Method Article

Multiplex PCR ve kapiller Elektroforez tarafından çok-Locus değişken-sayı tandem-balık tekrar Analizi-patojen Bakterium Yersinia ruckeri

DOI:

10.3791/59455

⸱

June 17th, 2019

 ,  , 
1Fish Health Research Group, Norwegian Veterinary Institute, 2University of Bergen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multi-Locus değişken-sayı tandem-Repeat analiz (MLVA) tahlil burada sunulan ucuz, sağlam ve taşınabilir yüksek çözünürlüklü balık-patojen bakteri Yersinia ruckeriGenotipleme sağlar. Saf kültürlerden başlayarak, tahlil düşük uygulamalar için on-loci MLVA profilleri üretmek için Multiplex PCR ve kapiller Elektroforez istihdam.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yersinia ruckeri , dünya çapındaki çiftlik salmonidlerin önemli bir patojen olduğunu, ancak bu bakterinin epizootiolojik araştırmalar (enfeksiyon izleme, vb.) için uygun basit araçlar eksik. Bir multi-Locus değişken-sayı tandem-Repeat Analizi (MLVA) tahlil bu nedenle kurtarılmış izolatlar yüksek çözünürlüklü Genotipleme için kolay erişilebilir ve belirsiz bir araç olarak geliştirilmiştir. Mlva tahlil için burada sunulan, DNA su içinde bakteri hücreleri kaynatma tarafından kültürlü Y. ruckeri örneklerden ayıklanır, PCR için şablon olarak süpernatant kullanımı izledi. Primer-çiftleri hedefleyen on değişken sayı tandem-REPEAT (VNTR) loci, Y. ruckeri genom boyunca serpiştirilmiş, aynı Bisiklet koşullarında çalışan 2 5-Plex PCR reaksiyonlar arasında eşit olarak dağıtılır. İleri astar üç floresan boya ile etiketlenmiş. Jel elektroforezi ile amplikon onayı takiben, PCR ürünleri seyreltilir ve kapiller elektroforezine maruz kalmaktadır. Elde edilen elektropherogram profillerinden, her VNTR loci temsil zirveleri boyutu denilen ve Silico içinde VNTR tekrarlama sayıları hesaplamak için istihdam. Sonuç olarak on haneli MLVA profilleri daha sonra küme analizi ile epizootiological değerlendirme sağlayan en az yayılan ağaçlar oluşturmak için kullanılır. Sayısal MLVA profilleri şeklinde son derece taşınabilir çıkış verileri, laboratuvarlar arasında hızla karşılaştırılabilir ve bir uzayotemporal bağlamda yerleştirilir. Kültürlü koloniden epizootiolojik değerlendirmeye kadar tüm prosedür, tek bir çalışma günü içinde 48 Y. ruckeri ısolates için tamamlanabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yersinia ruckeri, bir gram-negatif bakteri ve Yersiniaceae ailesinin üyesi, dünya çapında salmonid balıkların yersiniosis neden1. Bu kolayca agar medya birçok türleri üzerinde ekimi tarafından enfekte balık tanısı, ama yakın zamana kadar, küçük nüfus yapısı ve Y. ruckeri epizootiology dünya çapında ve farklı habitatları (ev sahibi türler, vb) ile ilgili bilinmektedir. Y. ruckeri için mevcut Serotiplendirme faydalı olmasında sistemleri tutarsız, karşılıklı uyumluluk eksikliği ve düşük epidemiyolojik çözünürlük sunar. Bakteri üzerinde bazı Moleküler çalışmalar yapılmıştır, çok yönlü sıralı yazma (mlst), pulsed-Field jel elektroforez (PFGE) veya tüm genom dizisi (WGS) analizi2,3,4 gibi teknikler istihdam edilmiştir ,5. Ancak, MLST rutin enfeksiyon izleme için yeterince yüksek bir çözünürlük sağlamaz, PFGE işçilik talep ederken ve laboratuvarlar arasında kolaylıkla taşınabilir olmayan sonuçlar üretir. WGS Analizi yakın bir nihai çözünürlük sağlamak olsa da, kurulması ve bu tür analizler uygulanması ön koşul teknik ve Biyoinformatik yetenekleri henüz laboratuvarların nispeten az sayıda sınırlı kalır.

Multi-Locus değişken sayı tandem-Repeat Analizi (mlva), bazı durumlarda neredeyse WGS Analizi6,7ile eşleşen bir genetik çözünürlük sunan basit ve kolayca erişilebilen bir moleküler yazma aracını temsil eder. Teknik, seçilen değişken sayı tandem-REPEAT (VNTR) loci 'de tekrarlanan sayı varyasyonunu temel alarak, yüksek derecede taşınabilir olan çıkış verileriyle sonuçlanan, profilli yalıtılmaları çevrimiçi veritabanlarına ve laboratuvarlar arasında basit bir şekilde karşılaştırmayı yapıyor. Mlst, birçok bakteriyel patojenlerin epidemiyolojik yazımı için altın standardını sürdürmesine rağmen, artan sayıda çalışma mlva8,9,10' ın önemli ölçüde daha yüksek bir ayrımcılık gücünü tanımlar. Çeşitli protokoller de, Francella noatunensis, Edwardsiella sicicida ve renibacterium salmoninarum11,12gibi balık-patojenik bakterilerin hedefleme yayımlandı 13olmak üzere.

Burada sunulan on-loci MLVA protokolü, son zamanlarda geniş bir Y. ruckeri nüfus çalışması14için temel oluşturdu, agar-yetiştirilmiş koloniler, Multiplex PCR ve kapiller Elektroforez (CE) DNA ekstraksiyonu içerir, silico uygulamalarında aşağı aşağı takip. İncelenen her bir izole için, her ikisi de her biri VNTR bölgelerini hedefleyen beş floresan etiketli astar çifti (6FAM, NED veya VıC) içeren iki Multiplex PCRs, aynı koşullarda paralel olarak çalıştırılır. Jel elektroforezi (GE) ile PCR amplikonlar doğrulamasının ardından, PCR ürünleri CE analizinden önce seyreltilir ve ilgili VNTR loci temsil eden zirveler elde edilen elektropherogram dosyalarından boyut olarak adlandırılır. Küçük, sıra özgü tutarsızlıkları CE göç desenleri için hesap Locus özgü formüller ile birlikte, VNTR CE boyutu çağrıları sonra on basamaklı MLVA profillerine birleştirilmiş VNTR yineleme sayar hesaplamak için kullanılır. Bunlar, epizootiological değerlendirmeler için giriş olarak kullanılır (örneğin, en az yayılma ağacı (MST) diyagramlarında küme çözümlemesi tarafından).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DIKKAT: protokolün tamamı Için, laboratuar paletleri, tek kullanımlık eldivenler ve steril reaktifler ve ekipmanlar kullanılarak steril olarak tüm ıslak laboratuar prosedürlerini yapmak tavsiye edilir. Ayrıca, PCR amplifikasyonu ve/veya PCR ürünlerinin (Post-PCR) işlenmesi için kullanılmayan ayrı bir odada (Pre-PCR) PCAR reaksiyonları hazırlamak için tavsiye edilir. Üreticinin önerdiği şekilde tüm reaktifleri saklayın. Kullanılan reaktifler, ekipmanlar ve yazılımlar hakkında daha fazla bilgi için malzeme tablosunu görün.

1. genomik DNA bakteri ekimi ve ekstraksiyon

  1. Herhangi bir uygun agar tipi üzerinde Y. ruckeri saf kültürler Sow (yazarlar% 5 sığır kan agar kullanılır) ve 1-2 gün Için 22 °c veya 3-4 gün Için 15 °c inkübe.
  2. Her agar plaka, bir aşı döngü ile tek bir temsilci koloni seçin ve 1,5 ml Santrifüjlü tüpler 50 μL ultrapurified su içeren transfer. 100 °C ' de bir Isıtma bloğunda 7 dakika süreyle askıya alın, kısa bir süre koyun ve inküye yapın.
  3. 3 dakika boyunca 16 000 x g 'de santrifüjün ve süpernatant 'i boş bir 1,5 ml santrifüj tüpüne dikkatle aktarmak için bir pipet kullanın. Süpernatant 'i şablon DNA 'sı olarak kullanarak bir sonraki adıma geçin veya bu zamana kadar-20 °c ' de saklayın.

2. Multiplex PCR kurulum ve bisiklet koşulları

Not: Her bir Multiplex PCR reaksiyonu (iki Y. ruckeri izole) 12,5 μL 2x MULTIPLEX PCR Plus Master mix, 0,1-0,2 μM her uygun astar çifti (Tablo 1) ve 3 μL şablon DNA, 25 μL son reaksiyon hacmine göre ayarlanmış içermelidir RNase-Free su ilavesi. Floresan etiketli ileri-astarların ışık pozlamasını en az (örn. depolama tüplerini alüminyum folyo içinde sararak) tutmayı hedefliyoruz.

  1. İki Multiplex PCR her biri için (Tablo 1), örnek sayısı artı bir pozitif ve bir negatif kontrol göre yukarıda açıklandığı gibi (şablon DNA olmadan) ana karışımları hazırlayın. Ayrıca,% 10 fazla hacim sağlar. Hazırlanmış ana Vortex yavaşça düşük hızda karışımları.
  2. Her bir ana karışımın 22 μL 'sini, örnek sayısına uygun olarak PCR şeritleri veya plakaları üzerinde ayrı farklı kuyular halinde dağıtın ve her bir kuyu için 3 μL şablon ekleyin (sırasıyla pozitif ve negatif kontroller için, doğrulanmış bir Y 'den DNA kullanın . ruckeri gerilme ve ultrapurified su). Mühür ve santrifüjle kısaca.
  3. Aşağıdaki program ile bir PCR termal bisikletçi üzerinde tüm örnekleri çalıştırın: (i) 95 °C ' de 5 dk (ii) 95 °C ' de 0,5 dk, 60 °c ' de 1,5 dk, 72 °c ' de 1 dak ve 60 °c ' de (iii) 68 dk ve 4 °C ' ye kadar süresiz olarak soğutulması. Program 3 saatten az bir sürede tamamlanır.

3. jel elektroforezi ile PCR Amplicon onayı

  1. Üreticinin tavsiyelerine göre, test edilecek PCR reaksiyonları sayısına uygun 1x Tris-borate-EDTA (TBE) tamponunun% 1,5 (w/v) agaroz jel hacmini hazırlayın. Döküm öncesinde, 50 μL jel çözeltisi ve karışımı başına 5 μL floresan nüklik asit boya ekleyin. Döküm için uygun olarak tepsiler ve Taraklar kullanın, DNA referans merdivenler için uygun kuyu sayısı serbest bırakarak.
  2. Ayarladıktan sonra, bir GE sisteminde 1x TBE-buffer içinde jel alt. 5 μL PCR ürününü 2 μL yükleme boyasıyla ve jel kuyularına aktararak karıştırın. Referans için boş kuyuları 5 μL DNA merdiven ekleyin.
  3. Yaklaşık 1 saat için 15 cm başına 110 V 'de jeli çalıştırın ve PCR ampliconları temsil eden çoklu (beş) bandın varlığını doğrulamak için UV bazlı jel görüntüleme/görselleştirme sistemi kullanın (örnek Şekil 1' de bakın). Jeli atın. Bir sonraki adıma geçin veya kalan PCR ürünlerini daha fazla işleme kadar 4 °C ' de saklayın.

4. kapiller Elektroforez kurulum ve çalıştırma koşulları

  1. PCR amplicons onay aşağıdaki, seyreltilmiş PCR ürünleri 1:10 (v/v) arıtılmış su. Mühür, mix ve santrifüj kısaca.
  2. Bir duman dolabında çalışma, 9 μL Formamid ve 0,5 μL boyutu standart PCR ürün başına (% 10 fazla hacim izin) oluşan bir ana Mix hacmi hazırlayın. Vortex, 0,5 μL seyreltilmiş PCR ürününü eklemeden önce, 9,5 μL 'i kullanılabilir CE sistemine uygun bir plakanın üzerine kısa bir süre içinde dağıtın. Mühür, mix ve santrifüj kısaca.
    Dikkat: Dikkatli ele. Su ile karıştırma Formamid toksik olan formik asit üretir.
  3. PCR termal bisikletçiler kullanarak, 4 °C ' ye kadar süresiz olarak soğutmadan önce 95 °C ' de 3 dk. Kısa bir süre santrifüjle ve plakayı üreticinin talimatlarına göre kalibre edilmiş bir CE sistemine yükleyin.
  4. Seçim aparatı ve aşağıdaki ayarları uygun olarak reaktifler kullanarak parça analizi CE çalıştırın: 60 °C; 1,6 kV 'da 5 s enjeksiyon (cm başına 32 V); 32 dk çalışma süresi 15 kV (300 V/cm). 24-kapiller (50 cm) üzerinde 24 kuyuların CE parçası Analizi genellikle yaklaşık 50 dakika sürer.

5. VNTR boyut çağırma, Repeat Count hesaplama ve MLVA profil oluşturma

Not: Adım 5,1, malzeme tablosundalistelenen belirli bir yazılımı kullanarak, Y. ruckeri VNTR CE boyutu elektroferogramları dosyalarından arama açıklar. Ek ayrıntılar ve sorun giderme için yazılım kılavuzuna başvurun. Diğer yazılımları kullanmak için uygun kılavuzlara danışın.

  1. CE sonuç dosyaları (iki Y. ruckeri izole) içe aktarın. Analiz yöntemini mikro uydu varsayılan olarak ayarlayın ve analiz düğmesine basmadan önce boyut standardı altında uygun ürün seçimini seçin. Boyut eşleştirme Düzenleyicisi aracılığıyla boyut standart parçalarının doğru kimliğini doğrulayın ve görünür hatalı tahsisleri düzeltin.
    1. Okunacak örnek (ler) seçilmişse, ekran grafikleri düğmesine basın ve boyutlandırma tablosunungörünümünü etkinleştirmek için CTRL + A tuşlarına basabilirsiniz. Üst panelde ise, CTRL tuşunu basılı tutarak VNTR amplikonlar temsil eden beş doruklarına tıklayarak (gerektiğinde Yakınlaştırma aracını kullanın).
      Not: Multiplex PCR ürünlerinin her biri için elektroferogramları, kullanılan üç boya arasında dağıtılan beş zirveyi gösterecektir (bkz. Tablo 1 ' deki ileri astarların 5 ' boya etiketlemesi ve Şekil 2' de iki örnek).
    2. Boyutlandırma tablosunufiltrelemek için CTRL + G tuşlarına basın, yalnızca beş vurgulanan zirvenin özelliklerini gösterir ve her VNTR Locus ( Tablo 1' e başvuru ile) için aşağı akış uygulaması için CE boyutu çağrıları kaydeder.
  2. CE sırasında önyargılı amplikon mobilite desenlerini hesaba eklemek için, aşağıda verilen formüle göre doğru VNTR tekrarlama sayılarını hesaplayın, Locus 'a özgü değişkenlerle birlikte VNTR CE boyutu çağrıları (bkz. Tablo 1). Verimlilik için, bu işlemi otomatikleştirmek için tavsiye edilir (örneğin, bir elektronik tablo şablonu kullanarak).
    figure-protocol-1
  3. Yuvarlak hesaplanan VNTR Repeat en yakın tamsayı için sayar ve on basamaklı dizeleri, her bir tek Y. ruckeri izole mlva profilini temsil eden birleştirir.

6. MLVA verilerinin minimum yayılma ağacı küme analizi

Not: Adım 6, malzeme tablosundalistelenen belirli yazılımları kullanarak Y. ruckeri MLVA verilerinden MST diyagramlarının oluşturulmasını açıklar. Ek ayrıntılar ve sorun giderme için yazılım kılavuzuna başvurun. Diğer yazılımları kullanmak için uygun kılavuzlara danışın.

  1. Yeni bir veritabanı oluşturun ve MLVA eklentisi etkinleştirmek için tercih.
  2. Y. ruckeri mlva profillerini ve meta verilerini içe aktarma alanları ve karakterleri (depolama biçimine bağlı olarak daha fazla alt seçim) izleyen karakter türü verilerini seçerek alın. İstendiğinde, alma dosyasının içeriğine göre alma kurallarını belirtin: hedef türü sütununda, VNTR yineleme sayar karakter değeri olarak sınıflandırmak : VNTRve çeşitli meta veriler giriş bilgileri: giriş bilgisi alanı .
    Not: Karşılaştırma ve bağlam için, mevcut MLVA Protokolü14kullanan orijinal kağıt ile birlikte yayımlanan tüm veri kümesini (açık erişim) almak da mümkündür. MLVA profilleri ve meta verileri Y. ruckeri ısolates (n = 484) çeşitli koleksiyonu üzerinde bu çalışmada incelenir ek malzeme (Tables S1 ve S2) aşağıdaki bağlantı aracılığıyla kullanılabilir: https://AEM.asm.org/content/84/16/e00730-18/Figures-Only#fig-data-additional-files
  3. Deneme türü panelinde, VNTR girişini açın ve her VNTR Locus için minimum ve maksimum değerleri 0 ve 100, sırasıyla ayarlayın. Genel ayarlaraltında ondalık basamak sayısını 0 olarak ayarlayın ve veri türüaltındaki sayılar 'ı seçin. Eksik değerleri sıfır olarak dikkate almak için denetleyin.
  4. MST küme çözümlemesi için hedeflenen alınan örnekleri seçin ve yeni karşılaştırma Oluştur düğmesini tıklatın (karşılaştırma panelinde).
    1. MST 'nin görsel sunumu için istenirse, örnekleri renkli gruplara ayırın (örn. belirli bir meta veri özelliğine göre) gruplar panelinde kullanılabilen çeşitli seçenekleri uygulayarak.
      Not: Gruplar Ayrıca, aşağıdaki adımlardan sonra retrospektif olarak oluşturulabilir/değiştirilebilir.
    2. Seçin Gelişmiş küme çözümlemesi... ve MST sınıflandırımsal veri için seçilen ÖRNEKLERI temel alan bir MST diyagramı oluşturmak için.
    3. MST 'nin görsel sunumunu tercih ettiği gibi daha fazla değiştirin (örn., bölümleme parametreleri, düğüm/şube etiketleme, çapraz bağlantılar, efsaneler, vb. ekleyerek). Örnek Şekil 3' te bakın.
      Not: > 5/10 olmayan özdeş VNTR loci temsil eden şube bağlantılarının saklanmaya ek olarak, ≤ 4/10 eşit olmayan VNTR loci eşik bölümleme küme (clonal karmaşık), daha önce üretilen MLVA veri dayalı MST küme analizi için istihdam edilmiştir Bu protokol14kullanarak. 484 Y. ruckeri mlva profillerinin yukarıda bahsedilen veri kümesi alınmıştı, bu örnekler de MST küme analizi için dahil edilebilir (yukarıda açıklandığı gibi) küresel ve tarihsel bir bağlam sağlamak için. Bu, örneğin daha önce açıklanan klonal kompleksleri ile bağlantılı herhangi bir numunenin tanımlanması ve henüz açıklanmayan soyları temsil eden kişiler gibi olacaktır. Kullanılabilir meta verilere bağlı olarak, elde edilen MST diyagramı farklı şekillerde, örneğin belirli özelliklere (coğrafya, konak, zaman vb.) bağlı nihai kümeleme desenleri keşfetmek için incelenebilir.
    4. Gerekirse, sonlandırılmış MST verme görüntü seçimi kullanarak istenen bir biçimde verin.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklandığı gibi Multiplex PCR takipte, her PCR reaksiyonunda birden fazla amplikonlar varlığını doğrulayan tipik bir GE görüntüsü Şekil 1' de gösterilir. Doğrulanmış PCR ürünlerinde gerçekleştirilen downstream CE parçası analizi, her bir Y. ruckeri için incelendiğinde, ılgılı VNTR loci 'nin boyutu çağrılması için kullanılan iki elektropherogram dosya ile sonuçlanır (Şekil 2). 484 farklı Y. ruckeri izolatlar analizinden, aynı Multiplex reaksiyon (Tablo 1)14aynı boya ile etiketlenmiş VNTR loci arasında amplikon boyutu aralığında örtüşme görülmemiştir. Elektroforetik doruklarına her biri, bu nedenle, belirsizliğe göre renk tarafından tespit edilebilir.

MLVA profillerini ve ilgili meta verileri tercih edilen yazılımlara aktarmayı takiben, MST diyagramları, materyaldeki herhangi bir epidemiyolojik desenin incelenmesi için açıklandığı şekilde inşa edilebilir. İlgili yazılımda kullanılabilen ek seçenekler için uygun kılavuzları inceleyin. Örnek olarak, Şekil 3 , Norveç 'te beş farklı somon çiftliği ile ilişkili balıklardan kurtarılan Y. ruckeri ısolates için MLVA profillerinin MST tarafından karşılaştırılması gösterir.

On VNTR loci 'nin yanı sıra in vitro ve in vivo istikrarı ile tutarlı tekrarlama boyutları, bu protokol14' e dayanan orijinal çalışmada önceden doğrulanmıştır. Kısaca, bu Sanger sıralama (tekrarlama boyutu) kullanılarak yapıldı, ve MLVA birden fazla izolat yazarak seri pasajlar aşağıdaki (in vitro) ve bireysel Hastalık salgınlar (in vivo) içinde. Dahası, zaman içinde loci çevre istikrarı birden fazla ' ev strain ' ısolates Atlantik somon için ısrarla enfekte tatlısu üretim sitelerinden birkaç yıl içinde kurtarılan yazarak incelendi.

figure-results-1
Şekil 1 : Çoklu PCR ürünlerinin varlığını doğrulayan jel elektroforez. Görüntü, örnek içeren 12 şeritte birden çok PCR amplikonlar varlığını teyit, kullanılan DNA merdiven temsil eden ilk şerit ile. Seçilen merdiven parçalarının boyutları, PCR tahlil ve strain (GULLA ve ark. 201814) her şeritte bağlı tablo S1 bakın olarak, belirtilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2 : VNTR ampliconlara karşılık gelen zirveleri gösteren Elektrophergramlar. Farklı VNTR loci isimleri, boya etiketleri ile belirtilir (VıC = yeşil; NED = siyah; 6FAM = mavi) parantez içinde. İki elektropherogram (PCR tahlil 1 üst; PCR tahlil 2 alt) tek bir Y. ruckeri izole yazarak kaynaklanmaktadır. Turuncu doruklarına (boya LIZ) standart istihdam boyutu temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 3 : Örnek epidemiyolojik değerlendirme Için en az yayılan ağaç. Diyagram, Y. ruckeri ısolates 'den mlva profillerine dayanır ve beş farklı Norveç çiftliklerinde (1-5; Legend) tekrarlanan yerisniosis salgınlarını yaşayan Atlantik somon 'dan kurtarıldı. Çiftlik kökeni ile bağlantılı açık bir kümeleme eğilimi gözlenebilir. Crosslinks ≤ 1/10 aynı olmayan VNTR loci (bkz. gösterge) içeren tüm olası bağlantıları gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

figure-results-4
Şekil 4 : Elektropherogram kekeme ve bölünmüş doruklarına görselleştirin. Bu durumda, her iki aynı anda oluşur, her zaman durum değildir. Uzun ve uzun boylu zirve, YR1070 VNTR Locus temsil eden, kolayca ayırt edilebilir. Ekran büyütülmüş ve sadece mavi boya zirveleri gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

figure-results-5
Tablo 1: VNTR Locus özellikleri. Mevcut MLVA protokolünde hedeflenen on Y. ruckeri VNTR bölgelerinin ilgili özellikleri.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan hem Multiplex PCRs yoksul şablon DNA kalitesi karşısında nispeten sağlam göründü, ancak PCR amplifikasyon eksikliği yine de zaman zaman son derece yüksek DNA konsantrasyonları ile şablonlar kullanırken gözlenen. Bu sorunlar, PCR öncesinde şablonları seyreltilerek kolayca çözülmüştür. Burada çalışan biri daha DNA ekstraksiyon için diğer yöntemler de kullanılabilir (örneğin, ticari kitleri).

Her bir Multiplex PCR reaksiyonundan beş amplikonlar bekleniyor rağmen, beş görsel olarak ayırt bantları her zaman Ge beklenen olmamalıdır, bazı (farklı etiketli) aynı reaksiyon içinde VNTR loci çakışan boyut aralıkları vardır. 60 min son PCR uzatma süresi gerekirse kısaltılabilir, ancak muhtemelen sonraki CE elektrophergramında bölünmüş doruklara sonuçlanan artışa neden olacaktır (aşağıya bakın). Özellikle, GE adımının amacı, PCR amplicons nitel doğrulama için tamamen olduğu gibi, çalışma süresi, voltaj ve/veya jel tarifi tercih edilebilir olarak ayarlanabilir. Özellikle zayıf bantlar GE tarafından gözlemlenirse, CE 'den önce bu numunelerin seyreltme faktörünü azaltmanız tavsiye edilebilir.

Burada açıklanan CE Protokolü belirli bir ticari kapiller Elektroforez aparatı üzerinde çalıştırılırken ( malzeme tablosunabakın), farklı CE sistemleri farklı örnek gereksinimlere sahip olabilir, bu da protokole bazı değişiklikler isteyebilir . Parça analizi için uygun reaktifler/ekipmanlar, kalibrasyon vb. yönergeleri için ilgili CE sistemi üreticisinin kılavuzuna bakın. Ayrıca, CE sırasında gözlenen önyargılı amplikon hareketlilik desenlerinin, CE sistemleri ve/veya makinelerde daha önce diğer mlva protokolleri için belgelendiği gibi, göreceli olarak farklılık göstermesi olasılığı vardır15,16. Burada son (yuvarlatılmış) VNTR yineleme sayar etkilenen bir ölçüde oluşsa, bu Locus özgü değişkenler anlamına gelir s ve ı (Tablo 1), VNTR yineleme sayar belirlemek için kullanılan yeniden kalibre edilmelidir. Bu, GULLA ve al. 2018 tarafından açıklandığı gibi, doğru sıra boyutlarını CE boyutu çağrılarına karşı karşılaştırarak grafiklerde doğrusalregresyon içerir.

Bölünmüş zirveler ve kekeme zirveleri, CE tabanlı MLVA yazarak17, hem tanınmış eserler, boyut arama sırasında elektrophergramlar görülebilir (Şekil 4). Kekeme zirveleri gözardı edilirken, tek bir temel çifti ile ayrılan bölünmüş zirveler durumunda uzun zirve sürekli olarak aşağı akım uygulamaları için seçilmelidir. Dahası, belirli VNTR loci eksikliği gösteren yok zirveler nadirdir, ancak ortaya çıkabilir, bu durumda ' 0 ' bir yineleme sayısı atanmalıdır. DNA ayıklandığı başlangıç kültürü saf değilse (yani, birden fazla Y. ruckeri Sub-Type içerir), aynı Locus/loci farklı allaklarına karşılık gelen birden fazla uzun DORUKLARDA CE izlenebilir. Daha sonra yeniden yazarak yeni DNA ekstraksiyonu öncesinde tek kolonilerden ikincil yetiştirmeler yapılmalıdır.

Protokolde belirtildiği gibi, PCR için şablon DNA 'Sı, varsayılan olarak Y. ruckeri'nin saf kültürlerinden çıkarılır. Ancak, birkaç olguda, Y. ruckeri Için qPCR (CT-değerler < 27) pozitif test edilen yumurta sıvısı numuneleri, önceden kültür olmaksızın, daha yüksek miktarda genomik DNA (ticari kit ile ayıklanan) ile şablon olarak doğrudan yazılı olarak mlva ile başarıyla yazıldı. Bu yaklaşım kapsamlı bir şekilde test edilmemiş ya da doğrulanmamış olsa da, Y. ruckeriek olarak farklı organizmaların BIR dizi DNA içeren karmaşık biyolojik Matrislerin incelenmesi IÇIN bu mlva tahlil potansiyelini gösterir.

Burada sunulan tüm MLVA yazma prosedürü, DNA Ekstraksiyonunda epizootiolojik değerlendirmeye kadar, tek bir çalışma gününde tamamlanabilir. Ancak, incelenen numunelerin sayısı DNA ekstraksiyon, PCR ve CE için gerekli olan zaman ile bir alt ilişkidir ve bu nedenle birden fazla numune aynı anda çalışırken çok daha verimli bir yöntemdir. Bu yine de çoğu laboratuar tabanlı yöntemler için durumda, ve Y. ruckeriepidemiyolojik alt yazma için bir araç olarak, yüksek çözünürlüklü kombinasyonu, basitlik ve taşınabilirlik bu mlva tahlil daha önce yayımlanan protokolleri üstün yapar4 ,5. Ayrıca Y. ruckeri Serotiplendirme faydalı olmasında14' ün sınırlı epidemiyolojik alaka doğrulamak için kullanılmıştır.

Kapsamlı bir mlva tabanlı nüfus çalışma 484 Y. ruckeri ısolates içeren bir dizi zamanmekansal kökenleri ve habitatlar (ana balık, çevre, vb), bizim anlayış epizootiology ve nüfus ile ilgili kurtarılan aracılığıyla Bu önemli balık patojen yapısı büyük ölçüde arttı14. MLVA yazarak klonların takibine, onlarca yıldır antropojenik olarak yayılan, muhtemelen balıkların taşınması ve yerel olarak sınırlı suşların tanımlanması etkinleşir. Dahası, bakterinin bazı klonal kompleksleri açıkça özellikle balık konaklarında (gökkuşağı alabalıkları ve Atlantik somon, sırasıyla) hastalığı ile ilişkili olabilir, diğerleri sadece çevresel kaynaklardan ve/veya klinik olarak etkilenmez balık kurtarıldı Örnek. Yöntemin uygulanabilirliği, böylece sadece enfeksiyon izleme ile sınırlı değildir, aynı zamanda aşı gelişimi, risk değerlendirmesi ve ulusal Biyogüvenlik bakımı gibi potansiyel alaka bilgileri de sağlayabilir. Şu anda Norveçli veteriner Enstitüsü 'nde, Norveç su ürünleri alanında Y. ruckeri tanımları araştırma aracı olarak aktif kullanımda.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada Norveç deniz ürünleri araştırma fonu, FHF (Proje No. 901119 ve 901505) tarafından finanse edilmiştir. Yöntem geliştirme sırasında kullanılan bakteriyel izolatlar ve numunelerin tüm katılımcılara teşekkür etmek istiyoruz.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
22&derece; C/15&derece; C inkübatörüTercih edildiği gibi.NA
5' Etiketli Astar, 10K PMOL, Tuzdan Arındırılmış, KuruThermo Fisher Scientific450007Dizileri ve Tablo 1'de etiketleme. TE tamponunda çalışma aliquouts'u hazırlayın.
Agaroz, üniversal, peqGOLDVWR732-2789P/732-2788Jel elektroforezi sırasında kullanılır.
Avant 3500xL Genetik AnalizCihazı Thermo Fisher ScientificA30469Kılcal elektroforez fragman analizi için kullanılır.
BioNumerics7 modülleriUygulamalı MatematikNAMLVA verilerinden Minimum yayılan ağaçlar oluşturmak için kullanılır.
Santrifüj(ler)Tercih edildiği gibi.NA
Özel DNA Oligo, 25N, tuzdan arındırılmış, kuruThermo Fisher ScientificA15612Dizileri Tablo 1'de. TE tamponunda çalışma aliquouts'u hazırlayın.
DNA Jel Yükleme Boyası (6X)Thermo Fisher ScientificR0611Jel elektroforezi sırasında kullanılan yükleme boyası.
Eppendorf Güvenli Kilitli Tüpler,DNA ekstraksiyonu sırasında kullanılanEppendorf30120086
DondurucuTercih edildiği gibi.NA
Çeker ocakolarak tercih edilir.NA
Jel elektroforez sistemiolarak tercih edilir.NA
GelRed Nükleik Asit Boyası, suda 10.000XBiotium41003Jel elektroforezi sırasında kullanılan floresan nükleik asit boyası.
GeneMapper Yazılımı 5Thermo Fisher Scientific4475073Kılcal elektroforezden elektroferogramları okumak için kullanılır.
GeneRuler 50 bp DNA Merdiveni,jel elektroforezi sırasında kullanılanThermo Fisher ScientificSM0373
GeneScan 600 LIZ boya Boyutu Standardı v2.0Thermo Fisher Scientific4408399Kapiler elektroforez sırasında kullanılan boyut standardı.
Isıtma bloğuTercih edildiği gibi.NA
Hi-Di FormamidThermo Fisher Scientific4311320/4440753Kılcal elektroforez sırasında kullanılan deiyonize formamid. Çalışma kanallarını hazırlayın.
Milli-Q suNANAPCR ve kapiler elektroforez sırasında kullanılan arıtılmış su. Standart tarif; şirket içinde üretilir.
Multipleks PCR  Artı  KitQiagen206151/206152
PCR termal döngüleyiciTercih edildiği gibi.
POP-7 PolimerThermo Fisher ScientificA26077/4393713/4393709Kapiler elektroforez sırasında kullanılan ayırma matrisi.
Saf kültür: Yersinia ruckeri,NA, NA, Örneğin, dondurularak saklanmış veya taze.
RNaz içermeyen suQiagenNAIn: Multipleks PCR  Artı  Kit
Tris-borat-EDTA (TBE)  tamponNANAStandart tarifi; şirket içinde üretilir.
Tripsin soya agar/sığır kanı agarNANAStandart tarifi; şirket içinde üretilir.
UV bazlı jel görüntüleme/görüntüleme sistemiolarak tercih edilir.NA
Vortexerolarak tercih edilir.Na
1.5 mL Santrifüj tüpleri. kullanıma hazır DNA merdiveni. 3500 Dx/3500xL Dx Genetik Analiz Cihazları için NA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fish Diseases and Disorders, Vol 3: Viral, Bacterial and Fungal Infections. 3, 484-511 (2011).">Barnes, A. C. Enteric redmouth disease (ERM) (Yersinia ruckeri). Fish Diseases and Disorders, Vol 3: Viral, Bacterial and Fungal Infections. 3, 484-511 (2011).
  2. Whole genome analysis of Yersinia ruckeri isolated over 27 years in Australia and New Zealand reveals geographical endemism over multiple lineages and recent evolution under host selection. Microbial Genomics. 2 (11), 000095(2016).">Barnes, A. C., et al. Whole genome analysis of Yersinia ruckeri isolated over 27 years in Australia and New Zealand reveals geographical endemism over multiple lineages and recent evolution under host selection. Microbial Genomics. 2 (11), 000095(2016).
  3. Pulsed-field gel electrophoresis and multi locus sequence typing for characterizing genotype variability of Yersinia ruckeri isolated from farmed fish in France. Veterinary Research. 46, 73(2015).">Calvez, S., Mangion, C., Douet, D. G., Daniel, P. Pulsed-field gel electrophoresis and multi locus sequence typing for characterizing genotype variability of Yersinia ruckeri isolated from farmed fish in France. Veterinary Research. 46, 73(2015).
  4. Multilocus sequence typing reveals high genetic diversity and epidemic population structure for the fish pathogen Yersinia ruckeri. Environmental Microbiology. 14 (8), 1888-1897 (2012).">Bastardo, A., Ravelo, C., Romalde, J. L. Multilocus sequence typing reveals high genetic diversity and epidemic population structure for the fish pathogen Yersinia ruckeri. Environmental Microbiology. 14 (8), 1888-1897 (2012).
  5. Yersinia ruckeri biotype 2 isolates from mainland Europe and the UK likely represent different clonal groups. Diseases of Aquatic Organisms. 84 (1), 25-33 (2009).">Wheeler, R. W., et al. Yersinia ruckeri biotype 2 isolates from mainland Europe and the UK likely represent different clonal groups. Diseases of Aquatic Organisms. 84 (1), 25-33 (2009).
  6. Comparison of multilocus variable-number tandem-repeat analysis and whole-genome sequencing for investigation of Clostridium difficile transmission. Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4141-4149 (2013).">Eyre, D. W., et al. Comparison of multilocus variable-number tandem-repeat analysis and whole-genome sequencing for investigation of Clostridium difficile transmission. Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4141-4149 (2013).
  7. Multiple Locus Variable-Number Tandem-Repeat and Single-Nucleotide Polymorphism-Based Brucella Typing Reveals Multiple Lineages in Brucella melitensis Currently Endemic in China. Frontiers in Veterinary Science. 4, (2017).">Sun, M., et al. Multiple Locus Variable-Number Tandem-Repeat and Single-Nucleotide Polymorphism-Based Brucella Typing Reveals Multiple Lineages in Brucella melitensis Currently Endemic in China. Frontiers in Veterinary Science. 4, (2017).
  8. Comparison of the performances of MLVA vs. the main other typing techniques for Bartonella henselae. Clinical Microbiology and Infection. 15, SUPPL 2 104-105 (2009).">Bouchouicha, R., et al. Comparison of the performances of MLVA vs. the main other typing techniques for Bartonella henselae. Clinical Microbiology and Infection. 15, SUPPL 2 104-105 (2009).
  9. Multiple-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis (MLVA) and Tandem Repeat Sequence Typing (TRST), helpful tools for subtyping Staphylococcus lugdunensis. Scientific Reports. 8 (1), (2018).">Dahyot, S., et al. Multiple-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis (MLVA) and Tandem Repeat Sequence Typing (TRST), helpful tools for subtyping Staphylococcus lugdunensis. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
  10. Multiple-locus variable number tandem repeat analysis for Streptococcus pneumoniae: Comparison with PFGE and MLST. PLoS ONE. 6 (5), (2011).">Elberse, K. E. M., Nunes, S., Sá-Leão, R., van der Heide, H. G. J., Schouls, L. M. Multiple-locus variable number tandem repeat analysis for Streptococcus pneumoniae: Comparison with PFGE and MLST. PLoS ONE. 6 (5), (2011).
  11. Multilocus variable-number tandem-repeat genotyping of Renibacterium salmoninarum, a bacterium causing bacterial kidney disease in salmonid fish. BMC microbiology. 13, 285(2013).">Matejusova, I., et al. Multilocus variable-number tandem-repeat genotyping of Renibacterium salmoninarum, a bacterium causing bacterial kidney disease in salmonid fish. BMC microbiology. 13, 285(2013).
  12. An improved multiple-locus variable-number of tandem repeat analysis (MLVA) for the fish pathogen Francisella noatunensis using capillary electrophoresis. BMC Veterinary Research. 9, 252(2013).">Duodu, S., et al. An improved multiple-locus variable-number of tandem repeat analysis (MLVA) for the fish pathogen Francisella noatunensis using capillary electrophoresis. BMC Veterinary Research. 9, 252(2013).
  13. Multilocus variable number tandem repeat analysis of Edwardsiella piscicida isolates pathogenic to fish. Journal of Fish Diseases. 37 (11), 941-948 (2014).">Abayneh, T., Colquhoun, D. J., Austin, D., Sørum, H. Multilocus variable number tandem repeat analysis of Edwardsiella piscicida isolates pathogenic to fish. Journal of Fish Diseases. 37 (11), 941-948 (2014).
  14. Multilocus variable-number tandem-repeat analysis of Yersinia ruckeri confirms the existence of host specificity, geographic endemism, and anthropogenic dissemination of virulent clones. Applied and Environmental Microbiology. 84 (16), (2018).">Gulla, S., et al. Multilocus variable-number tandem-repeat analysis of Yersinia ruckeri confirms the existence of host specificity, geographic endemism, and anthropogenic dissemination of virulent clones. Applied and Environmental Microbiology. 84 (16), (2018).
  15. A cautionary tale: Lack of consistency in allele sizes between two laboratories for a published multilocus microsatellite typing system. Journal of Clinical Microbiology. 45 (2), 522-528 (2007).">Pasqualotto, A. C., Denning, D. W., Anderson, M. J. A cautionary tale: Lack of consistency in allele sizes between two laboratories for a published multilocus microsatellite typing system. Journal of Clinical Microbiology. 45 (2), 522-528 (2007).
  16. Genotyping of Bacillus anthracis strains based on automated capillary 25-loci multiple locus variable-number tandem repeats analysis. BMC Microbiology. 6, 33(2006).">Lista, F., et al. Genotyping of Bacillus anthracis strains based on automated capillary 25-loci multiple locus variable-number tandem repeats analysis. BMC Microbiology. 6, 33(2006).
  17. https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/fragment-analysis-chemistry-guide.pdf (2014).">Thermo Fisher Scientific DNA Fragment Analysis by Capillary Electrophoresis. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/fragment-analysis-chemistry-guide.pdf (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Yersinia ruckeriMLVA assayMultiplex PCRCapillary ElectrophoresisVNTR lociDNA extractionGel electrophoresisGene MapperBioNumericsMinimum spanning tree

Related Articles