Yöntem makalesi

VirWaTest, su örnekleri virüslerin tespiti için bir nokta-of-kullanım yöntemi

DOI:

10.3791/59463

⸱

11 Mayıs 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Viruses Contaminants of Water and Food (VIRCONT), Department of Genetics, Microbiology and Statistics, Section of Microbiology, Virology and Biotechnology, University of Barcelona, 2Grupo de Investigación Biodiversidad, Medio Ambiente y Salud (BIOMAS), Facultad de Ingenierías y Ciencias Agropecuarias (FICA), Ingeniería en Biotecnología, Universidad de las Américas, 3Municipal Laboratory - Waters of Mataró, 4GenIUL

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada VirWaTest sunuyoruz, hangi kullanım noktasında su örneklerinden virüslerin konsantrasyonu ve tespiti için basit, uygun fiyatlı ve taşınabilir bir yöntemdir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsanlar ve hayvanlar tarafından atılan virüsler su kaynaklarını kirletebilir ve bu su içme, gıda sulama, yıkama, vb. için kullanıldığında insan sağlığına risk teşkil edebilir. Klasik dışkı bakteri göstergesi her zaman viral patojenlerin varlığını kontrol etmez, böylece viral patojenlerin ve viral göstergelerin tespiti, özellikle insani senaryolar ve bölgelerde risk azaltma önlemlerinin benimsenmesi için geçerlidir. su kaynaklı viral salgınlar sık görülür.

Şu anda, dışkı göstergesi bakterilerinin (FıB) ölçülmesine izin veren çeşitli ticari testler, kullanım noktasında test etmek için kullanılabilir. Ancak, bu tür ticari testler virüslerin algılanması için kullanılabilir değildir. Çevresel su örneklerindeki virüslerin algılanması, birkaç litreye daha küçük hacimlere yoğunlaşmasını gerektirir. Dahası, bir kez konsantre, virüslerin tespiti nüklenik asit ekstraksiyon ve moleküler algılama (örn., viral genomların polimeraz zincir reaksiyonu [PCR]-based) gibi yöntemlerle dayanır.

Burada açıklanan yöntem, 10 L su numuneleri virüslerin konsantrasyonu yanı sıra, basit ve taşınabilir ekipman ile kullanım noktasında viral nüklerik asitlerin çıkarılması sağlar. Bu, çeşitli virüsler için kullanım noktasında su örneklerinin test edilmesini sağlar ve insani senaryolardaki yanı sıra, donanımlı bir laboratuvarda mevcut olmayan herhangi bir bağlamda yararlıdır. Alternatif olarak, yöntem, su numuneleri ve daha fazla analiz için oda sıcaklığında bir laboratuvarda konsantre nakliye mevcut virüs konsantre sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Herhangi bir insani acil durum ilk aşamalarında, temiz su temini, sanitasyon ve hijyen erişim etkilenen bu hayatta kalmak için önemlidir. Bu nedenle, su kalitesini izlemek suyun kaynaklı salgınları önlemek için bir önceliktir. Bu kontamine su sıklıkla hastalıkların kökeni bilinmektedir, ama genellikle Hepatit E virüsü gibi viral salgınlar kaynaklarını belirlemek zordur (HEV), konvansiyonel laboratuvar yöntemlerinin kullanılabilirliği bile. Su kalitesinin kontrolü fib1,2,3,4' ün ölçülmesini temel alır. Ancak, fib yokluğunda ve Rotavirüs (RoV), norovirüs (Nov) veya HEV5,6gibi viral su kaynaklı patojenlerin varlığı arasında hiçbir korelasyon olmadığı konusunda kapsamlı olarak belgelenmiştir. Böylece, FıB 'ye dayanan su kalitesi kriterlerinin kullanılması, su kaynaklı viral patojenlerin varlığı ile ilgili risklerin hafife almasına neden olabilir. İnsan adenovirüsler (hadv) veya spesifik patojenler gibi gösterge virüslerinin gözetimi, viral patojenlere maruz kalmanın tanımlanması ve insan enfeksiyonunun potansiyel kaynağını tanımlamak için yararlı olacaktır7,8, 9,10 ve sanitasyon tedbirlerinin etkinliğini doğrulamak için11.

Bugüne kadar, bu senaryolarda virüslerin tespiti yetenekli personel ve karmaşık lojistik üzerinde dayanılır. VirWaTest (virwatest.org), kullanım noktasında su örneklerinden gelen virüslerin konsantrasyonu ve daha sonra tespiti için basit, uygun maliyetli ve taşınabilir bir yöntemin geliştirilmesine yöneliktir.

Virüs konsantrasyonu, 10 L su numunelerinin organik flocculasyonu ilkesine dayanmaktadır ve bu da virüsler daha küçük hacimlerde12,13' te kurtarılır. Flokların ya toplanır ve virüsler yapışıklıkların bir tampon eklenir ve onlar daha fazla değil, oda sıcaklığında saklanan nüklik asitler bozulması önler 2 hafta.

Nükle asit ekstraksiyon yöntemi, nüklik asitlerin adsoryat ettiği manyetik partiküllerin kullanımına dayanır. Onlar bir yıkama tampondan diğerine transfer edilebilir ve sonunda parçacıklar iliştirmek için bir manyetik pipet kullanarak elüsyon tampon içine. Viral nüklik asit süspansiyonları, PCR bazlı moleküler yöntemler kullanılarak tespit edilebilecek bir referans laboratuvarına sevk edilebilir. Her nükleik asit ekstraksiyon için, iki farklı miktarlarda numunenin kökeni enzimatik inhibisyonu dışarı kural test edilir. Alternatif olarak, minimum ekipman kullanılabilirliği ile, PCR testleri kullanım noktasında çalıştırılabilir. Tüm işlem bir güç kaynağından bağımsız olarak gerçekleştirilecek şekilde tasarlanmıştır (Şekil 1).

İnsan tarafından atılan ve yüksek konsantrasyonlarda Atıksu örneklerinde bulunan HAdV algılamak için nicel bir PCR tahlil, kullanım noktasında çalışacak şekilde adapte edilmiştir. HAdV insan dışkı viral göstergeler olarak kullanılır. MS2 bakteriyofaj için bir PCR de MS2 bu yana proses kontrolü olarak VirWaTest kullanılır adapte edilmiştir. Yöntem ilgi herhangi bir virüs tespiti için özelleştirilmiş olabilir.

Kalkınma sonrası, VirWaTest yöntemi, gerçek durumlarda protokolün uygulanması hakkında geribildirim sağlayan Orta Afrika Cumhuriyeti (RCA) ve Ekvador iki farklı ayarlarında kullanıcılar tarafından uygulandı.

Bizim bilginiz için, bu kullanım noktasında virüslerin konsantrasyonu ve algılanmasını sağlayan ilk işlemdir, herhangi bir güç kaynağı bağımsız, büyük ekipman, ve donma/soğutma koşulları. Sağlam sonuçlar elde etmek için her bir su örneğinin iki çoğaltır toplamak için tavsiye edilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hazırlama ve paketleme

Not: ambalajlanabilir malzemeler/ekipmanlar Tablo 1' de listelenir. Proses kontrolü, konsantrasyon reaktifler, nüklik asit ekstraksiyon reaktifler ve algılama reaktifleri için gerekli reaktifler ele almak için eldiven kullanın. Nüklik asit ekstraksiyonu için gerekli reaktifleri işlemek için koruyucu gözlük takın.

  1. Proses kontrolü
    1. MS2 bakteriyofaj hisse senedi kültürünü (American Type Culture Collection [ATCC] 15597-B1) içeren 1 x 1010 PFU/ml LABORATUVARıNDA ıso prosedürü 10705-1:199514' ü izleyerek hazırlayın.
    2. Sonra, 10 ml tüp içine 1 x 108 PFU içeren boru başına süspansiyon 10 μL kısım ve su 37 °c ' de Buharlaştırıcı izin. Su örneği başına bir tüp kullanın.
    3. Ayrıca, toplanan örnek başına 10 mL steril damıtılmış su içeren bir tüp hazırlayın.
  2. Konsantrasyon reaktifler
    1. Preflocculated yağsız süt çözeltisi için (PSM), 5 10 L su örnekleri konsantre aşağıdaki miktarlarda kullanın.
      1. 5 gr yağsız süt içeren plastik bir tüp hazırlayın.
      2. 16,66 g deniz tuzları içeren bir fermuar Plastik çanta hazırlayın.
      3. 500 mL damıtılmış su içeren plastik bir şişe hazırlayın.
    2. PH ayarı için gerekli reaktifleri hazırlayın. PSM pH 'Sını ve 5 10 L su örneklerini ayarlamak için aşağıdaki miktarları kullanın.
      1. 10 mL plastik boruya 5 gr sitrik asit 1-hidrat ekleyin.
        DIKKAT: göz ile temas ettiğinde sitrik asit ciddi irritasyona neden olur. Bu durumda, göz dikkatli bir şekilde su ile birkaç dakika durulayın. Eğer tahriş devam ederse, tıbbi tavsiye isteyin.
      2. 10 mL plastik tüpüne 2 gr sodyum hidroksit koyun.
        DIKKAT: Sodyum hidroksit şiddetli cilt yanıklarına ve göz hasarına neden olabilir. Yutulması durumunda, ağzını durulayın. Kusma. Eğer gözler ile temas ederse, birkaç dakika su ile dikkatli bir şekilde durulayın. Sonra, tıbbi tavsiye isteyin.
      3. 25 mL steril damıtılmış suyu plastik bir kabına koyun.
      4. Plastik bir kap içine steril distile su 50 mL koyun.
    3. Flocculation için kullanılan numune Klima poşeti hazırlayın, nükleik asitleri korumak için kullanılan koruyucu çözüm, ve nötralize poşet atılan su ve malzemeleri nötrleştirmek için. Test edilecek her 10 L su örneği için aşağıdaki tutarları kullanın.
      1. 15 g deniz tuzları ve 8 g sitrik asit 1-hidrat bir fermuar plastik torba içine klima poşet koyun.
      2. 2 ml liziz tampon (malzeme tablosu) ve 0,3 ml nüklik asit koruma ajanı (malzeme tablosu) 5 ml tüpüne ekleyin.
        Dikkat: Lysis tampon guanidin tiyosiyanat ve Triton X-100 içerir. Asit ile temas toksik gazı serbest bırakmaktadır ve yutulması, solunduğu veya deriyle temas ederse zararlı olur. Yutulması durumunda, ağzını durulayın. Kusma. Cilt ile temas ederse, bol su ile yıkayın. Sonra, tıbbi tavsiye isteyin. Nüklik asit koruma maddesi cilt ve göz tahrişine neden olur ve yutulması durumunda zararlı olur. Cilt veya gözler ile temas ederse, birkaç dakika boyunca bol su ile durulayın. Her durumda, özellikle yutulması ve iyi hissetme, tıbbi tavsiye isteyin.
      3. 4 fermuar plastik torbalara 40 g deterjan tozu koyun.
        DIKKAT: Toz deterjan göz tahrişine neden olur. Eğer gözleri ile temas halinde, birkaç dakika için bol su ile durulayın. Tahriş devam ederse veya Yutulursa, tıbbi tavsiye isteyin.
  3. Nüklik asit ekstraksiyon reaktifler
    1. 50 μL manyetik parçacıklar (malzeme tablosu) ve 1 ml etanol 96% ' i 5 ml 'lik bir tüpün içine koyun ve bağlayıcı tamponu oluşturur.
      DIKKAT: manyetik parçacıklar tamponu, asitler veya ağır metal iyonlarıyla temas ettiğinde toksik gaz oluşturan ve yutulduğunda veya deriyle temas ettiğinde toksik olan sodyum azid içerir. Eğer yutulur veya cilt ile temas, bol su ile ağız veya cilt durulayın ve tıbbi tavsiye isteyin. Etanol son derece yanıcı bir sıvı ve buharı ve ciddi göz tahrişi neden olur. Isı, sıcak yüzeyler, kıvılcımlar ve diğer herhangi bir ateşleme kaynağından uzak tutun. Cilt veya gözler ile temas ederse, bol su ile durulayın. Büyük miktarlarda su Yutulması durumunda ve/veya solunması durumunda, temiz havaya dışarı gidin. Her durumda, tıbbi tavsiye isteyin.
    2. Ekleme 500 μL, 600 μL, ve 200 μL tampon 1, 2 ve 3, sırasıyla (malzeme tablosu), üç 2 ml tüpler yıkama.
      Dikkat: yıkama tamponları, solmuş veya yutulması ve cildi ve gözleri tahriş ederse zararlı olan guanidinyum tiyosiyanat ve guanidinyum klorür içerir. Asitler ile temas çok toksik gaz bültenleri. Eğer cilt veya gözler ile temas halinde, bol su ile durulayın. Yutulması durumunda, ağız bol suyla durulayın. Kusma. Her zaman tıbbi tavsiye isteyin.
    3. 0,5 mL tüpüne 120 μL elüsyon tampon (malzeme tablosu) ekleyin.
  4. HAdV ve MS2 algılama reaktifler
    Not: bir 8-kuyu termocycler kullanılırsa, Iki farklı nüklik asit ekstraksiyon reaksiyonları her PCR tahlil aynı anda analiz edilebilir. Tüm PCR teknolojileri için, 1,5 mL tüplerine molekül biyoloji suyu hazırlayın.
    1. HAdV algılama
      1. 10 μL 22,5 μM AdF ileri astar, 10 μL 22,5 μM AdR ters astar ve 5 μL 11,25 μM AdP prob (Tablo 2) içeren bir karışımı hazırlayın.
      2. 2,5 bir tüp şeridi 1 ' den 8 ' e kadar boru karışımı μL ekleyin. Oda sıcaklığında kurutun, tüpleri kapatın ve onları ışıktan korunmaya devam edin.
      3. Kesme Strip iki şerit içine bölme: Tüpler 1-5 ve tüpler 6-8.
      4. Güçlendirilmiş HAdV bölgesinin nükvotit dizisini içeren DNA süspansiyonlarını seri olarak seyreltme hazırlayın. 1 x 105, 1 x 107ve 1 x 109 GC/ml tüplere 6-8 Içeren hava-kuru 1 μL süspansiyonlar.
        Not: astarları, sondayı ve havayı kurutulan süspansiyonları içeren tüpleri ışığa karşı korunur.
    2. MS2 algılama
      1. 10 μL 25 μm pecson-2F ileri astar, 10 μL 25 μM pecson-2R ters astar ve 2,5 μL 25 μM PecP-2 prob (Tablo 2) içeren bir karışımı hazırlayın.
      2. 2,25 bir tüp şeridi 1 ' den 8 ' e kadar boru karışımı μL ekleyin. Oda sıcaklığında kurutun, tüpleri kapatın ve onları ışıktan korunmaya devam edin.
      3. Kesme Strip iki şerit içine bölme: Tüpler 1-5 ve tüpler 6-8.
      4. Adım 1.4.1.4 olarak devam edin ama bunun yerine MS2 için tasarlanmış standart bir süspansiyon kullanın.

2. viral konsantrasyon

Not: örnek toplama, reaktif hazırlama, Flocculation, flokların ya koleksiyonu ve atık imha prosedürleri sırasında her zaman eldiven kullanın. Reaktif hazırlama prosedürü sırasında koruyucu gözlük takın.

  1. Örnek toplama
    1. Bir kapak ile düz bir alt kova 10 L su örneği toplayın. Her örnek için en az iki çoğaltır toplayın.
      Not: Pelet görselleştirmek için net kova kullanmak önemlidir. Su numunesi askıya alınan malzeme (örneğin, kum, yosun) içeriyorsa, tortu izin ve, daha sonra, yeni bir kova su süpernatant toplamak.
    2. Her su örneği için toplanan hacminin yanı sıra konum ve tahsilat tarihini de kaydedin.
    3. Bir kova desteği altında bir pil bağlı bir manyetik karıştırıcı koymak ve destek üzerine su örneği içeren kova yerleştirin.
      Not: taze bir yerde düz bir yüzey arayın ve doğrudan güneş ışığından su örnekleri içeren kova tutun.
  2. Reaktifler hazırlama
    1. pH ayar reaktifleri
      1. Sitrik asit tozu ve sodyum hidroksit Pelet içeren tencere içine dökün 25 ve 50 mL distile su, sırasıyla.
      2. Sitrik asit ve sodyum hidroksit tamamen çözününceye kadar elle yavaşça sallayın.
        DIKKAT: suyu sodyum hidroksit pelletine dökmeyin. Bunun yerine, su üzerinde sodyum hidroksit Pellet dökün.
    2. Preflocculated yağsız süt
      1. Bir manyetik karıştırıcı üzerinde bir stand-up çanta yerleştirin ve içine damıtılmış su 500 mL dökün. Çanta içine karıştırma mıknatıs bırakın ve manyetik karıştırıcı açın.
      2. Bir deniz tuzu poşeti ve bir yağsız süt tüp içeriğini stand-up çantasına dökün ve onları çözmek için orta hızda 5 dakika karıştırın.
      3. PH 3,4 ile 3,6 arasında olduğundan emin olmak için bir Pasteur pipet kullanarak PSM çözümüne 3 mL sitrik asit ekleyin. PH gösterge şeritleri kullanılarak PSM çözeltisi pH 'Sını ölçün. PH 3,5 'e yaklaştıkça daha küçük miktarlarda sitrik asit ve sodyum hidroksit ekleyin.
      4. Manyetik karıştırıcı kapatın ve flokların ya görünür olduğundan emin olun. Flocs görselleştirmeye yardımcı olmak için bir el feneri kullanın.
  3. Flokülasyon
    1. Su içine karıştırma mıknatıs bırakın, maksimum hızda manyetik karıştırıcı ayarlayın ve açın. Karıştırma mıknatıs dönmeye başlar emin olun.
    2. Bir proses kontrol tüpüne 10 mL distile su ekleyin. Viral stok rehydrate ve suya çözüm dökmek için birkaç kez tüp tersine çevirin.
    3. Su içine bir örnek Klima poşet içeriğini dökün ve 5 dakika boyunca karıştırın.
    4. PH gösterge şeritleri kullanılarak su örneğinin pH değerini ölçün. PH 3,4 ve 3,6 arasında yatıyor emin olmak için su örneği için sitrik asit veya sodyum hidroksit birkaç damla ekleyin. PH 3,5 'e yaklaştıkça daha küçük miktarlarda sitrik asit ve sodyum hidroksit ekleyin.
    5. 100 mL PSM çözüm 100 mL kapsayıcı kullanarak ekleyin.
    6. Kapağı ile kova mühür, minimum hızda manyetik karıştırıcı ayarlamak ve 8 h için karıştırma su bırakın.
    7. Manyetik karıştırıcı kapatın ve su hala en az 5 h için flokların ya yerleşmek izin vermek için izin verin.
  4. FLOC koleksiyonu
    1. Pipet kumandasının, iki pipetin ve plastik tüpten oluşan bir Sifonlama sistemi inşa ederek suyun flocs üzerinde boşaltma için su süpernatant Aspire.
      1. Pipet denetleyiciye 10 mL 'Lik bant ucu pipet takın. Sonra, Pipet ucunu plastik tüpe takın.
      2. 10 mL 'Lik açık uçlu pipetin filtresini Cımbız kullanarak çıkarın ve pipeti plastik tüpe takın.
    2. Yere boş bir kova yerleştirin.
    3. Açık uçlu pipetin ucunu suya batırın. Flocs rahatsız önlemek için su yüzeyine yakın tutmak için emin olun. Su süpernatant bant-End pipet ulaşıncaya kadar aspirate.
    4. Plastik tüpü teyp-uç pipete bağlı olarak çimdik ve pipetten ayırın.
    5. Tüpü boş bir kova içine yerleştirin. Boş kova su akışını izin tüp üzerindeki basıncı bırakın.
    6. Su seviyesini karıştırma mıknatıs ulaşmak ve kova uzak pipet taşımak üzere olduğunda su akışını durdurmak için plastik tüp çimdik.
    7. Flokların ya pelletini ve 500 ml stand-up plastik torba içine dökün kova sallayın. Flokların ya 1 h daha fazla razı izin verin.
    8. 50 ml 'lik pipet ve manuel pipet kontrolörü kullanarak su süpernatant dikkatle Aspire, flocs rahatsız kaçınarak.
    9. Bir 100 ml pipet kullanarak flokların ya aspirate ve 50 ml dereceli santrifüjli tüp aktarmak. Örnek konsantre son hacminin aşağı Not ve 1 mL bir Pasteur pipet kullanarak, koruyucu çözüm içeren 5 mL tüp aktarın.
      Not: konsantre numunenin son hacminin mümkün olduğunca doğru ve kayıtlı olarak ölçülmesi için Santrifüjlü tüpün mezun olması önemlidir.
    10. Alanda nüklik asit ekstraksiyon gerçekleştirin. Alternatif olarak, virüs içeren koruyucu solüsyonu 15 güne kadar 20-30 °C ' de saklayın veya daha fazla analiz için bir referans laboratuvarına sevk etme.
  5. Atık imha ve malzeme yeniden kullanımı
    1. Bir nötralize Ajan poşet içeriğini atılan su içeren kova ekleyin. Su karıştırın ve sonra, 30 dakika boyunca hala bırakın.
    2. Tedavi edilen suyu genel atık olarak atın.
    3. Pipetleri ve plastik tüpü kovanın içine yerleştirin. Kova su ile doldurun ve bir nötralize Ajan poşet içeriğine dökün.
    4. Onları sterilize etmek için en az 30 dakika yıkayın ve kalan nötralizasyon ajanı kaldırmak için bol temiz su ile durulayın.

3. nüklik asit ekstraksiyonu

Not: eldivenleri kullanın ve nüklik asit ekstraksiyon prosedürü sırasında her zaman koruyucu gözlük takın.

  1. Manyetik pipet çalışması
    1. Ekstraksiyon yapmadan önce manyetik pipetin çalışmasını tanıyın.
  2. Nüklik asit ekstraksiyon
    1. Ekstraksiyon için gerekli reaktifler içeren tüpleri, soldan sağa doğru: bağlayıcı tampon, yıkama tamponları ve elüsyon tampon olarak düzenleyin. Numunelerin sayısına göre uygun sayıda tüp ayarlayın veya analiz ediliyor çoğaltır.
    2. 1 mL örnek konsantresi, tek kullanımlık Pasteur pipet kullanarak bağlayıcı tamponu içeren tüpe aktarın. Solüsyonu homojenize etmek için tüp 8X ' i 10X 'a çevirin.
    3. Çözümü, Güneş enerjili orbital ya da el ile kullanarak sürekli karıştırma sırasında oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kulkarın.
    4. Manyetik pipet ve üç yıkama tamponları için yeniden kullanılabilir temiz bir uç kullanarak manyetik parçacıklar toplayın.
    5. Manyetik parçacıkları 500 içeren tüpün içine bırakın. 30 s ucu ile çözümü yavaşça sallayarak yıkayın ve onları toplayın.
    6. Manyetik parçacıkları, 600 μL yıkama tamponu 2 içeren tüpüne aktarın. 30 s ucu ile çözümü yavaşça sallayarak yıkayın ve onları toplayın.
    7. Manyetik parçacıkları, 200 μL yıkama tamponunun 3 ' ü içeren tüpüne aktarın. 30 s ucu ile çözümü yavaşça sallayarak yıkayın ve onları toplayın.
    8. Manyetik parçacıkları, elüsyon tamponunu içeren tüpün içine bırakın ve ucu atın.
    9. Güneş enerjili orbital kullanarak sürekli karıştırma sırasında çözüm oda sıcaklığında 5 dakika boyunca kulkarın.
      Not: manyetik parçacıkların elüsyon tamponunun içinde karıştırma önemli bir adımdır. Bir orbital eksikliği durumunda, sürekli el kuluçbe süresi boyunca karıştırın.
    10. Manyetik Pipetteki ucu yeni bir tane ile değiştirin ve manyetik partikülleri elüsyon tampondan toplayın. Moleküler algılama yöntemlerine müdahale ettikleri için manyetik partikülleri elüsyon tamponunu tamamen kaldırtığınızdan emin olun.
    11. Ucunu ona bağlı parçacıklar ile atın. PCR analizine devam edin, elüsyon tamponunu bir referans laboratuvarına sevk edin veya daha fazla analiz için ek tamponu 4 °C ' de saklayın.

4. pil ile çalışan sekiz-tüp gerçek zamanlı termocycler ile viral algılama

Not: nüklik asit algılama prosedürü sırasında eldiven kullanın ve her zaman koruyucu gözlük takın. Çapraz kontaminasyonu önlemek için yeni bir PCR deneyi yapılırken eldivenleri yenilerini değiştirin.

  1. HAdV nicel PCR
    1. 2, 4 ve 5 numaralı tüplere 14 μL çekirdeksiz su ekleyin.
    2. 1-5 tüplere 4 μL PCR karışımı ekleyin.
    3. Örnek A 'dan tüp 1 ' e ve 14 μL 'den Tüp 3 ' e örnek B 'ye 14 μL nükleik asit ekstraksiyonu ekleyin.
    4. 2 μL ayıklanan nükleik asitleri, örnek A 'dan tüp 2 ' ye ve 2 μL 'ye örnek B 'den tüp 4 ' e ekleyin. Beş-tüp şeridi kapatın.
    5. 6, 7 ve 8 numaralı tüplere 14 μL çekirdeksiz su ekleyin.
    6. 6, 7 ve 8 numaralı tüplere bu karışımı 4 μL ekleyin ve kapatın.
    7. Her iki şerit termocycler koyun ve uygun çalıştırmak seçin (Tablo 3).
    8. Su tüpünü atın ve elde edilen nüklrik asidi dondurucuda, mümkünse ya da yoksa, ikinci bir testin gerçekleştirilmesi gerektiğinde ışığa karşı korunan taze bir yerde tutun.
    9. Mikropipetler, raf, çalışma malzemesi ve tüm malzemeyi düzgün bir nüklik asit temizleyici ile temizleyin ve kullanılan ucu, eldivenleri ve tüpleri içeren plastik torbası atın.
      DIKKAT: Nüklik asit çıkarıcı çok yanıcı bir sıvı ve buharıdır. Sprey sis nefes ve gözler veya cilt ile sıvı herhangi bir temas önlemek etmeyin. Aksi takdirde, hemen bol su ile durulayın ve tıbbi tavsiye isteyin.
    10. Sonuçları toplayın ve elde edilen verileri analiz edin.
  2. MS2 nicel PCR
    1. 2, 4 ve 5 numaralı tüplere 14 μL çekirdeksiz su ekleyin.
    2. 4 μL PCR karışımı ekleyin ve 0,5 μL ters transkriptaz enzimi için tüpler 1-5.
    3. Örnek A 'dan tüp 1 ' e ve 14 μL 'den Tüp 3 ' e örnek B 'ye 14 μL nükleik asit ekstraksiyonu ekleyin.
    4. 1 μL ayıklanan nükleik asitleri, örnek A 'dan tüp 2 ' ye ve 1 μL 'ye örnek B 'den tüp 4 ' e ekleyin. Beş-tüp şeridi kapatın.
    5. 15,5, 5, 6, 7 ve 8 numaralı tüplere atom içi ücretsiz su ekleyin ve kapatın.
    6. 4 μL PCR mix ve 0,5 μL ters transkriptaz enzim 6, 7 ve 8 Tüpler ekleyin.
    7. Her iki şerit termocycler koyun ve uygun çalıştırmak seçin (Tablo 3).
    8. 4.1.10 için 4.1.8 adımlarda açıklandığı gibi devam edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yöntem geliştirme

Bu prosedür GenIUL ve Oxfam ıntermón işbirliği ile su ve gıda virüsler Kontaminants Laboratuvarı geliştirilmiştir. Bu üç farklı adımda oluşur. Birincisi, viral parçacık konsantrasyonu, daha önce12,17,18açıklanan bir yağsız süt flokülasyon yöntemi bir adaptasyon olduğunu. Orijinal Yöntem bir güç kaynağı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

VirWaTest yöntemi, deneyimli olmayan kullanıcılar tarafından kullanım noktasında virüs ve nüklik asit ekstraksiyonu su örneklerinden konsantrasyonu sağlar. Bu, uygun maliyetli, hızlı ve basit bir protokoldür. Konsantrasyon, düşük pH ve yüksek iletkenlik koşullarında yağsız süt proteinlerinin, virüslerin adsorbe olduğu flokların ya içine toplu hale getiren, yağsız süt kullanılarak organik flocculasyon ilkesine dayanır. Ne zaman flokların ya sediment, onları toplamak kolay, 10 L su konsantre mümkün hale, geleneksel ultrace...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

VirWaTest bir araştırma projesi HıF tarafından finanse edildi (Insani yenilik fonları) ELHRA programı (geliştirme öğrenme & Insani yardım için araştırma). Yazarlar bu çalışmada nazikçe işbirliği yapan WASH ekipleri kabul eder. Ekvador numunelerin Analizi Oxfam Ecuador ve Dirección de araştırma de la Universidad de Las Americas tarafından finanse edildi (AMB. BRT. 17.01). S. Bofill-Mas Barcelona Üniversitesi 'nde bir Serra-Hunter adam.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
5x SICAK YANGINPol Probu qPCR Mix Plus (ROX)Solis BioDyne08-14-00001Solis Biodyne'in 5x HOT FIREPol Probu qPCR Mix Plus (qPCR Karışımı), 50 Reaksiyon
Kapaklı 8 Mikrotüp ŞeritlerdD Biolab840637Düşük Profilli, İnce Duvarlı, Kantitatif ve Kalitatif PCR
Pilleri ve Manyetik Karıştırıcı GenIUL için Güç Adaptörleri90001167412V araba gücü içerir adaptör
Kova DesteğiGenIUL900011648Alüminyum destek
Kovası, 10 LCater4You10LTRPolipropilen, Kurcalamaya Dayanıklı, Berrak renkli
Santrifüj Tüpü, 50 mLLabBox CTSP-E50-050Polipropilen, Steril, Dereceli, Etekli
Sitrik Asit 1-Hidrat, 500 gPanReac AppliChem1410181211Saf, İlaç Sınıfı, 1 Kilogram
Şeffaf PET ŞişeLabBoxFPET-500-088Şeffaf Renk, PET, Kapak Dahil Değildir
Difco Yağsız Süt, 500 gBecton Dickinson232100Susuz
DNA/RNA Kalkanı, 250 mLZymo ResearchR1100-250DNA/RNA Koruma Ortamı, 250 mL
Easy9 Pipet Kontrol CihazıLabBoxEAS9-001-0010.3 & mu; m filtre, 0,1 ila 100 mL arası pipetler, Otoklavlanabilir silikon pipet tutucu
Eppendorf Tüpü, 0,5 mLEppendorf0030121023Polipropilen, Safe-Lock
Eppendorf Tüpü, 2 mLEppendorf0030120094Polipropilen, Safe-Lock
Eppendorf Tüpü, 5 mLdD Biolab999542Polipropilen, Steril,
Dereceli Etanol %96 V/V, 1 LPanreac AppliChem361085-1611UV, IR  ve HPLC
Laboratuvar CımbızlarıLabBoxFORS-007-002İnce, Kavisli Uçlu, L= 120 mm
Manyetik KarıştırıcıGenIUL900017000Pille Çalışan
MarkerdD Biolab929203Siyah, Ekstra İnce Uç, Suya Dayanıklı, Hızlı Kuruyan, Plastik ve Cam Eşyalar
İçin Mikrotüpler için Mikro Rota-RackdD Biolab377824 Modül, U x G x Y= 208 x 100 x 100 mm
Mini8 Gerçek Zamanlı PCR DöngüleyiciCoyote Biosciences, ÇinMini-8Taşınabilir, 12V Güç Kaynakları veya Harici Pillerle Çalışır, İki Kanal, 8 Tüp Kapasitesi
NucliSens Lysis BufferBiomerieux20029248 İzolasyona kadar Reaktifler, Ortam Sıcaklığında Saklayın
Açık Uçlu Serolojik Pipet, 10 mLDeltalab900136NSteril, Ayrı Ayrı Sarılmış (Kağıt/Plastik)
Şişeler İçinVidalı Kapak PP28LabBoxTP28-004-020
pH Gösterge ŞeridiLabBoxWSPH-001-001Aralık pH 2.8 ila pH 4.4, Paket Başına 50 Şerit
Plastik Test TüpüQuimikals300913Kapak İçeriği
Polietilen Pastör Pipet LabBoxPIPP-003-500Dereceli, 7 mL Toplam Hacim, Vidalı Kapaklı Steril
Olmayan Polipropilen Vidalı Şişe, 150 mLDeltalab409726Vidalı kapak, Steril, 100 mL'ye kadar dereceli
Vidalı Kapaklı Polipropilen Vidalı Matara, 60 mLDeltalab409526GVidalı kapak, Steril, 50 mL'ye kadar
Dereceli Toz Toz Deterjan-Çamaşır yıkamak için Normal Toz Sabun
Manyetik KarıştırıcıGenIULiçin Güç Kabloları900011692Piller ve manyetik karıştırıcılar arasındaki bağlantı
QuickPick Manyetik AletBioNobile24001Manyetik parçacıklar için el aleti
Kutuda QuickPick İpuçlarıBioNobile24296RNaz İçermeyen, Otoklavlanmış, 96 Ünite
QuickPick XL gDNA Manyetik ParçacıklarBioNobileSN511003.2 mL
DenizTuzları Sigma-AldrichS9883-500GOkyanus suyunun çözünmüş tuzlarının bileşimine çok benzeyen yapay bir tuz karışımı
Silikon BoruLabBoxSILT-006-0055 Metrelik Rulo, İç  ø x Dış  ø= 6 x 10 mm
Sodyum Hidroksit Peletler, %98,5 - 100,5VWR Kimyasalları28244295Peletler, 1 Kg
Güneş Döner PlatformSOL-EXPERT Grubu70020Akrilik Plaka, 10 RPM, 300 Grama Kadar Destekler
SOLIScript 1 Adımlı Prob KitiSolis BioDyne08-57-00250Solis Biodyne'in 5x Tek Adımlı Prob Karışımını (qPCR Karışımı) ve 40x Tek Adımlı SOLIScript Karışımını (Ters Transkriptaz Enzimi) İçerir, 250 Reaksiyon
SPEEDTOOLS RNA Virüs Ekstraksiyon KitiBioTools21.141-4197BioTools'un BAW tamponunu (yıkama tamponu 1), BAV3 tamponunu (yıkama tamponu 2 ve 3) ve BRE tamponunu (elüsyon tamponu) içerir.
SpinBar Okhaedral Karıştırma MıknatısıdD Biolab045926Pivot Halkası, L x  ø = 38 x 8 mm, Mavi
Bant Uçlu Serolojik Pipet, 10 mLDeltalabPN10E1Steril, Ayrı Ayrı Sarılmış (Kağıt/Plastik)
Bant Uçlu Serolojik Pipet, 50 mLDeltalab900043Steril, Ayrı Ayrı Sarılmış (Kağıt/Plastik)
Termi-DNA-Tor - Nükleik Asit SökücüBioTools22001-4291Malzeme ve yüzeylerden nükleik asitlerin, bakterilerin, mantarların ve mikoplazmanın uzaklaştırılması, 450 mL
Su Moleküler Biyoloji Reaktifi, 1LSigma-AldrichW4502-1LNükleaz ve Proteaz İçermez, 0.1 & mu; m Filtreli
Whirl-Pak Torba, 540 mLDeltalab200361Sabit alt
Fermuarlı Kilit Düz ÇantaLabBoxBZIP-080-100Polietilen, U x G= 120 x 80 mm
, için Uyarlanmıştır için PET PE ,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. The Sphere Project. The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , Practical Action Publishing. Rugby, UK. https://www.spherestandards.org/wp-content/uploads/2018/06/Sphere_Handbook_2011_English.pdf (2011).
  2. Bartram, J., et al. Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/handle/10665/75141 (2009).
  3. World Health Organization. Guidelines for Drinking-water Quality. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548151_eng.pdf?ua=1 (2011).
  4. World Health Organization. 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/177752/1/9789241509145_eng.pdf?ua=1 (2015).
  5. Girones, R., et al. Molecular detection of pathogens in water - The pros and cons of molecular techniques. Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).
  6. Rodriguez-Manzano, J., et al. Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water. Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).
  7. Puig, M., et al. Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification. Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).
  8. Carter, M. J. Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection. Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).
  9. Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage. Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).
  10. Bofill-Mas, S., et al. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).
  11. Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator. Water Research. 96, 308-326 (2016).
  12. Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
  13. Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).
  14. International Organization for Standardization. ISO 10705-1:1995: Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , https://www.iso.org/standard/18794.html (1995).
  15. Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).
  16. Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).
  17. Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay. Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).
  18. Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. (58), e2820(2011).
  19. Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Vir s TespitiViral KonsantrasyonN kleik Asit EkstraksiyonuVirWaTest Y ntemiManyetik Partik llerPCR Analizlerinsan Adenovir sleriMS2 Kontrol

İlgili makaleler