Yöntem makalesi

Sinaptik çeşitlilik bütün hücreli yama-kelepçe Elektrofizyoloji kullanarak değerlendirilmesi

DOI:

10.3791/59461

⸱

23 Nisan 2019

 , 
1Neuroscience Program, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 2Robarts Research Institute, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 3Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, Bütün hücre yama kelepçe Elektrofizyoloji akut beyin dilimler halinde kullanarak fonksiyonel sinaptik çeşitlilik değerlendirmek için bir iletişim kuralı mevcut.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Merkezi sinir sistemi nöronlar bir çift sık sık birden çok sinaptik kişiler ve/veya fonksiyonel nörotransmitter yayın siteleri (sinaptik çeşitlilik) oluşturur. Sinaptik plastik ve değişiklikler geliştirme boyunca ve sinaptik iletimi etkinliği için önemli bir belirleyici olmak farklı fizyolojik koşullarda olduğunu. Burada, Bütün hücre yama kelepçe Elektrofizyoloji akut beyin dilimler halinde kullanarak belirli bir postsinaptik nöron üzerine sonlandırma sinapslarda çokluğu derecesini tahmin etmek için deneyler anahat. Özellikle, Gerilim Tipi Kelepçe kayıt spontan eksitatör postsinaptik akımları (sEPSCs) genliği ve minyatür eksitatör postsinaptik akımları (mEPSCs) arasında fark karşılaştırmak için kullanılır. Bu yöntem arkasında çeşitlilik gösteren afferent girişleri her sinaptik temas oluşur zaman uyumlu sürümü nedeniyle büyük, Aksiyon potansiyeli bağımlı sEPSCs gösterecektir teoridir. Buna ek olarak, (zaman uyumsuz olan) aksiyon potansiyeli bağımsız yayın daha küçük genlik mEPSCs oluşturur. Bu makalede birtakım deneyler ve analizler sinaptik çeşitlilik varlığını karakterize için özetliyor ve teknik sınırlamaları ve gereksinimleri verilmektedir. Bu teknik vivo etkiler sinaptik kişiler farklı beyin bölgeleri'organizasyonu nasıl farklı davranış, farmakolojik ya da çevresel müdahaleleri araştırmak için uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sinaptik iletimi nöronlar arasındaki iletişim için temel bir mekanizmadır ve dolayısıyla, beyin işlev. Sinaptik iletimi aynı zamanda değişken ve onun etkinliğini de yanıt düzenleyici sinyaller1gibi bir etkinlik bağlı şekilde değiştirebilirsiniz. Böylece, sinaptik fonksiyon incelenmesi nörolojik araştırma anahtar bir odağı olmuştur. Bütün hücre yama kelepçe Elektrofizyoloji anlamak, tasarlayarak Deneysel Tasarımlar ve veri analizleri, derinlemesine biyofiziksel ve moleküler mekanizmaları sinaptik iletimi için bize sağlar çok yönlü bir tekniktir. Yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım, belki teknik ve kavramı sayesinde, minyatür eksitatör/inhibitör postsinaptik akımların ölçülmesi basitliğidir (bana / IPSCs) gerilim altında yapılandırma2,3, kelepçe 4 , 5 , 6. bireysel ÇATOM presynaptic terminalden 7 serbest bırakmak onların anılan sıraya göre nörotransmitter bağlama cevaben iyonlar aracılığıyla postsinaptik ionotropic reseptörleri (örneğin AMPA ve GABAA reseptörleri) akışını temsil . Kayıt voltaj Na+ kanal engelleyici Tetradotoksin varlığında (TTX) elde edilir çünkü serbest aksiyon potansiyeli bağımsızdır ve normalde nörotransmitter içeren tek bir sinaptik vezikül içerir. Bu duymadığını, ÇATOM ortalama genliği yaygın sayı ve bir tek yayın sitesi karşı postsinaptik reseptörleri işlevini temsil eden quantal boyutu için kaba bir tahmin olarak kullanılır. Öte yandan, ÇATOM sıklığını postsinaptik hücre ve onların ortalama yayın olasılık üzerine sonlandırma sinapslarda toplam sayısı bir arada temsil etmek için kabul edilir. Ancak, bu parametreler başka bir değişken-multiplicativity sinapslar veya sinaptik çeşitlilik ölçüyor musunuz — hangisi sinaptik iletimi etkinliği için önemli.

Sinaptik iletimi7,8,9quantal teorisi üzerinde bağlı olarak, bir çift nöronların arasında belirli bir bağlantı gücü üç faktöre bağlıdır: fonksiyonel sinapslarda (N) sayısı postsinaptik yanıt-e doğru serbest bırakmak-in tek sinaptik vezikül (quantal boyutu; Q) ve nörotransmitter yayın (Pr) olasılığı. Sinaptik çeşitlilik Niçin eşdeğerdir. Sinaptik çeşitlilik geliştirilmesi veya çarpma sinapslarda budama boyunca geliştirme ve farklı hastalık Birleşik3,4,6,10plastiktir. Bu nedenle, sinaptik çeşitlilik karakterize sağlık ve hastalığında sinaptik iletimi etkinliğini anlamak için önemli sonuçları vardır. Elektron mikroskobu gibi teknikleri sinaptik çeşitlilik yapısal kanıtı aynı postsinaptik nöron11,12üzerine aynı axon kaynaklanan birden fazla sinaptik kişi tespit ederek belirleyebilir, 13,14. Ancak, bu yapısal olarak tanımlanan multisynapses işlevsel olarak sessiz15,16olabilir. N kesin fonksiyonel inceleme gerektirir teknik olarak Elektrofizyolojik yaklaşımlar, belirli bir bağlantı birden çok fonksiyonel yayın siteleri olup olmadığını belirleyebilir eşleştirilmiş bütün hücreli kayıtları gibi zorlu ve en az tek bir sözde axon işe hedefliyoruz stimülasyon yaklaşımlar.

Bu protokol için başlangıçta Hsia ark2tarafından geliştirilmiş bir yöntem benimseyerek sinaptik çeşitlilik tahmin etmek için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik kendiliğinden PSC'ler (sPSCs) ve belirli bir neuron için tüm girişleri arasında sinaptik çeşitlilik derecesini tahmin etmek için bize izin verir tüm hücreli yama kelepçe Elektrofizyoloji kullanarak ÇATOM ölçümü içerir.  Gibi önceden tanımlanmış, sinaptik çeşitlilik belirli bir öncesi ve postsinaptik nöron arasındaki sinapslar sayısını yansıtır. Birden çok sinapslarda senkronizasyonu içinde bir aksiyon potansiyeli tarafından işe, büyük genlik PSC üreten bireysel (yani quantal) PSC zamansal toplamı yüksek bir olasılık olacak.  ÇATOM kayıtları (hangi aksiyon potansiyelleri TTX tarafından engellenen), geçici bireysel (zaman uyumlu) ÇATOM toplamı olasılığı düşüktür. Bu mantığı kullanarak, sinaptik çeşitlilik (Aksiyon potansiyeli bağımlı sürümüyle) sPSC genlik ÇATOM genlik için karşılaştırarak tahmin edilebilir.

Çeşitlilik varlığını incelemek için dört deneyleri ve onların analizleri glutamatergic EPSCs örnek olarak kullanarak açıklar. Ancak, aynı yaklaşımı-ebilmek var olmak kullanılmış için hızlı GABAergic/glycinergic iletim (IPSCs). Her deneme için kısa bir gerekçe aşağıda açıklanmıştır. İlk olarak, yukarıda açıklandığı gibi sinaptik çeşitlilik sEPSCs mEPSCs için genliği karşılaştırarak tahmin edilebilir. Bu yaklaşım için iki gereksinim vardır; 1) presynaptic akson kayıt sırasında aksiyon potansiyelleri yeterli sayıda yangın gerekir ve böylece birden çok sinapslarda sinir bir aksiyon potansiyeli girişte yayın 2) Pr yüksek olmalıdır. Bu gereksinimleri karşılamak üzere, sEPSCs ilk düşük Ca2 + yapay serebrospinal sıvı (aCSF) kaydedilir ve düşük konsantrasyon K+ kanal antagonisti, 4-eylem artırmak için Aminopyridine (4-AP) huzurunda kaydedildi potansiyel ateş ve Pr. O zaman aksiyon potansiyeli ateş TTX ve Pr bir voltaj Ca2 + kanal engelleyici tarafından Cd2 +azalmış tarafından engellendi. SEPSCs (4AP ile) genliği bu mEPSC karşılaştırılır (4AP, TTX ve Cd2 +). İkinci denemede Ca2 + ekimolar Sr2 + vezikül yayın desynchronize aCSF olarak değiştirilir. CA2 + veziküller zaman uyumlu sürümü için gerekli olduğu gibi değiştirme ile Sr2 + çokluğu işaret etmektedir büyük genlik sEPSCs ortadan kaldırmak gerekir. Üçüncü olarak, mechanistically, çeşitlilik birden çok sinaptik ilgili kişiler aynı postsinaptik nöron veya multivesicular açıklaması (içinde tek bir sinaptik kişiyi serbest Yani çoklu veziküller) neden olabilir17,18. Çeşitlilik iki tür arasında ayırt etmek için üçüncü deneme kullandığı bir düşük benzeşme, hızlı dissociating rekabetçi antagonist AMPA reseptör, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,büyük olup olmadığını belirlemek için18 sEPSC multivesicular serbest postsinaptik reseptörleri örtüşen bir popülasyon üzerinde hareket veya bağımsız sinapslarda zamansal özetleme sonucudur. Büyük genlik olayları multivesicular yayınlamasını ortaya çıkarsa, birden fazla sinaptik kişi zamansal toplamı ortaya büyük sEPSCs benzer şekilde etkilenecek ise γ-DGG büyük kıyasla daha küçük sEPSCs, engelleme daha az etkili olacak γ-DGG. Dördüncü denemede daha fizyolojik bir yöntem aksiyon potansiyeli ateş, yani afferent sinaptik uyarma arttırmak için kullanılır. Sinirsel aktivite patlamaları geçici artış/uyarılan afferents spontan aksiyon potansiyeli ateş ve yayın olasılığını kolaylaştırabilir. Bu nedenle, bu yaklaşım daha fizyolojik bir şekilde tezahür etmeye çeşitlilik sağlar.

Aşağıdaki iletişim kuralı bu deneyler fare hipotalamik doku yöntemler açıklanmıştır. Özellikle, kortikotropin serbest hormon (İBB) nöronlar hipotalamus (PVN) paraventricular çekirdeği kullanılır. Biz bütün hücreli yama kelepçe Elektrofizyoloji yürütmek için yordamlar açıklar ve sinaptik çeşitlilik için test etmek için belirli deneyler açıklamak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan deneyleri hayvan bakımı Komitesi, University of Western Ontario'dan uygun olarak hayvan bakım kuralları (AUP #2014-031) Kanada Konseyi tarafından onaylanır.

1. çözümler

  1. Çözüm Dilimleme
    1. Dilimleme çözüm kompozisyon için Tablo 1 ' e bakın.
    2. 20 x hisse senedi çözüm önceden hazırlamak ve 4 ° C'de 1 ay için saklayın.
    3. 1 x Dilimleme çözüm, NaHCO3, glikoz ve sukroz GKD2O içinde dağıtılması ve 20 x hisse senedi ekleyin. OSMOLARİTE 315-320 mOsm arasında olduğundan emin olun ve çözüm en fazla 1 hafta 4 ° C'de depolayın
    4. İki kadehler çözüm Dilimleme 100 mL ile doldurulması ve onları parafilm ile kaplayın. Çözüm bir dondurucu içinde chill kadar çözüm kısmen (yaklaşık 20 dk-80 ° C dondurucu) donmuş olur. Dağılım tüp gaz kullanarak kabarcık çözüm ile % 95'i O2/5% CO2 20 dk için buza Dilimleme her iki kadehler.
Çözüm konsantrasyonları (mM)
DilimlemeNormal aCSFDüşük Ca2 + aCSFSR+ aCSFPipet/iç
NaCl87126126126-
KCl2.52.52.52.58
CaCl2 0,52.50,5--
SrCl2 ---2.5-
MgCl2 71.52.51.52
NaH2PO4 1,251,251,251,25-
NaHCO3 25262626-
Glikoz25101010-
Sükroz75----
K-glukonat----116
Na-glukonat----12
HEPES----10
K2-EGTA----1
K2ATP----4
Na3GTP----0,3

Tablo 1: Çeşitli çözümler bileşimi.

  1. aCSF (için dilim kurtarma ve bakım)
    1. Tablo 1 ' e aCSF kompozisyon için başvurun.
    2. 20 x hisse senedi çözüm önceden hazırlamak ve 4 ° C'de 1 ay için saklayın.
    3. 1 x aCSF, NaHCO3 ve glikoz GKD2O çözmek ve 20 x hisse senedi ekleyin. OSMOLARİTE 298-300 mOsm arasında olduğundan emin olun. Çözüm 1 gün içinde kullanın.
  2. aCSF (düşük Ca2 + kayıt için)
    1. Tablo 1 ' e düşük Ca2 + aCSF kompozisyon için başvurun.
    2. 20 x hisse senedi çözüm önceden hazırlamak ve 4 ° C'de 1 ay için saklayın.
    3. NaHCO3 ve ddH2O glikoz düşük Ca2 + aCSF x 1 için dağıtılması ve 20 x (CaCl2 ve MgCl2 ücretsiz) eklemek hisse senedi, CaCl2 ve MgCl2 ' ye belirtilen konsantrasyonlarda. OSMOLARİTE 298-300 arasında olduğundan emin olun. Çözüm 1 gün içinde kullanın.
  3. aCSF (Sr2 + kayıt için)
    1. Sr2 + aCSF kompozisyon için Tablo 1 ' e bakın.
    2. 20 x hisse senedi çözüm önceden hazırlamak ve 4 ° C'de 1 ay için saklayın.
    3. NaHCO3 ve glikoz GKD2O Sr2 + aCSF x 1 için dağıtılması ve 20 x (CaCl2 ve MgCl2 ücretsiz) eklemek hisse senedi, SrCl2 ve MgCl2 ' ye belirtilen konsantrasyonlarda. OSMOLARİTE 298-300 arasında olduğundan emin olun. Çözüm 1 gün içinde kullanın.
  4. İç çözüm
    1. Tablo 1 ' e K-glukonat dayalı iç çözüm kompozisyon için başvurun.
    2. 20 mL iç çözeltisi yapmak için 50 mL tüp 15 mL moleküler biyoloji sınıf su ekleyin. Sonraki adımları buz üzerinde gerçekleştirin.
    3. Aşağıdaki çözümleri önde-in zaman 1 M hisse senedi konsantrasyonları Moleküler biyolojide sınıf su hazırlamak. (ML) ekleme: 2,32 K-glukonat, 0,24 Na-glukonat, 0.20 HEPES, 0.16 KCl, 0,05 K2-EGTA, 50 mL tüp 0,04 MgCl2 .
    4. 0,3 M Na3GTP 100 µL ekleyin.
    5. K2ATP bir 2 mL microcentrifuge tüp 44.08 mg tartmak ve moleküler biyoloji sınıf su 1 mL ekleyin, sonra 50 mL tüp için ekleyin.
    6. PH 7.2-7.4 ile 1 M KOH için ayarlayın. OSMOLARİTE 283-289 mOsm arasında olduğundan emin olun.

2. dilim hazırlık

  1. Araçları hazırlamak
    1. ACSF 200 mL (250 mL kabı 4 wells ve örgü ile inşa) kurtarma Odası'na ekleyin ve kurtarma odası bir su banyosu (35 ° C) yerleştirin.
    2. Odası parafin film ile kapak ve sürekli en az 20 dk bir cam dağılım tüp kullanarak % 95'i O2/5% CO2 aCSF kabarcık.
    3. Diseksiyon için aletler (neşter, açılı iyi makas, pens, iyi boya fırçası, plastik kaşık) ayarlayarak hazırlayın.
    4. Buz gibi Dilimleme eriyik--dan adım 1.1.4 yaklaşık 15 mL ile 60 mL şırıngaya doldur.
    5. Diseksiyon platform iyi bir tabak kapağı üzerinde bir filtre kağıdı koyarak hazırlamak.
    6. Buz tepsiye yerleştirip tepsiyi buz ile doldurma Dilimleme odası hazırlamak.
    7. Vibratome kadar tek kullanımlık bir bıçak bıçak tutucu güvence tarafından ayarlayın.
    8. Pasteur pipet ucu kırma ve Lastik ampul kırık sonuna yerleştirerek bir transfer pipet yapmak.
  2. Fare beynini incelememize
    1. Omurilik refleksleri yok olana %4 isoflurane ile doymuş bir odasında hayvan anestezi.
    2. Bir Giyotin kullanarak hayvan başını kesmek ve hızlı bir şekilde beyin kaldırın.
      1. Kaudal için gelen rostral No. 22 neşter bıçak ile bir ensizyon olun.
      2. Yanal kafa derisi başın her iki tarafta kabuğu.
      3. Kullanım iyi makas kafatası rostral (frontal kemik kenarına da dahil olmak üzere), için bir taraftan Kaudal üzerinde kesmek için beyin zarar vermemeye dikkat kullanarak.
      4. Kafatası parçası kaldırmak için kullanım forseps beyin kapalı ve beyin 15 mL şırınga adım 2.1.4 kullanarak buz gibi Dilimleme çözeltisi ile hızlı bir şekilde serin.
      5. Beyin kafatası dışarı kaldırın.
      6. Yer ile buz gibi Dilimleme eriyik (--dan adım 1.1.4) dolu kadehler birinde beyin ile % 95'i O2/5% CO2bubbled.
  3. Fare hipotalamus dilim hazırlamak
    1. Beyin için istenen beyin alan engellemek ve açı kesme (örneğin, koronal hipotalamik dilimler için optik hemisferlerine rostral ve bir bıçak kullanarak pons Kaudal doku kapalı trim ve Kaudal blok düz yüzey dik beynin tabanına sahip emin olmak).
    2. Filtre kağıdı kesilmiş bir parça kullanılarak, beyin ön taraftan almak ve anlık tutkal kullanarak holding plaka arka tarafına yapıştırın.
    3. Hızlı bir şekilde tutarak plaka Dilimleme odanın içine koyun ve odası kimden adım 1.1.4 ikinci kabı çözüm Dilimleme ile doldurun.
    4. Vibratome Dilimleme odası ve buz tepsiye güvenli.
    5. Dilimleme alanını (anterior ve posteiror beyne) tanımlamak ve 250 µm kalınlık koronal dilimleri Dilimleme başlar. Parametreleri tavsiye: 0.10 mm/s, genlik hız 2 mm.
    6. İstenen beyin bölgesi için uygun büyüklükte dilimlere kesin.
    7. 30-45 dk 35 ° C'de dilimleri yeniden elde etmek. Sonra kurtarma odası ısınma banyo gelen kaldırmak ve ek bir 30 dakika süreyle oda sıcaklığında günün geri kalanı için oda sıcaklığında tutmak dilimleri yeniden elde etmek dilimleri izin ve sürekli % %95 O2/5 ile banyo kabarcık devam CO2 .

3. bütün hücreli yama ClampRecording

  1. Yama Pipetler çekin
    1. Bütün hücre pipet çektirme 's Manuel kayıt için önerilen parametreleri kullanarak, 3-5 MΩ bir pipet direnç için yama Pipetler kalın duvarlı cam çek.
    2. Microsyringe (ticari veya ev yapımı), dolgu bir pipet ucu ile filtre uygulanmış iç çözüm kullanarak. Bir microsyringe yapmak, 1 mL şırınga ucu yanık ve ipucu oluşturma düşmeye izin verin uzun güzel bir ipucu.
  2. Bütün hücre yapılandırmasını almak
    1. Kayıt pipet hemen üstünde dilim ve ofset pipet gerilim kelepçe modunda geçerli yerleştirin. Pipet için hafif pozitif basınç uygulayın ve stopcock kilitle.
    2. Sağlam bir membran ile sağlıklı bir hücre seçin ve pipet içeren hücreyi yaklaşım. Pozitif basınç (yani bir yavaş dalga doku girerken) dokusunda hafif bir rahatsızlık neden olmamalıdır.
    3. Yavaş yavaş daha yakın pipet pipet hücre yüzeyinde küçük bir çukur oluşturur kadar Diyagonal hareket kullanarak cep getirmek devam edin.
    4. Pozitif basınç kilidi serbest bırakmak. Hücre bir mühür oluşmaya başlayacak ve direniş 1 GΩ artacaktır. Hücre-68, gerilim kelepçe tutun mV.
    5. Hücreye çapraz olarak aşırı basınç hücreden kaldırmak için uzak biraz çek.
    6. Hızlı ve yavaş pipet kapasite için telafi.
    7. Kısa bir emme hücre kırmak ve bütün hücre yapılandırmasını almak için pipet sahibine bağlı tüp yoluyla uygulanır.
    8. Hücre moda membran üzerinde test penceresinde bir Elektrofizyoloji veri toplama ve analiz yazılımı (örneğin, Clampex).
    9. Kayıt her gerilim kelepçe, daha önce aynı yazılımı kullanarak bir membran testi gerçekleştirmek ve ilgili parametreleri bir laboratuvar kitabı (membran direnç, erişim direnç ve kapasite) kaydedin.
    10. 27 – 30 ° C'de kayıt banyo ve Debi 1.5-2.0 mL/dk sonraki deneyler için sıcaklığını korumak.

4. çeşitlilik deneyler

  1. Deney 1: 4-AP kullanarak çeşitlilik tahmin ediliyor.
    1. Hücre-68, gerilim kelepçe tutun mV. Aynı yazılımı kullanarak, sEPSCs düşük Ca2 + aCSF ile banyo Ventriküler kaydedin. Sinirsel aktivite membran atılım kısa bir süre sonra yüksek olsa da istikrarlı temel kayıt emin olmak için bütün hücreli yapılandırma başladıktan sonra en az 5 dk kaydı.
    2. Bir micropipette kullanarak aCSF için 4-AP ekleyin ve banyo 30 µM 4-AP. kayıt sEPSCs tam uyuşturucu etkisi elde etmek en az 10 dk için geçerlidir.
    3. 0.5 µM TTX ve 10 µM Cd2 + 4-AP ile aCSF ekleyin ve kaydetmek için en az 10 dk mEPSCs.
    4. Çevrimdışı analiz için son 1 dk hemen önce 4-AP (içinde düşük Ca2 + aCSF), 4-AP uygulama 10 dk ve 10 dk TTX uygulamasının uygulama temellerin kullanın.
  2. Deney 2: Sr2 + kullanarak vezikül yayın desynchronize
    1. Normal Ca2 + aCSF (banyo aCSF ile aynı) kayıt sEPSCs en az 5 min için banyo Ventriküler süre.
    2. Normal Ca2 + aCSF geçmek ve Sr2 + aCSF (Kimden adım 1.4) ve kayıt sEPSCs Ventriküler başlar.
    3. Çevrimdışı analiz için büyük genlik sEPSCs veziküller zaman uyumlu sürümü nedeniyle olup olmadığını belirlemek için son 1 dk 10inci dakikaya Sr2 + aCSF uygulamasının (içinde normal aCSF) temellerin karşılaştırın.
  3. Deney 3: multivesicular yayın kullanmak için test γ- DGG
    1. Düşük Ca2 + aCSF kayıt sEPSCs içinde en az 5 min için.
    2. 30 µM 4-AP aCSF perfüzyon sistemi aracılığıyla ekleyin. Kayıt sEPSCs en az 10 dakika için.
    3. ACSF 4-AP ile 200 µM γ-DGG ekleyin ve kaydetmek için en az 10 dk sEPSCs.
    4. Bir denetim deney ayrı bir hücrede adımları gerçekleştirirken 1-3 ama geçerli bir düşük konsantrasyon (125 nM), γ-DGG yerine DNQX.
    5. Çevrimdışı için her ilaç uygulamanın son dk analizi.
  4. Deney 4: Aksiyon potansiyeli ateş artırmak için afferent girdileri uyarmak.
    1. Normal Ca2 + aCSF kayıt sEPSCs.
    2. ACSF de 20 Hz oranda 2 s ve tekrar için 10 kez 20 sn arası seri bir aralığı ile dolu bir monopolar cam elektrot kullanarak afferents uyarmak.
    3. Analiz için ilk uyarıcı önce 5.000 ms taban çizgisi olarak kullanın ve 10-300 ms sonra son uyarıcı karşılaştırın ve ortalama genlik ve frekans değişikliği 10 deneme gerçekleştirin.

5. analiz

  1. SEPSCs ve mEPSCs algılar ve sinaptik akımları (örneğin, Mini analiz yazılımı) çözümleyen bir program kullanarak analiz.
    1. Bu yazılımı kullanarak, önerilen tespit parametrelerden AMPA reseptör EPSCs (veya GABA reseptör inhibitör akımları kaydediliyorsa EPSCs) algılamak için kullanın.
    2. EPSCs kayıt algılamak için durmadan analiz işlevini kullanın.
    3. El ile tarama program doğru her olay algılama sağlamak için her kayıt (örneğin, olaylar değil varlık sağlamak cevapsız ya da iki kez sayılır).
    4. Olay verileri panoya kopyalayarak ve veri yönetimi yazılımı (örneğin, Excel) yapıştırın
    5. Ortalama frekansını ve/veya genlik her ilaç tedavisi için hesaplamak ve ilgili istatistiksel analizleri gerçekleştirebilirsiniz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıdaki Protokolü fare hipotalamik nöronlar örnek olarak kullanarak sinaptik çeşitlilik derecesini incelemek için bütün hücreli yama kelepçe Elektrofizyoloji kullanarak bir yöntem açıklanır. Bu dilim hazırlama tekniği bir şişmiş membran veya çekirdek (şekil 1) sahip olmayan sağlıklı hücrelerin verim. İletişim kuralı her adımda doku ve kalite kayıtları sağlığı için önemlidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Başarılı yama kelepçe Elektrofizyoloji deneme için bir önemli şart sağlıklı dilimleri/hücre almaktır. Bizim açıklanan protokol PVN nöronlar içeren hipotalamik dilimler için optimize edilmiştir. Diğer beyin alanları gerektirebilir çözümleri ve dilimleme yöntemleri21,22,23,24değiştiren. Kayıt için yalnızca hücre özellikleri membran direnç gibi sürekli izleyerek istikrarlı kayıtları kabul önemlidi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa yoktur

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JS Ontario lisansüstü öğrenim bursu aldım. W.I. zihinsel sağlık araştırma Kanada'dan yeni bir araştırmacı bursu aldı. Bu eser hibe W.I için Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi Kanada (06106-2015 RGPIN) ve Kanada Enstitüsü Sağlık Araştırma (PJT 148707) tarafından desteklenen işletim.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 mL şırıngaBD309659
10 bıçaklıFisher Scientific / diğerleri35698
22 bıçaklıVWR / diğerleri21909-626
22 & mu; M şırınga filtreleriMilipore09-719-000
Adson forecepsHarvard Instruments72-8547
Açılı keskin makasHarvard Instruments72-8437
ClampexMolecular DevicespClamp 10
Çift kenarlı bıçakVWR74-0002
Filtre kağıdıSigma/diğerleri1001090
İnce boya fırçasıFisher / çeşitli15-183-35 / çeşitli
Gaz Dispersiyon TüpüVWRLG-8680-120
IsofluranFresenius Kabi / diğerleriM60303
Krazy tutkalçeşitliçeşitli
Mini analizSynaptosoftMiniAnalysis 6
OsmomoterWescor IncModel 5600
ParafilmSigmaPM-996
Pastör pipetiVWR14672-200
ph metreMettler ToledoFE20-ATC
Kauçuk ampulVWR82024-550
Neşter sapı No. 3Harvard Instruments72-8350
Neşter kolu No. 4Harvard Instruments72-8356
Tek kenarlı bıçakVWR55411-050
Vibratom dilimleyiciLeicaVT1200S
Su Arıtma SistemiMilliporeMilli-Q Academic A10
Kuyu plakası kapağıFisher / çeşitli07-201-590 / çeşitli
Kimyasallar / reaktifler< / güçlü>
4-APSigma275875
BAPTAmoleküler problarıB1204
CaCl2< / sub> * 2H < sub>2< / sub>OSigmaC7902
CdCl < sub>2< / sub>sigma202908
DNQXTocris189
EGTASigmaE3889
glikozSigmaG5767
HEPESSigmaH3375
K2-ATPSigmaA8937
KClSigmaP9333
K-glukonatSigmaG4500
MgCl < alt > 2 < / alt > * 6H < alt > 2 < / alt >OSigmaM2670
Moleküler biyoloji sınıfı suSigmaW4502-1L
Na3< / sub>GTPSigmaG8877
NaClBioshopSOD001.1
Na-glukonatSigmaS2054
NaH2< / sub>PO4< / sub>Sigma71504
NaHCO3< / sub>SigmaS6014
PikrotoksinsigmaP1675
SrClSigma255521
sükrozBioshopSUC507.1
TTXAlamone LabsT-550
yDGGTocris6729-55-1

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abbott, L. F., Nelson, S. B. Synaptic plasticity: taming the beast. Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).
  2. Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus. Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).
  3. Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature neuroscience. 17 (3), 400-406 (2014).
  4. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science (New York, N.Y). 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  5. Schrader, L. A., Tasker, J. G. Presynaptic Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors of Excitatory and Inhibitory Synaptic Inputs to Hypothalamic Magnocellular Neurons. Journal of Neurophysiology. 77 (2), 527(1997).
  6. Salter, E. W., Sunstrum, J. K., Matovic, S., Inoue, W. Chronic stress dampens excitatory synaptic gain in the paraventricular nucleus of the hypothalamus. The Journal of Physiology. 596 (17), 4157-4172 (2018).
  7. Redman, S. Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system. Physiological Reviews. 70 (1), 165-198 (1990).
  8. Del Castillo, J., Katz, B. Quantal components of the end-plate potential. The Journal of physiology. 124 (3), 560-573 (1954).
  9. Stevens, C. F. Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation. Cell. 72 Suppl, 55-63 (1993).
  10. Deger, M., Helias, M., Rotter, S., Diesmann, M. Spike-timing dependence of structural plasticity explains cooperative synapse formation in the neocortex. PLoS computational biology. 8 (9), e1002689(2012).
  11. van den Pol, A. N., Wuarin, J. P., Dudek, F. E. Glutamate, the dominant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation. Science (New York, N.Y). 250 (4985), 1276-1278 (1990).
  12. Miklós, I. H., Kovács, K. J. Reorganization of synaptic inputs to the hypothalamic paraventricular nucleus during chronic psychogenic stress in rats. Biological Psychiatry. 71 (4), 301-308 (2012).
  13. Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons. Science (New York, N.Y.). 213 (4510), 898-901 (1981).
  14. Tracey, D. J., Walmsley, B. Synaptic input from identified muscle afferents to neurones of the dorsal spinocerebellar tract in the cat. The Journal of physiology. 350, 599-614 (1984).
  15. Lin, J. W., Faber, D. S. Synaptic transmission mediated by single club endings on the goldfish Mauthner cell. II. Plasticity of excitatory postsynaptic potentials. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 8 (4), 1313-1325 (1988).
  16. Atwood, H. L., Tse, F. W. Changes in binomial parameters of quantal release at crustacean motor axon terminals during presynaptic inhibition. The Journal of physiology. 402, 177-193 (1988).
  17. Li, G. L., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell’s ribbon synapse. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).
  18. Wadiche, J. I., Jahr, C. E. Multivesicular release at climbing fiber-Purkinje cell synapses. Neuron. 32 (2), 301-313 (2001).
  19. Oliet, S. H., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Bidirectional control of quantal size by synaptic activity in the hippocampus. Science (New York, N.Y.). 271 (5253), 1294-1297 (1996).
  20. Inoue, W., et al. Noradrenaline is a stress-associated metaplastic signal at GABA synapses. Nature Neuroscience. 16 (5), 605-612 (2013).
  21. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 1183-242 (2014).
  22. Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental neurology. 131 (1), 133-143 (1995).
  23. Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of neuroscience methods. 171 (1), 118-125 (2008).
  24. Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. Journal of neuroscience methods. 158 (2), 251-259 (2006).
  25. Gunn, B. G., et al. Dysfunctional astrocytic and synaptic regulation of hypothalamic glutamatergic transmission in a mouse model of early-life adversity: relevance to neurosteroids and programming of the stress response. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19534-19554 (2013).
  26. Su, H., Alroy, G., Kirson, E. D., Yaari, Y. Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (12), 4173-4182 (2001).
  27. Frankenhaeuser, B., Hodgkin, A. L. The action of calcium on the electrical properties of squid axons. The Journal of physiology. 137 (2), 218-244 (1957).
  28. Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A Comparison of Different Slicing Planes in Preservation of Major Hippocampal Pathway Fibers in the Mouse. Frontiers in neuroanatomy. 11, 107(2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Synaptic MultiplicityWhole cell Patch clampSpontaneous EPSCsMiniature EPSCsAction Potential dependent ReleaseTTX Cadmium BlockadeStrontium ACSF ApplicationGamma DGG Antagonist TestAfferent Stimulation ProtocolAccess Resistance Monitoring

İlgili makaleler