreleri saymak.
  3. 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde bulunan ve %5 CO2nemli atmosfere sahip fibroblast orta(Malzeme Tablosu)ile 6 kuyulu bir plaka ve kültür üzerine her kuyuda 1−2 x 105 hücre yoğunluğunda bulunan tohum hücreleri.
  4. Transdüksiyon gününde (0. gün), hücreleri tahmin edin ve ticari kılavuza göre 5, 5 ve 3 (yani KOS MOI = 5, hc-Myc MOI = 5, hKlf4 MOI = 3) enfeksiyonun hedef çokluğuna (MOI) ulaşmak için gereken her virüsün hacmini hesaplayın.

figure-protocol-1

  1. 37 °C'lik bir su banyosunda üç Sendai tüpünü 5−10 s'ye erteleyin ve üç Sendai tüpünün hesaplanan hacimlerini 1 mL fibroblast orta(Malzeme Tablosu)ekleyin.
  2. Adım 2.3 fibroblast orta çıkarın ve hücreleri içeren kuyulara yeniden programlama virüs karışımı ekleyin. Hücreleri bir gecede 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde %5 CO2nemli bir atmosfere sahip olarak kuluçkaya yatırın.
  3. Transdüksiyondan sonra orta yı taze fibroblast orta 24 saat ile değiştirin. Kültür bir hafta boyunca orta değişimi ile hücreleri her gün.
  4. Transdüksiyondan sonra 7.
  5. Kültür enfekte fare fibroblastlar adım 2.6 tam fare embriyonik kök hücre ile (ES) büyüme ortamı(Tablo Malzemeler)bir 37 °C inkübatör ile nemli bir atmosfer ile 5% CO2 ve günlük orta değiştirin.
  6. 8. günden itibaren, fare ES morfolojisi ile hücre kümelerinin görünümünü belirlemek için her gün ters bir mikroskop altında plaka gözlemleyin.

3. Alkali fosfataz canlı leke ve akış sitometri kullanarak yeniden programlama verimliliğini ölçmek için

  1. Kültür ortamını her kuyudan çıkarın ve DMEM/F-12 ile 2−3 dakika boyunca durula.
  2. 2 mL 1x alkalin fosfataz (AP) canlı leke çalışma solüsyonu (DMEM/F-12'de 1:500 seyreltme) yapışık hücrelere uygulayın ve 30 dakika boyunca %5 CO2 nemli atmosfere sahip 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.
  3. AP canlı leke aspire ve 5 dakika her pbs ile iki kez yıkayın.
  4. Hücreleri hücre ayırma çözeltisi(Tablo Malzemeler)ile 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde ve 5 dk için %5 CO2 nemli atmosfere sahip sindirin.

4. ES benzeri hücrelerin seçilmesi ve toplanması

  1. 2.8. basamaktaki kolonileri ters bir mikroskop altında inceleyin.
  2. Yemeğin altındaki kolonileri kendi kendine mürekkepli nesne işaretiyle işaretleyin.
  3. İşaretli hücre kolonilerini kapsayacak şekilde yağlanmış klonlama halkaları uygulayın. 37 °C'de 5 dakika boyunca her klonlama halkasına %0,05 tripsin/EDTA 100 μL ekleyin ve sindirilmiş hücreleri 100 μL pipet uçları yla mES büyüme ortamı içeren 48 kuyulu kültür plakalarına aktarın.
  4. Hücreleri 48 kuyulu kültür plakalarında 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde %5 CO2nemli atmosfere sahip olarak kuluçkaya yatırın. Hücreleri p'e ulaştıklarında 6 cm'lik bir tabağa kadar geçin.
  5. Tek tip yurt şeklindeki klonlar elde edilene kadar 4.3 ve 4.4 adımlarını birkaç kez tekrarlayın.

5. Kriyopreservation için dondurucu iPSCs

  1. Seçilen iPSC'leri 4.5 adımından trypsin, versene ve civciv plazması (TVP; Malzeme Tablosu) %5 CO2 kuluçka makinesinde 37 °C'de 30 dk çözeltisi.
  2. Hücreleri steril 15 mL konik tüpte toplayın ve oda sıcaklığında 3 dk için 217 x g'de santrifüj edin.
  3. Supernatant aspire ve tekrar şarjedici es dondurulmuş orta 2 mL hücre pelet askıya(Tablo Malzemeler) cryovial başına 1 mL elde etmek için.
  4. Cryovials hücreleri ekleyin ve kritik sağlayan bir dondurucu konteyner kullanarak dondurma, tekrarlanan -1 °C/dk soğutma oranı kriyopreservation için gerekli gecede -80 °C.
  5. Donmuş şişeleri sıvı nitrojen tankına aktarın.

6. IPSC'lerde kök hücre belirteçleri için immünofloresan boyama

  1. MES ortamı ile kültürlenmiş 5.1 adımdan, poli-D-lizin/laminin(Malzeme Tablosu)ile kaplanmış 8 kuyulu bir hazneye kadar tohum iPSC'leri, kuyu başına 1−2 x 104 hücre ve 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırmak için uygun yoğunlukta 48 saat için %5 CO2 nemlendirilmiş atmosfer.
  2. Slaytları oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %4 formaldehite batırın ve slaytları her seferinde 5 dakika boyunca iki kez PBS'ye batırın.
  3. Fare IgG-bloke reaktifi(Malzeme Tablosu)ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca %5 keçi serumu ile kuluçka bölümleri.
  4. Protein seyrelticilerinde primer antikorları seyreltin (fare-anti-SSEA1, 1:100, tavşan-anti-Nanog, 1:500; tavşan-anti-POU sınıf 5 homeobox 1 [OCT4], 1:500; tavşan-anti-SRY-box 2 [SOX2], 1:500; tavşan-anti-Lin-28 homolog A [Lin28A], 1:400) (Tablo Malzemeler). Hücrelere antikor uygulayın ve nemlendirilmiş bir odada gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
  5. Birincil antikor çözeltisini atın ve slaytları PBS'de 3x yıkayın.
  6. İkinci antikorlar uygulayın (Alexa488-konjuge keçi-anti-fare antikor ve Alexa555-konjuge keçi-anti-tavşan, 1:400 her) M.O.M. protein dilüent slaytlar ve oda sıcaklığında 45 dakika kuluçka.
  7. Slaytları PBS ve montaj bölümlerinde 4'6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) içeren montaj ortamı ile yıkayın.
  8. Konfokal mikroskopla fotoğraf çek.

7. In vivo iPSCs pluripotency araştırılması

  1. 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde TVP çözeltisi kullanarak 5.1 adımdan tek hücrelere ayırın ve 30 dk boyunca %5 CO2 nemli bir atmosfere sahip.
  2. 3 dk için 217 x g bir hemacytometer ve santrifüj kullanarak hücreleri saymak.
  3. Hücre nakli için 5 x 105 hücre/30 μL konsantrasyonda 1,5 mL steril santrifüj tüpte mES ortası ile pele'yi aspire edin ve yeniden askıya alın.
  4. Saç makası kullanarak immünoeksik farelerin her iki arka ekstremitesinden saç çıkarın.
  5. Ketamin (100 mg/kg) ile fareleranestezi ve% 75 alkol ile enjeksiyon sitesi temizleyin.
  6. Gastroknemiiçine 31 G iğne kullanarak 7.3 adımdan 30 μL iPSC süspansiyonenjekte edin.
  7. Enjeksiyondan iki hafta sonra fare gastroknemisini hasat edin ve optimum kesme sıcaklığına (OCT) bileşik, çabuk donma ve 5-μm kesitler15,16içine gömmek.
  8. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %4 formaldehitteki bölümleri düzeltin ve slaytları her seferinde 5 dakika pbs'de iki kez yıkayın.
  9. Oda sıcaklığında 1 saat için% 5 keçi serum protein dilüent ile hücreleri bloke.
  10. Slaytlara seyreltilmiş birincil antikor (tavşan anti-AFP, 1:50; tavşan anti-SMA, 1:50; tavşan anti-TH, 1:50) ekleyin ve nemlendirilmiş bir odada bir gecede 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
  11. Birincil antikor çözeltisini atın, PBS'deki hücreleri 3x (5 dk/yıkama) yıkayın, 1:400 adet seyreltilmiş Alexa555-konjuge keçi-anti-tavşan antikorlarını slaytlara ekleyin ve oda sıcaklığında 45 dakika kuluçkaya yatırın.
  12. PBS'de slaytları 3x (5 dk/yıkama) yıkayın ve DAPI içeren montaj ortamına sahip montaj bölümleri.

8. CRISPR/Cas9 lentiviral vektör hedefleme intronlarının distrofin eksexin eksyonu ile çevrili yapımı 23

  1. http://crispor.tefor.net/crispor.py yoluyla intron kanatlı distrofin ekson 23 hedefleyen gRNA oligos iki çift tasarla.
    NOT: Tasarlanan çiftler aşağıdaki gibidir:
    i22sense: 5'-CACCGTTAAGCTTAGGTAAAATCAA- 3'
    i22anti-sense: 5'-AAACTTGATTTTACCTAAGCTTAAC-3'
    i23sense: 5'-CACCGAGTAATGTGTCATACCTCT- 3'
    i23anti-sense: 5'-AAACAGAAGGTATGACACATTACTC-3').
  2. Sindirimi ve defosforilat 5 g lentiviral CRISPR plazmid (lenti-CRISPRv2-blast [Mohan Babu bir hediye] ve lenti-Guide-Hygro-iRFP670 [Kristen Brennand bir hediye]) (Malzeme Tablosu) BsmB1/Esp3I ile 30 dk 37 °C. 5 μg plazmid için, 3 μL BsmB1 enzimi kısıtlayın, 3 μL hızlı alkali fosfataz, 6 μL 10x enzim sindirimi tamponve 0.6 μL 100 mM DTT 60 μL reaksiyon ekleyin.
  3. Reaksiyonları %0.8 agarose jelüzerine yükleyin. Jeli 100−150 V'de 30 dk çalıştırın.
  4. Bir jel ekstraksiyon kiti(Malzeme Tablosu)ve 20 μL H2O içinde eute kullanarak sindirilmiş plazmid in-jel arındırın.
  5. 100 μM'de her oligonükleotitten 1 μL, 10x T4 ligasyon tamponunun 1 μL'sini, 0,5 μL T4 polinükleotid kinazını (PNK), 6,5 μL ddH 2 O ddH2O 37 °C'de 30 dk ve sonra 95 °C'lik dinve 5 m rampa için 95 °C'yi içeren gRNA oligonükleotidlarının her çifti fosforilasyon ve anneal 5 °C/dk'da 25 °C'ye kadar kendi
  6. PlentiCRISPR V2-Blast veya plentiGuide-Hygro-iRFP670 içine annealed gRNA oligonükleotidlerin bir 1:200 seyreltme ligate. BsmB1/Esp3I sindirilmiş vektörlerin 50 ng'sini 1 μL seyreltilmiş oligo dubleks ve 5°L 2x ligase tampon artı 1 000 ligaz 11 μL reaksiyon sisteminde karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.
  7. Üreticinin talimatlarına göre 3 μL ligasyon ürünü ile 50 μL yetkili hücrelere(Malzeme Tablosu)dönüştürme yapın.
  8. Dönüştürülmüş yetkin hücreleri 100 μg/mL carbenicillin ile bir agar plakaya yayın ve 31,5 °C'de 18 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
  9. 31,5 °C'de 100 μg/mL carbenicillin içeren 5 mL'lik müthiş et suyu(Malzeme Tablosu)içinde 10 μL steril pipet uçları ve kültürü olan kolonileri 31,5 °C,185 rpm bir shaker inkuvatörde 21 saat seçin.
  10. Plazmid DNA mini-hazırlık ve midi-hazırlık kitleri(Tablo Malzemeler)kullanarak arındırın.
  11. Mini hazırlık plazmidlerini kısıtlama sindirimine göre doğrulayın. 20 μL reaksiyon sistemi için 1 μg plazmid DNA, 2 μL sindirim reaksiyonu tamponu(Malzeme Tablosu)ve 1 μL restriksiyon enzim karışımı (0.5 μL KpnI-HF ve plentiCRISPR V2-Blast-i22 için AgeI-HF 0.5 μL; 0.5 μL NotI-HF ve 0.5 μL EcoHF-HRI-HRI için 0.5 μL plentiGuide-Hygro- iRFP670- i23). Reaksiyon sistemini 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
  12. Reaksiyonları %0.8 agarose jelüzerine yükleyin. Jeli 100−150 V'de 30 dk çalıştırın.
    NOT: PlentiCRISPR V2-Blast-i22 için doğru bantlar 622 bp ve 12,2 kb, plentiGuide-Hygro- iRFP670- i23 için doğru bantlar 2,6 kb ve 7,1 kb olmalıdır.

9. Lentiviral vektör ambalajı

  1. Kültür 7 x 105 293FT hücreler 5 mL DMEM media içeren 10% fetal sığır serumu içeren 6 cm çanak gecede 37 °C, 5% CO2.
  2. Bir kokteyl hazırlayın (1 μg plentiCRISPR V2-Blast-i22 veya plentiGuide-Hygro-iRFP670-i23, psPAX2 ambalaj plazmid 750 ng, pMD2.G zarf plazmid 250 ng ve transfeksiyon reaktif A 5 μL [Malzeme Tablosu] azaltılmış serum MEM media 100 μL).
  3. Azaltılmış serum MEM media'da 5 μL transfeksiyon reaktifi B(Malzeme Tablosu)karışımını hazırlayın.
  4. Adım 9.2 plazmid karışımına 100 μL transfeksiyon reaktif B karışımı ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka.
  5. 293FT hücrelere DNA-lipid kompleksi (adım 9.4) dropwise ekleyin. Bir gecede %5 CO2ile 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
  6. Ertesi gün her çanağa virüs üretim arttırıcı (500x)(Malzeme Tablosu)ekleyin ve 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın, %5 CO2.
  7. Önümüzdeki iki gün boyunca pipetler kullanarak hücrelerden orta toplayın ve hücreleri kaldırmak için 0,45 μm filtre ile orta filtre.

10. Lentiviral vektörlerin konsantrasyonu ve saflaştırılması

  1. 5x polietilen glikol 4000 (PEG4000, % 8,5 nihai konsantrasyon) ve 4 M NaCl (0,4 M son konsantrasyon) ile 4 °C'de bir gecede 9.7 adım ın ortasında lentiviral vektörü çökeltin.
  2. PEG4000 çözeltisini içeren viral ortamı 2.095 x g ve 4 °C'de 30 dk için santrifüj edin, süpernatantı çıkarın ve atın.
  3. 500 μL serum azaltılmış MEM media (lentivirus titreşin: lenti-CRISPR V2-gRNAi22: 1.56 x 108, lenti-iRFP67 0-gRNAi23: 1.3 x 108, lenti-CRISPR V2-kontrol: 3.13 x 107, lenti-iRFP670-kontrol: 5.9 x 107 ). Kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.

11. Cas9 ile birleştiğinde iki kılavuz RNA (gRNA) ile fare iPSCs exon 23 silme

  1. Fibronektin ve jelatin ile kaplanmış 24 kuyulu bir plaka içinde adım 4.5'ten fare iPSC'leri plakalayın.
  2. Hücreler P birleştiğinde, 8 g/mL polibren içeren taze kültür ortamına (tam fare embriyonik kök hücre büyüme ortamı) geçiniz.
  3. Lenti-CRISPR V2-gRNAi2, lenti-iRFP670-gRNAi23 ve kontrol (boş vektör: lenti-CRISPR V2, lenti-iRFP670) fare iPSC'lerine dahil olmak üzere 10.3 adımdan merceksi partikül çözeltisinin 100 μL'sini ekleyin. 37 °C'de %5 CO2ile 3 gün boyunca kuluçka ya.
  4. Enfekte olmayan hücreyi öldürmek için gerekli olan blasticidin ve higromisin B konsantrasyonunun minimum konsantrasyonu belirleyerek 2,5 g/mL blasticidin ve 100 μg/mL higromisin B içeren ortama sahip enfekte hücreleri seçin.
    NOT: Enfekte olmayan hücreler blasticidin ve higromisin B tarafından öldürülür.
  5. Seçilen fare iPSC'lerini her biri iyi (24 kuyuplaka) 0,5 mL TVP çözeltisi ile sindirin ve 30 dk 37 °C'de %5 CO2ile inkübasyon hücreleri.
  6. IPSC'leri pipetleme yaparak tek hücrelere ayırın, hücreleri hücre sayma odasıyla sayın ve daha sonra mES ortası ile 150 sindirilmiş tek hücreyi %5 CO2ile 37 °C'de kültür için 10 cm'lik bir tabağa seyreltin.
  7. Yaklaşık 10 gün sonra, 10 μL steril pipet uçları kullanarak ters mikroskop altında tek koloniler seçin (96 koloninin seçilmesi gerekir).
  8. Toplanan kolonileri her kuyuda 50°L TVP çözeltisine (96 kuyulu plaka, her kuyuda bir koloni) aktarın, 37 °C'de 30 dakika sindirin ve sindirilmiş hücreleri kültürü korumak için iki adet 96 kuyulu kültür plakasına (biri genotipleme için) yerleştirin.
  9. 37 °C'de p'e kadar co2 kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.

12. exon23 silme ile iPSC kolonilerinin tanımlanması

  1. Hücre kolonileri p birleştiğinde 96 kuyulu plakadaki ortamı çıkarın.
  2. Her kuyuya proteinaz K çözeltisi(1mL proteinaz K in 100 mL lysis reaktifinde 1 mL proteinaz K) içeren 25 μL lysis reaktifi ekleyin ve lysate'yi 96 kuyulu bir PCR plakasına aktarın.
  3. PCR plakasını kapatın ve plakaları 55 °C'de 30 dk, sonra 95 °C'de 45 dk'da inkübe edinerek hücreleri inceleyin ve proteinase K'yi denadirin.
  4. 12.3 adımdan 2 μL lysate ile PCR reaksiyonu gerçekleştirin. 20 μL PCR reaksiyonu için 2 μL lysate, 10 μL 2x DNA polimeraz premixi(Malzeme Tablosu),7 μL DNase içermeyen su ve 1 μL DMD ekson 23 astar(Tablo 1)ekleyin.
  5. PCR reaksiyonu için aşağıdaki parametreleri kullanın: 1 dk için 98 °C, 10 s için 98 °C'nin 35 döngüsü, 15 s için 60 °C, 30 s için 72 °C ve 1 dk için 72 °C'de son bir uzatma.
  6. PCR reaksiyonu %2'lik agarose jelüzerine yükleyin. Jeli 100−150 V'de 30 dk çalıştırın.
  7. UV ışığı altında jel inceleyin (nakavt verimliliği 3/94).

13. IPSC'yi doğrudan miyojenik progenitor hücrelere (MPC) ayırmak için Tet-on MyoD aktivasyon sistemini kullanma

  1. Paket LV-TRE-VP64-fare MyoD-T2A-dsRedExpress2 ve LV-TRE-VP16 fare MyoD-T2A-dsRedExpress2 (Charles Gersbach bir hediye) (Malzeme Tablosu) daha önce lenti-CRISPRv2-blast ve lenti-gRNA-iRFP670 vektörleri bölümlerde açıklandığı gibi 9 ve 10.
  2. Fare iPSC'ye lentivirus-TRE-VP64-MyoD-T2A-dsRed-Express2 veya lentivirus-TRE-VP16-MyoD-T2A-dsRedExpress2 daha önce lenti-CRISPRv2-blast ve lenti-gRNA-iRFP670 vektörleri için 11.1−11.3 adımlarında açıklandığı gibi bulaştırın.
  3. Saf transdükse hücre popülasyonu elde etmek için üç günlük enfeksiyondan sonra 1 μg/mL puromisin içeren hücreleri seçin.
  4. MPC farklılaşmasına kültür ortamına ( FBS DMEM) 3 g/mL doksisiklin ekleyin. Her iki günde bir doksisiklin ile takviye taze orta değiştirin.

14. Dinamik kas farklılaşması ve DMD ekson 22-24 ekspresyonu değerlendirmek için kantitatif ters transkripsiyon PCR

  1. RNA izolasyon reaktifi kullanılarak doksisiklin tedavisinden sonra 0, 3, 6 ve 10 gün sonra hücresel RNA ayıklayın, ilk iplikçik cDNA sentez kiti(Tablo Malzemeler)kullanılarak tersten RNA'yı cDNA'ya dönüştürün.
  2. 20 μL qPCR reaksiyon sistemi için 1°L cDNA, 10 μL PCR reaksiyon tamponu(Malzeme Tablosu),8 μL DNA H2O ve 1 μL ileri ve ters astar karışımı (gliserindehit-3-fosfat dehidrogenaz [GAPDH], iskelet kası [ACTA1], OCT4 ve DMD exon22, DMD exon23 ve DMD exon24, bkz.
  3. PCR reaksiyonu için aşağıdaki parametreleri kullanın: 2 dk için 50 °C, 2 dk için 95 °C, 15 s için 95 °C'nin 40 döngüsü, 1 dk için 60 °C, erime eğrisi 65,0 °C ila 95,0 °C, artış 0,5 °C.

15. Miyozin ağır zincir 2 (MYH2) ve distrofin protein ekspresyonunun immünoresans boyantisi

  1. Plaka doksisiklin indüklenen, lenti-TRE-MyoD modifiye hücreleri adım 13.4 8-iyi kültür slaytlar üzerine.
  2. Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %4 formaldehit halinde sabitlayın ve slaytları her seferinde 5 dakika boyunca PBS'de iki kez yıkayın.
  3. Oda sıcaklığında 1 saat için% 5 keçi serum protein dilüent ile hücreleri bloke.
  4. Kaydıralara tavşan-anti-distrofin antikor (1:300) ve fare-anti-MYH2 antikor (1:100) ekleyin, nemlendirilmiş bir odada bir gecede 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
  5. Birincil antikor çözeltisini atın, PBS'deki hücreleri 3x (5 dk/yıkama) yıkayın, 1:400 seyreltilmiş Alexa488-konjuge keçi-anti-tavşan antikorve Alexa555-konjuge keçi-anti-fare antikorslaytlar ve oda sıcaklığında 45 dakika kuluçka ekleyin.
  6. PBS'deki slaytları 3x (5 dk/yıkama) ve DAPI içeren montaj ortamına monte eden bölümleri yıkayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Dmdmdx deri fibroblastlarının kurulması iPSC türetilmiştir. Dmdmdx farelerden, entegrasyoniçermeyen yeniden programlama vektörlerini kullanarak deri fibroblastından elde edilen fare iPSC'lerinin üretilmesinin verimliliğini gösterdik. Şekil 1A, embriyonik kök hücre (ESC) benzeri kolonilerin enfeksiyondan üç hafta sonra ortaya çıktı. Canlı alkali fosfataz (AP) lekesi ile iPSC indüksiyonunun etkinliğini değerlendiriyoruz; Şek...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Duchenne Musküler Distrofi (DMD) yıkıcı ve sonuçta ölümcül kalıtsal bir hastalık distrofin eksikliği ile karakterize, ilerleyici kas atrofisi yol1,2. Sonuçlarımız, CRISPR/Cas9 aracılı ekson23 silme yaklaşımı ile Dmdmdx iPSC kaynaklı miyojenik progenitor hücrelerinde geri yüklenen distrofin gen ekspresyonunu göstermektedir. Bu yaklaşımın üç avantajı vardır.

İlk olarak, entegre olmayan bir RNA vektörü kullanarak Dmdmdx

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Tang ve Weintraub kısmen NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354 tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Cerrahi Aletler
31 gauge iğneÇeşitli 
Keskin İnsizyonÇeşitli 
Steril NeşterlerÇeşitli 
CımbızÇeşitli 
Fibroblast besiyeri (100 mL tam besiyeri için)ŞirketKatalog NumarasıHacim
2-Merkaptoetanol (55 mM)Gibco21-985-0230.1 mL
Antibiyotik Antimikotik Slution 100xCORNINGMT30004CI1 mL
Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium - yüksek glikozSIGMAD642987 mL
Fetal Sığır Serumu KarakterliHyCloneSH30396.0310 mL
L-Glutamin çözeltisiSIGMAG75131 mL
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100x) Gibco111400761 mL
TVP çözeltisi (500 mL tam çözelti için)ŞirketKatalog NumarasıHacim
Tavuk SerumuGibco16110-0825 mL
EDTASigma-AldrichE6758500
Fosfat tamponlu salin
mES büyüme ortamı (500 mL tam çözelti için)ŞirketKatalog NumarasıHacim
2-Merkaptoetanol (55 mM)Gibco21-985-0230.5 mL
Antibiyotik Antimikotik Slution 100xCORNINGMT30004CI 5 mL
Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Orta - yüksek glikozSIGMAD6429408.5 mL
Fetal Sığır Serumu Karakterizeedilen HyCloneSH30396.0375 mL
L-Glutamin çözeltisiSIGMAG75135 mL
Fare rekombinant Lösemi İnhibitör Faktörü (LIF), 0.5 x 106 U / mLEMD Millipore CorpCS210511500 &; L
MEK / GS3 İnhibitör TakviyesiEMD Millipore CorpCS210510-500UL500 & mu; L
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler Çözeltisi (100x) Gibco111400765 mL
ES hücre ortamı 4 haftadan fazla ve inhibitörlerle 2 haftadan fazla saklanmamalıdır.
mES dondurulmuş ortam (50 mL tam çözelti için)ŞirketKatalog NumarasıHacim
Dimetil sülfoksit (DMSO)SIGMAD26505 mL
Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Orta - yüksek glikozSIGMAD642924.9 mL
Fetal Sığır Serumu Karakterize HyCloneSH30396.0325 mL
Fare rekombinant Lösemi İnhibitör Faktörü (LIF), 0.5 x 106 U / mLEMD Millipore CorpCS21051150 &; L
Malzeme/Ekipman AdıŞirket Katalog NumarasıRRID
%0,05 Tripsin/0,53 mM EDTACORNING25-052-CI
%4 ParaformaldehitThermo scientificJ19943-k2
Aktataz çözeltisiSIGMAA6964Hücre ayırma çözeltisi
AgeI-HFNEBR3552L
Alexa488-konjuge keçi-anti-fare antikoruInvitrogenA32723AB_2633275
Alexa488-konjuge keçi-anti-tavşan antikoruInvitrogenA32731AB_2633280
Alexa555-konjuge keçi-anti-tavşan antikoruInvitrogenA32732AB_2633281
anti-AFPTermo bilimselRB-365-A1AB_59574
anti-&alfa;-Pürüzsüz Kas Aktin (D4K9N) XPCST19245SAB_2734735
anti-DistrofinThermoPA5-32388AB_2549858
anti-LIN28A (D1A1A) XP     CST8641SAB_10997528
anti-MYH2DSHBmAb2F7AB_1157865
anti-Nanog-XPCST8822SAB_11217637
anti-Oct-4A (D6C8T)CST83932SAB_2721046
anti-Sox2abcamab97959AB_2341193
anti-SSEA1(MC480) CST4744sAB_1264258
anti-TH (H-196)SANTA CRUZ SC-14007AB_671397
Alkalin Fosfataz Canlı Leke (500x)ThermoA14353
Blasticidin SSigma-Aldrich203350
BsmBI/Esp3INEBR0580L/R0734L
KarbenisilinMillipore205805-250MG
Kollajenaz IV Worthington Biochemical CorporationLS004189
Yetkili HücrelerTakaRa 636763
CutSmart NEBB7204S
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Yeniden Programlama KitiThermoA16517
DirectPCR Lizis Reaktifi (hücre)VIAGEN BIOTECH302-C
Dispas (1 U/mL)STEMCELL Teknolojileri7923
BP26535Doksisiklin HidroklorürFisher BiyoReaktifleri
Fibronektin sığır plazmasıSIGMAF1141
ve nbsp;
QIAEX II Jel Ekstraksiyon Kiti (500)		QIAGEN20051
Domuz derisinden elde edilen jelatin, tip ASIGMAG1890
VectorH-1500ile HardSet Antifade Montaj Ortamı
İnvitrojen10687010
Ketamin HCL EnjeksiyonuHENRY SCHEIN HAYVAN SAĞLIĞI45822
KpnI-HFNEBR3142L
lenti-CRISPRv2-blastAddgene83480
lenti-Guide-Hygro-iRFP670Addgene99377
Lipofectamin 3000 Transfeksiyon KitiInvitrogenL3000015
LV-TRE-VP64-fare MyoD-T2A-dsRedExpress2   Addgene60625
LV-TRE-VP16 fare MyoD-T2A-dsRedExpress2Addgene60626
Fare üzerinde Fare (MOM) Temel KitVektörBMK-2202
NotI-HFNEBR3189L
Opti-MEM I Azaltılmış Serum OrtamıThermoFisher31985070
Polietilen glikol 4.000Alfa AesarAAA161510B
PolybreneSIGMATR1003
Corning  BioCoat Poly-D-Lizin/Laminin Kültür SlaytıCORNINGCB354688
PowerUp SYBR Green Master MixThermoFisherA25742
PrimeSTAR Max PremixTakaRaR045
Proteinaz KVIAGEN BIOTECH507-PKP
Puromisin DihidroklorürMP BiyomedikalICN19453980
qPCR Lentivirus Titrasyon KitiabmLV900
Hızlı ligasyon kitiNEBM2200S
QIAprep Spin Miniprep Kiti (250)QIAGEN27106
QIAGEN Plazmid Plus Midi Kiti (100)QIAGEN12945
RevertAid RT Ters Transkripsiyon KitiThermo scientificK1691
RNAzol RTMoleküler Araştırma Merkezi, INCRN 190
T4 DNA Ligaz Reaksiyon TamponuNEBB0202S
T4 Polinükleotid KinazNEBM0201S
Müthiş Et Suyu ModifiyeFisher BioReagentsBP9729-600
ViralBoost Reaktifi (500x)ALSTEMVB100
mL Tripsin (%2,5) Termo 15090046 5 mL'ye kadar 186 mg EcoRI-HF NEB R3101L DAPI Higromisin B (50 mg / mL)

Kaynaklar

  1. Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
  2. Batchelor, C. L., Winder, S. J. Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy. Trends Cell Biology. 16 (4), 198-205 (2006).
  3. Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
  4. Bengtsson, N. E., Seto, J. T., Hall, J. K., Chamberlain, J. S., Odom, G. L. Progress and prospects of gene therapy clinical trials for the muscular dystrophies. Human Molecular Genetics. 25 (R1), R9-R17 (2016).
  5. Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351 (6271), 407-411 (2016).
  6. Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 400-403 (2016).
  7. Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 403-407 (2016).
  8. Long, C., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).
  9. El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).
  10. Amoasii, L., et al. Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 362 (6410), 86-91 (2018).
  11. Eisen, B., et al. Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).
  12. Marion, R. M., et al. Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).
  13. Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
  14. Sacco, A., et al. Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice. Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).
  15. Su, X., et al. Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
  16. Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).
  17. Ousterout, D. G., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nature Communications. 6, 6244(2015).
  18. Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
  19. Glass, K. A., et al. Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties. Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

CRISPR Cas9 Gen D zenlemeDistrofin Ekspresyonunun Geri Kazand r lmasDuchenne Musk ler DistrofiHomolog Olmayan U Birle mesiEkzon 23 DeltasyonuMyoD ile nd klenen DiferansiyasyonSendai Vekt r ReprogramlamaPCR Do rulamaAgaroz Jel Elektroforezi

İlgili makaleler