Fonksiyon kazancı Reporter sistemleri ile spesifik Mikobakteriyel güvenirlik oranlarının ölçülmesi

Summary

Bu yazıda, metod Mycobacterium, Mycobacterium smegmatis, kazanç-of-Function Reporter sistemleri kullanarak translasyonel hata ve güvenme belirli oranlarını ölçmek için iki tamamlayıcı yöntemler sunuyoruz. Daha yüksek verimlilik ayarında düşük verim veya göreli hata oranlarında doğru hata oranlarını ölçmek için yöntemler kullanılabilir.

Abstract

Genlerin proteinlere çevirisi hatalara eğilimli. Model sistemlerinde translasyonel hatanın ortalama oranı, Codon başına 1/10000 olarak tahmin edilse de, gerçek hata oranları, türe, ortama ve incelenmekte olan kodonlara bağlı olarak yaygın olarak değişir. Daha önce mycobakterilerin aminoacylated glutamin ve Asparagin trnas üretimi için iki adımlı bir yol kullanacağı ve bu özellikle bir tarafından güvenmeyen oranlar modülasyonu nedeniyle nispeten yüksek hata oranları ile ilişkili olduğunu göstermiştir Pathway temel bileşeni, ayıtransferaz GatCAB. Biz bir daha önce istihdam Renilla-Firefly çift luciferase sistemi bu glutamin içinde glutamat belirli güvenimsiz oranları ölçmek için mycobakteriler kullanmak Için Escherichia coli güvensiz oranları ölçmek için kullanılan olmuştu , Asparagin codonlar için aspartat. Bu muhabir sistemi belirli hata oranlarının doğru tahmini için uygun olmasına rağmen, duyarlılık ve aşırı manipülasyon adımları için gereksinimler eksikliği yüksek verimlilik uygulamaları için uygun yapılmadı. Bu nedenle, orta/yüksek verimlilik ayarlarına daha fazla imkan veren nluc Lusiferaz ve yeşil floresan proteini (Gfp) kullanarak ikinci bir fonksiyon kazanç-of-Function Reporter sistemi geliştirdik. Bu sistemi, kasugamisin 'i küçük bir molekül olarak tanımlamak için kullandık. Burada tarif ettiğimiz gazetecilerin belirli Mikobakteriyel güvenme türlerini ölçmek için kullanılmasına karşın, bir dizi model sisteminde diğer tür güvenikleşme türlerini ölçmek için değiştirilebilir.

Introduction

Moleküler biyolojide bilgi akışı, genetik bilginin fonksiyonel proteinlere çevrilmesini gerektirir. Tüm biyolojik sistemlerde olduğu gibi gen çevirisi de ölçülebilir hatalar içerir. Çeviride hata oranlarının tahminleri genellikle kodon başına yaklaşık 1/10000 olarak alıntı yapılır (Ribas de pouplana ve al.¹tarafından incelenir). Ancak, hata oranları yaygın olarak, 10^-5 ' ten daha az 0.05/Codon^1,2,3,4,5için farklılık gösterir. Üç büyüklüğün üzerinde sipariş kapsayan hata oranlarının geniş yelpazesi, hatalarının çeviri yolunda birden çok adımda ortaya çıkabileceği gerçeğini oluşturmaktadır: aminoacilasyon⁶ ' da Stokastik, mutasyonel veya stres kaynaklı hatalardan, ^{7 , 8 , 9 , 10}, asparaginil ve glutaminil-trnas⁵fizyolojik misacylation, veya ribozomal kod çözme hataları^2,3,11. Ölçülebilir derecede yüksek hata oranları, 0.01/Codon üzerinde temsil eden, translasyonel hataların fizyolojik fonksiyonları^1,12 gerçekleştirebilir ve bu yanlış tercüme içeriğe özgü¹³olabilir önerdi.

Biz ve diğerleri, özellikle çevresel stres^{1,5,12,14,15,}16 sırasında, gen çevirisine doğal olarak ortaya çıkan hataların adaptif olabilir göstermiştir ^,17,18. Mykobakterilerde, iki adımlı dolaylı glutamin/Asparagine tRNA aminoacilasyon yolu tarafından oluşturulan hatalar^19,20 ilk satır antitüberküloz antibiyotik rifampisin için son derece artan tolerans sonucu ⁵. bu nedenle, küçük bir molekül ile Mikobakteriyel güvenmezleşme azalan rifampisin tarafından öldürme potansiyate olabilir spekülasyonlar. Doğal olarak ortaya çıkan aminoglikozid kasugamisin, mycobakteriyel güvenirlilik azalmasına neden olabilecek bir bileşik olarak tespit ettik, hem in vitro hem de vivo²¹yılında mycobacterilerin rifampisin aracılı öldürülmesini güçlendirdik ve Tüberküloz²² -dünyanın en ölümcül patojen küresel kontrolünü tehdit eden rifampisin direnci²¹, ortaya çıkması.

Translasyonel hatayı incelemek için, güvenme ölçümü için yöntemlerin istihdam edilmesi gerekir. Her avantaj ve dezavantajları ile, güvenme ölçümü için geliştirilen birden fazla yöntem vardır. Kısaca, hassas Kütle Spektrometrisi tabanlı yöntemlerin birçok avantajı vardır, en önemlisi, birden çok türde translasyonel hatanın algılanması için yeni algoritmalar ile, istenmeyen hatların nispeten tarafsız bir ölçümü olabilir gerçekleştirilen¹⁸. Ancak, kütle spektrometresi deaminasyon güvenirlik olayların ölçülmesi için çok uygun değildir — hata eğilimli dolaylı tRNA aminoacilasyon yolu nedeniyle mykobakterilerde oluşan güvenirlik tam türü. Bunun nedeni, kütle spektrometresi²³için numunelerin işlenmesinde oluşan yüksek frekanslı nonenzimatik deamidasyon, son derece yüksek bir arka plan sinyali ile sonuçlanır. Bu nedenle, bu yol hataları tespiti için, genetik kazanç fonksiyonu muhabirleri farklı avantajlar sunar. Özellikle, uygun kazanç fonksiyonu muhabirleri son derece düşük arka plan oranları olabilir, çok düşük hata oranları ölçümü sağlayan¹¹.

Patojenik Mycobacterium tüberküloz ile deneyler yapmak, özel tesisler ve ekstra önlemler gerektirdiğinden, patojenik olmayan Mycobacterium M. smegmatis 'te en çok deneyleri gerçekleştiriyoruz ve daha önce iki tür arasındaki sonuçlar büyük ölçüde karşılaştırılabilir^5,21. Dolaylı tRNA aminoacilasyon yolu tarafından oluşturulan mikobakterilerde güvenme oranlarını ölçmek için, daha önce E. coli 'de ribozomal kod çözme hatalarını ölçmek için geliştirilen Renilla-Firefly çift luciferase sistemini değiştirdik. ¹¹ mikobakterilerde kullanım için. Biz üç özel değişiklikler yaptı: orijinal muhabir mycobakteriler verimli ifade vermedi, ve bu nedenle, sıra Codon optimize edilmiş ve Firefly luciferase C-Terminal üç amino asitler, serine-lizin-leucine, hangi olmuştur Bazı sistemlerde bir kaçakçılık sinyali olarak açıklamalı²⁴, ısoleucine-alanine-valine²⁵değiştirildi. Orijinal gazetecinin, ateş böceği Lusiferaz 'da kritik bir lizin kalıntısı vardı. Bunun yerine, Renilla Lusiferaz 'da kritik olarak bulunan bir aspartat (D120) veya glutamat (E144) kalıntılarını sırasıyla²⁵ (Şekil 1) Asparagin ve glutamin olarak mutasyona uğratıldık. Muhabir episomal tetracycline indüklenebilir Plasmid pUV-tetOR içine subklonlanmış ( malzeme tablosunabakın). Fonksiyon kazanımı muhabirleri, işlevsel olmayan bir şekilde işleyen enzim/floresan proteinlerde kritik olarak kullanılan işlevsel kalıntıları mutasyona eder^11,26. Protein fonksiyonel varyantı sentezlemek translasyonel (veya teorik olarak, transkripsiyon) hataları, çevrilmiş proteinlerin bir alt kümesinde ölçülebilir enzim aktivitesi neden olur. Protein bolluk varyasyonu için düzeltmek için, mutasyona uğramış muhabir bir benchmark olarak hareket eden fonksiyonel bir protein ile ifade edilir ve kazanç-of-fonksiyon¹¹doğru ölçümleme sağlar. Renilla-Firefly Dual-luciferase muhabiri, özel Mikobakteriyel güvenirlik oranlarının doğru ölçümü için izin verdi^5,25 (Şekil 2 ve Bölüm 1 protokol), biz hızlı Bu, güvenme hızını değiştirecek moleküllerin orta/yüksek verim taraması için uygun olmadığını fark etti. Bu esas olarak iki nedenden dolayı, yani, a) Renilla Lusiferaz potens göreceli eksikliği en az 1 ml mycobakteriyel kültür/örnek, güvensizlik oranlarını ölçmek için gerekli olduğu anlamına geliyordu ve b) hücrelerin lizis gereksinimi önce enzim aktivite ölçümü için aşırı manuel elleçleme gerekli: mycobakteriyel hücreler kalın ve çok katmanlı bir hücre duvarı ve liziz nispeten dayanıklıdır zarf var. Bu nedenle, küçük hacimlerle (örn. 96-kuyu plaka sisteminde) kullanılabilecek ve ölçümler için hücre-liziz gerektirmeyen yeni bir kazanç-fonksiyon muhabiri sistemi geliştirmek için araştırdık. Biz son derece güçlü nluc Lusiferaz kullanılan ve kritik bir aspartat kalıntı tespit, Asparagine mutasyona uğramış, sonuçlanan 2 fonksiyon kaybı günlükleri (Şekil 1). Ayrıca, nluc küçük boyutu bir N-terminal salgılanması sinyal etiketi-antijen 85A, mycobakteriler²⁷ büyük bir salgılanmış antijeni-bu nluc kültür süpernatant içine salgılanmasını ve gerekliliğini aşmak için izin verecek izin hücre Lysis. Kıyaslama proteini, GFP, mutasyona uğramış Nluc olarak aynı organizatörden ifade edildi, ancak entegre bir vektörden ( malzeme tablosunabakın), ve bozulmamış hücreler²¹ (Şekil 3) ölçülür. Bu avantajlara rağmen, Nluc/GFP muhabiri (protokolün 2. bölüm) de dezavantajları vardır: Nluc aktivitesinde nispeten mütevazı azalma (100-Fold) D140N mutasyonu ile son derece düşük güvensizlik oranlarının ölçülmesine izin vermez, muhabiri translasyonel hatanın doğru ölçümleri için daha bir tarama aracı olarak daha uygun hale. Ayrıca, Nluc hiçbir kritik glutamat kalıntıları vardır; Bu nedenle, sadece Asparagine-aspartat hata oranları ölçülmüş olabilir. Bu çalışmalarında açıklanan genel ilkeler, araştırmacıların kendi model sistemindeki diğer özel translasyonel hata oranlarının doğru ve/veya facile ölçümü için uygun olarak gazetecileri yaptığımız veya değiştirdiği gibi bu muhabirleri kullanmalarına izin vermelidir. Seçim.

Protocol

1. Renilla-Firefly Dual-luciferase Reporter

Not: Bu yöntemin görsel bir gösterimi için bkz: Şekil 2.

1. 2 mL 7H9 orta ile-80 °C stoktaki ınoculate mycobakteriyel muhabir suşları. Wild-tipi Dual-luciferase yanı sıra mutasyona uğramış Renilla (muhabir) suşları, güvenirlik oranlarının hesaplanmasına izin vermek için kullanılması gerekir (bkz. Adım 1,7). 37 °C ' de 1 ile 2 gün arası OD₆₀₀ sabit aşamaya ulaşıncaya kadar sallayın (OD > 3).
2. Aliquot ve 0,1 civarında od_600nm için seyreltik-0,5. Tipik deneyler için, üç bağımsız biyolojik çoğaltmak kültürler kullanın. Anhydrotetracycline (ATC), muhabir ifadesinin tetrasiklin analog indükleştirici (hangi bir tetrasiklin-indüklenebilir Promoter tarafından kontrol edilir) son konsantrasyon 50 ng/ml.
3. Üzerinde kasugamycin etkilerini ölçmek için yanlış tercüme oranları²¹, kültürüne kasugamisin farklı dozlarda ekleyin (bkz Şekil 4 belirtilen dozlarda) aynı zamanda (test dozlarda, kasugamisin hiçbir Antimikrobiyal aktivite vardır). Her muhabir için en az bir indüklenen denetim eklemek önemli olduğunu unutmayın. 37 °C ' de 4-6 h için kültür-endüstriyel kültürler sallayarak.
4. Bakteri kültürlerini 2 mL 'Lik bir tüpe aktarın ve 3.220 x g 'de santrifüjün oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bakterileri aşağı doğru Pelet yapın. Süpernatant atın.
5. Çift distile su içinde seyreltilmiş (1:1) olan 1x pasif liziz tamponu (çift luciferase kiti ile birlikte verilir) 40 μL ekleyerek bakterileri bozunun. Resuspended bakteriyel lysate beyaz 96-kuyu plakası, bir iyi örnek başına ve 20 dakika oda sıcaklığında sallayın aktarın.
   Dikkat: Lizis tampon (30 dakikadan fazla) içinde bakteri inkübe etmeyin.
6. Her iyi için 80 μL Firefly substrat ekleyin, 15 s için sallayın ve entegrasyon süresi olarak 1.000 MS ile luminometrenin Luminesans ölçmek. Pipetleme hatalarını önlemek için otomatik enjektör veya çok kanallı pipet kullanın.
7. Ekle 80 μL Renilla substrat her iyi, 15 s için sallayın ve entegrasyon süresi olarak 1.000 MS ile Luminometre tarafından parlaklık ölçmek.
8. Ölçülen değerlerden, vahşi tip M. smegmatis (gazetecileri içermeyen) veya indüklenmiş muhabir lysate kullanılarak ölçülen arka plan lüminesans-ölçülür. Aşağıdaki denklem^11,25' i kullanarak her koşulun güvensizlik oranlarını hesaplamak için düzeltilmiş değerleri kullanın, burada DN mutasyona uğramış Reporter gerinim içindeki etkinliğe başvurur:
   

2. nluc/GFP muhabiri

Not: Bu yöntemin görsel bir gösterimi için bkz: Şekil 3.

1. 2 mL 7H9 orta ile-80 °C stoktaki bakteriyel muhabirin gerilmesini inoculate. 37 °C ' de 1 ile 2 gün arası OD₆₀₀ sabit aşamaya ulaşıncaya kadar sallayın (OD > 3).
2. Subculture için 50 mL 7H9 orta ve kadar büyümek OD₆₀₀ geç sabit faz ulaşır (> 4).
3. Bir 96-Well plaka için bakteri ayırma önce, 50 ng/ml son konsantrasyonda ATC ekleyin ve iyi karıştırın. Toplu kültürün indüksiyon tüm kuyuları indüksiyon aynı miktarda içerir ve muhabir indüksiyonu senkronize olduğunu sağlar. Her kuyunun 100 μL hacmine sahip, açık, yuvarlak dipli 96-kuyu plakasına bakterileri aliquot.
4. Güvenme oranlarını etkileyen küçük moleküller için ekrana, kuyuları seçmek için belirtilen konsantrasyonda bileşik ekleyin. Bu protokol amacıyla, bir çizim olarak kasugamisin ( Şekil 5' te belirtilen dozlarda) kullanın. Kuyuları seçmek için farklı dozlarda kasugamisin ekleyin (her deneysel grup en az iki biyolojik çoğaltır içermelidir).
5. 37 °C ' de 16-20 h için numuneleri sallayın ve teşvik etme.
   Not: Plakayı film ile mühürlemek gereklidir. Ayrıca, tüm kenar kuyuları test kuyuları buharlaşma sınırlamak için en az 200 μL steril su ile doldurulması gerekir.
6. Her bir kuyuma 80 μL alın, çok kanallı pipet kullanarak ve numuneleri siyah 96-kuyu plakasına aktarın (floresan sinyal ölçümünü en üst düzeye çıkarır). Entegrasyon süresi olarak 20 MS ile Luminometre ile GFP sinyalini ölçün.
7. GFP sinyalini ölçtikten sonra, plakayı 3.220 x g olarak santrifüjle 10 dk. transfer 50 μL için süpernatant, beyaz dipli bir 96-kuyu plakasına (hangi lüminesans sinyal ölçümünü maksimize eder), her bir kuyu için 50 μL nluc substrat ekleyin, onları iyi karıştırın, ve entegre süresi olarak 1.000 MS ile Luminometre ile lüminesans ölçmek.
8. Düzeltilmiş nluc lüminesans değerlerini Gfp floresans ile bölerek nluc/Gfp oranını belirleyin: Bu tedbir (rastgele birimler) aspartat için bir göreceli ölçüsüdür.

Results

Bu çalışma için kullanılan iki muhabir sisteminin genel anahatlarını gösteren bir karikatür Şekil 1' de gösterilir. Bölüm 1 ' in protokolün genel bakışı Şekil 2 ' de ve Şekil 3' te Bölüm 2 ' ye genel bakışı gösterilir. Kasugamisin Mikobakteriyel güvenirlik üzerine etkisi, Renilla-Firefly muhabiri sistemi tarafından ölçülen Şekil 4' te gösterilir. Kasugamisin eyleminin özgüllüğünü göstermek için, muhabir aynı zamanda Ksga 'nın silindiği (∆ ksga) M. smegmatis 'te de ifade edildi. KsgA bir rRNA dimetil transferaz ve ksgasilinmiş suşları kasugamisin nispeten dayanıklıdır. Nluc/GFP muhabiri kullanılarak, Şekil 5' te gösterildiği gibi, kasugamisin eylem, güvensizlik üzerinde de ölçülmüştür.

Şekil 1 : Karikatür iki kazanç-of-fonksiyon Reporter sistemleri gösteren. (A) Renilla-Firefly muhabiri sistemi, Füzyon protein olarak ifade edilen ve tetrasiklin indüklenebilir bir organizatör kontrolü altında iki Lusiferaz enzimden oluşur. Renilla ve Firefly luciferases (üst) hem de yüksek ölçülebilir aktivite Wild-tipi çift enzim sonuçlarının ifadesi. Kritik bir aspartat kalıntı mutasyonu, D120, Renilla içinde Asparagin Renilla enzim oluşturur (D120N) etkin değil, ama Firefly Lusiferaz hala aktif. Asparaginin aspartat için güvensizlik (Bu durumda, fizyolojik olarak misacylated ASP-tRNA^ASN tRNA^5,21) çevrilen Renilla proteinlerinin etkinliği kazanan küçük bir oranı ile sonuçlanır, Hangi ölçülebilir. Mutasyona uğramış muhabirin Renilla/Firefly aktivitesinin Wild-Type Dual enzim ile karşılaştırılması, aspartat bir güvensizlik oranına kadar olan atkıyin hesaplanması sağlar. (B) nluc/Gfp muhabiri sistemi benzer bir prensip üzerinde çalışmaktadır. Mutasyona uğramış Nluc (D140N) geni, büyük bir salgılanmış Mikobakteriyel protein olan antijen 85A 'dan elde edilen N-terminal salgı sinyaline sahiptir. Hem nluc ve Gfp genler aynı tetrasiklin indüklenebilir Promoters ifade edilir, bir göreli ifade benchmark olarak Gfp kullanımına izin vermek için. Vahşi tip Nluc kontrol gerinim eksikliği Not: Bu muhabir öncelikle tarama, göreli güvensizlik oranları ölçümleri birincil ekran için yeterli olduğu kullanılır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 2 : Renilla-Firefly muhabiri (protokol Bölüm 1) kullanarak güvenirlik hızını ölçme anahat. M. smegmatis'in taze kültürleri, Çift luciferase muhabirlerini ifade eden bir Plasmid ile dönüştürülmüştür. Muhabir ifadesi indüklenir ve soruşturma bileşikleri veya koşulları test edilir. Reporter ifadesi 4-6 takipte, kültürler pelleted ve lysed ve endoglikozidazları çift luciferase aktivite için test edilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 3 : E-haberci oranı Nluc-GFP muhabiri ölçüm anahat (protokol Bölüm 2). Nluc ve GFP muhabirleri ile dönüştürülmüş M. smegmatis'in taze kültürü, test edilecek tüm plakalar için yeterli hacimli yetiştirilir (~ 10 ml/96-Well plaka varsayılarak). Hemen önce her kuyu içine bakteri kültürü pipetleme, ATC ile gazetecilerin ifade teşvik toplu kültüre ekledi. Onları bir gecede sallayarak kuyuları kulyın. Göreli güvensizlik oranlarını ölçmek için, kültürler siyah bir plakaya transfer (floresan algılama duyarlılığı artırmak için), Gfp floresans ölçmek, ve daha sonra, bakteri Pelet için plakalar aşağı spin. Süpernatant nluc aktivite ölçümü için beyaz bir plaka aktarın. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 4 : Farklı suşlarında kasugamisin varlığında güvenlilik oranını ölçen Renilla-Firefly muhabiri kullanmanın temsili sonucu. (A) vahşi tip M. smegmatis ve (B) kasugamisin (KSG) ile tedavi sonrasında ksga (∆ ksga) için silinmiş bir gerinim (a) içinde Asparagin için aspartat azımı oranları Renillatarafından ölçülen-Firefly çift Muhabir. Kültürler kasugamisin ile belirtilen dozlarda tedavi edildi (mikrogram/mililitre) için 6 saat önce hücre lizis ve ölçümler. Düzeltilmiş Ren/FF oranları (y-axes), Asparagin güvensizlik oranları için aspartat göstergesidir. Ksga 'nın silinmesi, kasugamycin tarafından modülasyona daha dayanıklı olan daha yüksek bir temel güvenirlik oranıyla sonuçlanır. Çubuklar ortalama değerleri, hata olarak standart sapma ile gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 5 : Kasugamisin varlığında güvenlilik oranını ölçen Nluc-GFP muhabirini kullanmanın temsili sonucu. Vahşi tip M. smegmatis 'te aspartat Ile Ilgili nluc/Gfp muhabiri tarafından ölçülen, kasugamisin (KSG) gecede (16 h) tedavi sonrasında göreceli güvenme oranları. Çubuklar ortalama değerleri, hata olarak standart sapma ile gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Discussion

Burada açıklanan protokol, çok çeşitli organizmalarda güvenme oranlarının ölçülmesi için uyarlanabilir. Diğer sistemlere protokol uyarlarken akılda tutulması gereken hususlar vardır. İlk olarak, ölçümün amacı dikkate alınmalıdır. Fonksiyon kazancı muhabirleri kullanarak güvensizlik oranlarının doğru ölçülmesi için gerekli olan (a) sağlam bir okuma tahlili (örn., enzimatik fonksiyon [Bu durumda, Lusiferaz aktivitesi] geniş bir doğrusal menzil ile). Ayrıca, (b) bir fonksiyon mutasyonu, bir çok önemli bir fonksiyon kaybına neden olan Reporter proteinin kritik bir kalıntısı, beklenme oranı altında bir işlev kaybı için bakın. Örneğin, ölçülen beklenen güvenme oranı yaklaşık 10^-3/Codon ise, fonksiyon mutasyon kaybı 1.000-Fold daha büyük olması gerekir; Aksi takdirde, düşük, güvenme olayları aralığı hassasiyetle algılanamaz. Son olarak, (c) güçlü bir benchmark muhabiri gerekli-bu durumda, protokol Bölüm 1 için Firefly Lusiferaz gerekir-işlev muhabirleri kazanç kullanarak güvenirlik oranları doğru ölçümü için. İdeal olarak, benchmark muhabiri, her ikisi de equimolar oranlarında ifade edilen (tüm niyet ve amaçlar için) garanti mutasyona uğramış enzimatik muhabir için kaynatılmış olmalıdır. Benchmark (ve Primary Reporter) okumaları, maruz kalan ortamlar için perturbations için sağlam olmalıdır. Örneğin, vahşi tip GFP 'nin floresan, pH²⁸' deki değişikliklerden etkilenme konusunda son derece hassastır, bu da, makrofajlarda bulunan fagositoz mikobakterilerde güvenme oranlarının ölçülmesi için bir kriter olarak uygun olmayan bir hale pH 7²⁹altında olan phagosomes. Öte yandan, küçük molekül taraması gibi uygulamalar için, bir birincil ekran için en önemli hususlar ölçümlerin yeniden üretilebilirliği olacaktır (yani, doğruluk aksine kesinlik), manuel elleçleme minimizasyonu, ve küçük Kültür birimleri. Güvenme oranlarının doğru ölçümleri daha az önemlidir ve ikincil uygulamalar olarak gerçekleştirilebilir. Son olarak, bu protokol, Lusiferaz enzimlerin enzimatik işlevine dayalı olarak açıklanan gazetecilerin, sadece bir bakteriyel nüfusun ortalama güvensizlik oranlarını ölçmek ancak tek hücreli heterojenlik hakkında bilgi veremem unutulmamalıdır değişme oranlarında farklılık vardır. Adaptif fenotiplerde tek hücreli değişkenlik önemini göz önüne alındığında^30,31,32, güvenlilik olayların ölçülmesi için floresan gazetecileri geliştirilmiştir^12,33 , mikobakterilerde güvenme ölçümü de dahil olmak üzere⁵.

Güvenmezlik ölçümü için gereksinimleri dikkate alan, bu protokolde tarif gibi genetik kazanç-of-fonksiyon gazetecilerin sadece bir tür güvenmezlik ölçmek olabilir (yani, bir amino asit ikame bir için dikkat edilmelidir spiker). Bu nedenle, farklı güvenme olayların ölçümü için, birden fazla muhabirler gereklidir. Örneğin, bir pozisyonda lysyl-tRNA tarafından yakın bilat kodon ribozomal kod çözme hataları ile güvenme ölçümü için, en az 16 gazetecilerin^2,3,11gereklidir. Yüksek hassasiyetli kütle spektrometresi ve Biyoinformatik, aynı anda¹⁸birçok farklı türde güvenme olaylarının olası tanımlanması için izin verir; Ancak, bu yöntemler de uyarılar ile birlikte gelir. Genel olarak, onlar kazanç-of-fonksiyon muhabirleri daha az doğrudur. Ayrıca, daha önce belirtildiği gibi, onlar, yani nonenzimatik deaminasyon²³ile conflated olabilir, yani bazı güvenilme türlerinin tespiti için daha uygundur. Son olarak, kütle spektrometresi orta veya yüksek verim taraması için okuma-çıkarma olarak uygun değildir.

Bu gazetecilerin ve protokollerin diğer sistemlerde güvenikleşme ölçümü için adaptasyonu için, diğer hususlar, istenen model sisteminde gazetecinin sağlam bir ifadesini içerir. İlk olarak Farabaugh tarafından geliştirilen çift luciferase sistemini ve Mikobakteriyel sistemimizde modifikasyon olmaksızın, muhabir ifadesinin olmaması nedeniyle hiçbir başarı elde etmeksizin kullanmaya çalıştık. Kapsamlı sorun giderme, hem kodon optimizasyonu hem de gazetecilerin küçük sıralı değişikliğini güçlü ifade²⁵ (ve yukarıda görmek) için izin vermek için gerekli olduğunu tespit etti. Diğer sistemlerde kullanmak için gazetecilerin benzer adaptasyonlarına ihtiyaç duyulacaktır.

Son olarak, ölçülmekte olan güvenme olayının tipine göz önüne alınmalıdır. Örneğin, stop-Codon ' u (anlamsız bastırma) ölçmek için bir ihtiyaç varsa, stop Codon 'un fonksiyon mutasyonu kaybı, birincil muhabir protein³⁴kritik olmayan bir bölgede tanıtılması gerekir. Aksi takdirde, kritik kalıntı (ve dolayısıyla, muhabir işlevi) yeniden kazanmak sadece belirli saçma bastırma olayları, potansiyel olarak gerçek güvenirlik oranlarının önemli bir hafife yol açacak tahlil, ölçülür. Translasyonel hatanın, çok sayıda organizmanın^1,12,13,35gibi olası bir adaptif rolünü oynattığı kanıtlar artmaktadır. Ancak, güvenmezlik olayların ölçümü hala küçük bir, model türler artan sayıda sınırlıdır. Hassas yöntemlerin güvenirliklerinin ölçülmesi için adaptasyon, bilim adamlarının Fizyoloji ve patolojide çeviri hatasının rolünü daha da arttırması potansiyeline sahiptir.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Middlebrook 7H9	BD Difco	271310
Anhidrotetrasiklin	Cayman Kimyasal
Kasugamycin	sigma	K4013
Çift lusiferaz raportör test sistemi	promega	E1960
Nano-Glo lusiferaz testi	promega	N1120
Fluoroskan Ascent FL luminometre	Termo	/
Test Plakası, 96 Kuyu Beyaz, Düz Tabanlı Yüksek Ciltleme, Kapaksız	Costar	3922
Tahlil Plakası, 96 Kuyulu Siyah, Düz Tabanlı Yüksek Teklifli, Kapaksız	Costar	3925
96 Kuyulu Hücre Kültürü Kümesi, Kapaklı Düz Tabanlı	Costar	3599
Ticari olmayan reaktifler (plazmitler)
pUV-TetOR-RenFF	NA		NA, vahşi tip çift lusiferaz raportörünün tetrasiklin ile indüklenebilen ekspresyonuna izin veren epizomal mekik plazmidi
pUV-TetOR-Ren-D120N-FF			mutasyona uğramış Renilla ile çift lusiferaz raportör
pUV-TetOR-Ag85ASec-Nluc-D140N	NA	NA	epizomal mekik plazmidi ile mutasyona uğramış Nluc lusiferazın tetrasiklin ile indüklenebilir salgılanabilir
ile pMC1S-GFP	NA	NA	Tetrasiklin ile indüklenebilen GFP ekspresyonu için Mikobakteriyel entegre (L5 bölgesi) vektör