Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Tip 2 diyabet ile Ilişkisi olmayan alkollü steatohepatit için gelişmiş bir Murine modeli

6.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/59470

⸱

26 Nisan 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Endocrinology & Metabolism Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, 2Berlin Institute of Health (BIH), 3Berlin-Brandenburg Center for Regenerative Therapies (BCRT), Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, 4DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), 5Institute of Medical Immunology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, 6Julius Wolff Institute (JWI) and Center for Musculoskeletal Surgery, Charité - Universitätsmedizin Berlin, Berlin, Germany, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Alkolsüz steatohepatiti için basit ve güvenilir bir diyet kaynaklı kemirgen hayvan modeli (NASH) tarif edilir, hayvanlar ve özel bir yüksek yağ diyet uygulanması SPF olmayan konut aracılığıyla elde. Biz karaciğer ve adipoz immün hücre alt kümeleri tanımlamak için insan immünolojik koşulları farları çevresel mikroplar maruz tarafından yeniden tanımlamakta.

Özet

Obezite kronik düşük dereceli inflamasyon ve insülin direnci ile ilişkilidir, tip 2 diyabet ve alkolsüz steatohepatitler (NASH) gibi kronik metabolik hastalıkların artan prevalansı katkıda bulunur. Son araştırmalar, Pro-inflamatuar immün hücrelerin obez hipertrofik yağ dokusu ve karaciğer infiltrasyon kurdu. Metabolik homeostaz bağlamında bağışıklık hücrelerinin ortaya çıkan önemi göz önüne alındığında, kritik bir ihtiyaç türü 2 diyabet ve NASH gelişimi sırasında değişiklik ölçmek ve karakterize etmektir. Ancak, insan NASH tipik patofizyolojik özellikleri neden hayvan modelleri seyrek vardır.

Bu yazıda, yüksek yağlı diyet (HFD) fareler tarafından kurulan, özel olmayan patojen içermeyen (SPF) koşullar altında, bir NASH 'in güvenilir bir fare modelinde karaciğer ve adipoz dokusundan izole edilen bağışıklık hücresi alt kümelerini tanımlamak için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. en az yedi hafta için bariyer. SPF olmayan koşullarda farelerin işlenmesini, dokuların sindirimi ve makrofajların, doğal katil (NK) hücrelerinin, dendritik hücrelerin, B ve T hücresi alt setlerinin akış sitometri tarafından belirlenmesini gösteriyoruz. SPF HFD fareler ve SPF olmayan farelerden temsilci akış sitometri araziler sağlanmaktadır. Güvenilir ve yorumlanabilir veriler elde etmek için, antikorların kullanımı, doku sindirimi için doğru ve hassas Yöntemler ve akış sitometri deneylerinde uygun şekilde gating önemli unsurlardır.

SPF dışı koşullarda ve mikrobiyal antijenlere spesifik olmayan maruz kalmalarına neden olan farelerde fizyolojik antijen pozlamasını geri yükleme müdahalesi, immünolojik değişiklikler arasındaki bağlantıyı araştırmak için ilgili bir araç sağlayabilir, diyet kaynaklı Obezite ve ilgili uzun vadeli komplikasyonlar.

Giriş

Obezite multifokal bir bozukluk ve kalp hastalığı, inme, alkolsüz steatohepatit (NASH), tip 2 diyabet (T2D) ve bazı kanser türleri geliştirmek için önemli bir risk faktörüdür. Obezite prevalansı hızla küresel olarak artmaktadır. Bugün, 2.100.000.000 kişi-dünyanın nüfusu yaklaşık% 30-ya obez ya da kilolu1vardır. Obezite-ilişkili insülin direnci T2D için yol açabilir, zaman tükenmiş pankreatik Islet Beta hücreleri glikoz homeostazı korumak için insülin için artan ihtiyaç telafi etmek için başarısız2.

Adipoz dokusu adipanosit, endotel hücreler, fibroblastlar ve immün hücreler dahil olmak üzere çeşitli hücre türlerinden oluşur. Obezitenin ilerlemesi sırasında, immün hücrelerin sayısının ve aktivitesindeki değişiklikler hipertrofik adipoz dokusunun düşük dereceli iltihaplanmasına yol açabilir3,4. Özellikle, aşırı enerji alımı, kronik yüksek kan şekeri, trigliserid ve serbest yağ asitleri seviyeleri ile birlikte, adiposit hipoksi, endoplazmik retikulum stres, bozulmuş mitokondriyal fonksiyon ve yol açar bulunmuştur Gelişmiş sitokin salgılanması, Pro-inflamatuar yağ immün hücrelerin aktivasyonu ile sonuçlanan5,6. Geçmiş araştırmalar esas olarak doğuştan gelen bağışıklık odaklı, ama daha yakın zamanda adaptif bağışıklık hücreleri (T ve B hücreleri) glikoz homeostaz önemli regülatörler olarak ortaya çıkmıştır. İnflamatuar (CD8+ T hücreleri, Th1 ve B hücreleri dahil) veya öncelikle düzenleyici fonksiyonlar (düzenleyici T (Treg) hücreleri, TH2 hücreleri dahil) ve hem şiddetlendirebilir ya da insülin direnci karşı korumak7,8 , 9' a kadar.

Ayrıca, obezite steatohepatiti nasıl artırdığını açıklamak için çeşitli mekanizmalar önerildi, adipoz dokusu ile sitokinlerin artan üretimi de dahil olmak üzere10. Fizyolojik olmayan yağlı karaciğer hastalığının ilerici formu ve gelişmiş ülkelerde büyük bir sağlık yükünü kullanarak histolojik olarak balonlu hepatositler, lipid birikimi, fibrozis ve perikelüler inflamasyon ile karakterize edilir ve Siroz, son aşama karaciğer hastalığı veya hepatosellüler karsinom. Çeşitli rejim (örneğin metiyonin ve kolin eksikliği diyet11) olmayan insan hayvan modellerinde Nash benzeri karaciğer patolojisine neden olduğu bilinmektedir, ama bu yaklaşımların çoğu Nash insan koşulları ve metabolik özetlemek yok Onlar ya spesifik gen nakavt, fizyolojik olmayan diyet manipülasyonları veya eksikliği insülin direnci insan NASH tipik gerektirir gibi sonuçlar. Ayrıca, metabolik hastalıkların temel mekanizmalarının anlayışımız Şu anda standart spesifik patojen içermeyen (SPF) koşullar altında bulunan laboratuar fareler ile yürütülen deneyler dayanmaktadır. Bu bariyer tesisleri anormal hijyen ve insanlar karşılaşmak zorunda mikrobiyal çeşitlilik dikkate değil, hangi klinik yaklaşımlar hayvan çalışmaları çeviri sürecinde zorluklar için hesap olabilir12,13 , 14oldu.

İnsan immünolojik koşulları üreten gelişmiş bir fare modelinde insülin direnci ve Nash gelişimi sırasında adipoz doku ve karaciğer farklı immün hücre alt kümeleri araştırmak için, fareler yarı steril bireysel kafeslerde yer aldı Bariyersiz koşullar. Fareler antijen maruz koşullar altında bulunan NASH-benzeri karaciğer patolojisi zaten 15 hafta yüksek yağlı diyet (HFD) besleme13sonra geliştirilmiştir. Yaş eşlemeli SPF fareler ile karşılaştırıldığında macrovesicular steatosis, hepatik infiltrasyon ve bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu geliştirdi.

Bu yazıda, NASH modelinde fare adipoz dokusu ve karaciğerinden bağışıklık hücresi alt kümelerini tanımlamak ve saymak için sağlam bir akış sitometri Analizi açıklanmaktadır. Akış sitometri analizi, RT-PCR veya immünhistokimya yaklaşımlarının aksine, tek hücrelerin birden çok parametrenin aynı anda algılanmasını sağlar.

Özetle, bizim çalışma insülin direnci ve NASH ve aynı zamanda insan durumuna sadakat sergiler altta yatan mekanizmaları gelişimini araştırmak için kısa vadeli HFD bir fare modeli sunuyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışma, kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi gözetiminde Ulusal Sağlık Enstitüleri ve hayvan refah Yasası 'nın bakım ve laboratuar hayvanlarının kullanımı kılavuzu 'Na uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Hayvan protokolleri, Almanya 'nın Charité Berlin 'in kurumsal etik yönergelerine göre yürütülmüştür ve Landesamt für Gesundheit und soziales tarafından onaylanmış ve VARıŞ yönergelerine uymalıdır.

1. diyet kaynaklı hayvan modeli steatohepatiti

  1. Transfer fareler (C57Bl/6J, erkek) 4 hafta yaş SPF olmayan konut için ve sürekli çevre patojenleri/antijenler geniş bir yelpazede onları açığa. Antijenler bu şekilde hava geçişi ile dağıtıldığı için laboratuar hayvanlarının günlük olarak işlenmesi ile pozlama garantisi.
  2. 22 °C sıcaklıkta 12 h:12 h ışık/karanlık döngüsünde geleneksel filtrelerle açık caging sistemlerinde fareler (C57Bl/6J, Erkek, 12 haftalık) koruyun. Deneysel diyet ve yatak takımları ışınlama veya otoklav yapmayın. Maske veya hairnet olmadan hayvan konut tesisi erişin. Hayvan odaları arasındaki kapıları açın. Hava duşu kullanmayın.
  3. Antijenlerin hava geçişi ile dağıtılabilmesi için laboratuar hayvanlarının günlük olarak işlenmesi ve odaları düzenli olarak değiştirme garantisi. Laboratuvar farelerinin yanındaki odalarda yer alan memelili laboratuar hayvanlarının yataklarından antijenlere günlük olmayan spesifik mikrobiyal maruz kalma ile kirli konut tamamlayıcı.
  4. CD44-CD62L- efektör belleği CD4+ ve, kan ve dalak akış sitometri kullanarak (refefence13açıklandığı gibi) CD8+ T hücrelerin oranlarını ölçmek.
    Not: Bu bağlamda biz bir artış tanımlanan 20% efektör bellek CD8+ t hücreler gelen CD8+ t hücreler yeterli mikrobiyal pozlama kanıt olarak.
  5. Start HFD (60 kj% yağ, 19 kj% protein ve 21 kj%% 6 sakaroz içeriği ile su karbonhidratlar ve reklam Isteğe bağlı tüketimi ile 5 hafta eski C57Bl/6J erkek fareler için 7-15 hafta. HFD içermelidir 60% kJ yağ (yukarıda açıklandığı gibi) amacıyla deney boyunca insülin direnci gelişimini teşvik etmek.
    Not: Hematoxylin boyama yapılmalıdır ve hepatosit balon olarak histolojik özellikleri, Mallory denk organları, bağışıklık hücresi infiltrasyonu ve makroveziküler steatozis NASH benzeri karaciğer patolojisini göstermek için bulunmalıdır (referans olarak gösterildiği gibi 13).

2. reaktifler ve çözümlerin hazırlanması

  1. Hazırlamak 70% etanol, fosfat tamponlu tuz (PBS, kalsiyum ve magnezyum olmadan) ile desteklenmektedir 0,5% BSA ve ACK (amonyum-klorür-potasyum) lizis tampon.
  2. Boyama tamponu
    1. % 2 FCS PBS elde etmek için 500 mL PBS 'de 10 mL fetal buzağı serumu (FCS) çözülür. Kullanmadan önce buz üzerinde boyama tampon yerleştirin.
    2. 4 °C ' de plastik bir şişede mağaza çözeltisi.
  3. Adipoz doku sindirimi için collagenase solüsyonu
    1. % 0,5 BSA/PBS elde etmek için 500 ml PBS 'de Sığır serum albümin (BSA) 2,5 g çözülür.
    2. 10 mM CaCl2 çözeltisi elde etmek Için 10 mL% 0,5 BSA/PBS 'de cacl2 74,5 g 'yi eritin.
    3. 10 mm CAcl2 PBS ile 0,5% BSA her ml ( malzeme tablosunabakın) kolajenaz tip II 1 mg ekleyin.
    4. Yağ dokusu örneğinden g başına 3 mL collagenaz Özet çözeltisi hazırlayın. Her izolasyon için taze kolajenaz solüsyonu hazırlayın.
  4. Karaciğer dokusu sindirimi için collagenase solüsyonu
    1. % 0,5 BSA HBSS elde etmek için Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) 500 mL 'de BSA 2,5 g çözülür.
    2. % 2 FCS 0,5% BSA/HBSS elde etmek için 500 mL 0,5% BSA/HBSS 'de 10 mL FCS ekleyin.
    3. Eklemek 0,5 mg kolajenaz tip IV ( malzeme tablosunabakın) her ml için 2% FCS 0,5% BSA/HBSS.
    4. Ekleme 0,02 ml başına DNase mg 2% FCS 0,5% BSA/HBSS kolajenaz solüsyonu.
    5. Hazırlamak 13 karaciğer dokusu örneği başına kolajenaz Özet çözüm ml.
    6. Her izolasyon için taze kolajenaz solüsyonu hazırlayın.

3. tek hücreli süspansiyonlar üretimi

  1. Adipose doku sindirimi
    1. İsofluran anestezisi aracılığıyla ötenize fareler servikal dislocation izledi. % 70 etanol ile göğüs sprey. Dikkatle plevral boşluğu ve kalp açığa çıkarmak için kaburga kafesi tüm uzunluğu boyunca integument ve abdominal duvar üzerinden 5-6 cm merkezi kesi yapmak.
      Not: Altta yatan organlara zarar verme ve makas ipuçlarını koru.
    2. Bir 26 G iğne kullanarak sol ventrikül tepe içinde% 0,9 tuz çözeltisi en az 10 mL enjekte.
      Not: Başarılı perfüzyon karaciğer haşlama tarafından belirtilmiştir.
    3. Makas ile periton boşluğu açın ve ince kavisli makas ile her tarafında perigonadal Yağ pedleri kesip. İnce kavisli makas ile gonadal dokularda dissect ve yağ dokusu tartmak.
    4. 4 °c ' de bir petri tabak içinde makas ve kesme adipoz dokusu kullanarak mekanik ayrışma gerçekleştirin. 50 mL konik Santrifüjlü tüplere yağ dokusu aktarın ve 1 mL 0,5% BSA/PBS ile Petri çanak durulayın.
    5. Yağ dokusu gram başına 3 mL adipoz doku Özet çözeltisi (adım 2,3 olarak hazırlanmış) ekleyin. Hafif sallama (200 rpm) altında 20 dakika için 37 °C ' de adipoz doku solüsyonu yapın.
    6. 5 mL% 0,5 BSA/PBS, gram yağ dokusu ve buz üzerine yer ekleyin. 10 mL serolojik pipet ile solüsyonu sayısız kez triturate ve bir pompa yardımıyla bir süzgeç (100 μm) üzerinden geçirin.
    7. 500 x g 'de 4 °c ' de 10 dakika Santrifüjü.
    8. Kayan adiposit kesir pipetleme ile çıkarın. Hücre peleti (stromal vasküler fraksiyonu) 1 mL ACK liziz tampon (bkz. malzeme tablosu) resuspend. 10 mL% 2 FCS PBS ekleyin.
    9. 500 x g 'de 4 °c ' de 10 dakika Santrifüjü.
    10. % 2 FCS PBS 250 μL içinde decant süpernatant ve pelletini hücre Pelet.
    11. Trypan mavi dışlama kullanarak bir hemasitometre üzerinde uygun hücrelerin sayısını saymak.
  2. Karaciğer dokusu sindirim
    1. PBS ve buz üzerinde taşıma ile dolu bir konik Santrifüjlü tüp karaciğer saklayın.
    2. 4 °c ' de bir petri tabak içinde şırınga pulları kullanarak mekanik ayrışma gerçekleştirin. 50 ml konik Santrifüjlü tüpte, 10 ml sıcak karaciğer sindirimi çözeltisi içeren disseke karaciğer dokusu koyun. 3 mL karaciğer sindirimi çözeltisi ile Petri tabağı durulayın.
    3. 37 °C ' de karaciğer dokusu çözeltisi hafif sallama (200 rpm) altında 20 dakika boyunca kulbe edilir.
    4. 20 mL HBSS ekleyin. 10 mL serolojik pipet ile solüsyonu sayısız kez triturate ve bir pompa yardımıyla bir süzgeç (100 μm) üzerinden geçirin.
    5. 500 x g 'de 4 °c ' de 10 dakika Santrifüjü. Süpernatant decant ve HBSS 20 ml hücre Pelet pelletini.
    6. Hepatosit matrisini kaldırmak için oda sıcaklığında 1 dakika 30 x g Santrifüjü. Hücre Pellet atın.
    7. 4 °c ' de 10 dakika için 500 x g 'de süpernatant Santrifüjü. 10 ml% 33 düşük viskozite yoğunluğu degrade orta çözelti içinde Pelet resuspend (bkz. malzeme tablosu) HBSS içinde santrifüjleme (800 x g; 30 dak; Oda sıcaklığı; fren yok).
    8. 1 ml ACK liziz tamponunun içinde Pelet 'i resuspend ve oda sıcaklığında 4 dakika boyunca inküye yapın. Sonra 10 mL HBSS ekleyin.
      Not: Süpernatant atmak için bir transfer pipet ile çok dikkatle interfaz (hepatositler) ile süpernatant Aspire (bağışıklık hücreleri ve eritrositler ile Pelet almadan mümkün olduğunca).
    9. 15 mL konik Santrifüjlü tüpte 30 μm süzgecten hücreler geçirin ve 500 x g 'de 4 °c ' de 10 dakika santrifüjün. % 2 FCS PBS 250 μL içinde decant süpernatant ve pelletini hücre Pelet.
    10. Trypan mavi dışlama kullanarak bir hemasitometre üzerinde uygun hücrelerin sayısını saymak.

4. yüzey boyama

  1. T-Cell-alt setleri (Panel 1) ve doğuştan gelen immün hücreler için antikor karışımı hazırlayın (panel 2) Tablo 1 ve Tablo 2' de açıklandığı gibi. Birimler, antikor konsantrasyonlarına ilişkin bir örnek (100 μL) için optimize edilmiştir.
    Not: Lenfositler ve doğuştan gelen immün hücreler otomatik yağların farklılıklarını sunar ve ayrı olarak analiz edilmelidir.
  2. Yüzey boyama için polistiren FACS tüpünde 100 μL 'de 3 x 106 hücreye kadar kullanın. FC reseptörlerini engellemek için 10 μL Anti-CD16/CD32 antikor (seyreltilmiş 1:100) ekleyin ve buzda 10 dakika boyunca inküye yapın. Negatif hücre popülasyonunun konumunu belirlemek için yan dağılım (SSC) ve ileri dağılım (FSC) ayarlamak üzere lekelenmiş negatif denetim örneği kullanın.
  3. Vortex ve panel 1 ve panel 2 için antikor karışımı uygun hacmi ekleyin. Canlı ve ölü hücre ayrımcılığı için izin vermek için her örneğe 1 μL canlılığı boya ekleyin. 4 °C ' de 20 dakika boyunca inküye yapın ve ışıkta korunur.
  4. 2 mL 2% FCS PBS ile iki kez yıkayın ve 4 °C ' de 5 dakika için 300 x g 'de santrifüjler.
  5. % 2 FCS PBS 300 μL 'de hücre peletini resuspend ve FACS analizine kadar 4 °C ' de saklayın.
    Not: Ölçüm geçiş hücrelerini, 30 μm hücre süzgeci ile polistiren FACS tüp ve Vortex içine başlamadan önce. 1-3 h için 4 °C ' de% 2 FCS PBS 'de saklanan etiketli hücreler ile akış sitometri yapılmıştır. hücreler en kısa sürede optimize edilmiş sonuçlar için analiz edilmelidir.

5. akış Cytometri telafisi, edinme ve gating

  1. FSC ve SSC ayarlamak için lekelenmiş negatif kontrol örneği çalıştırın ve lökosit nüfus tespit ve enkaz ve uygun hücreler arasında ayırt etmek için akış sitometresi voltajları ayarlayın. Enkaz ve ölü hücreleri dışlayın.
    Not: Karaciğerden hücre süspansiyonlarının canlılığı ek bir yoğunluk ayırma adım nedeniyle perigonadal adipoz dokudan hücre süspansiyonları gelen canlılığı daha düşük olabilir.
  2. Çoklu renk telafisi için tek lekeli kontrol örnekleri çalıştırın.
    Not: Anti-Body yakalama boncukları, bir hücre nüfusa sahip hücrelerin sayısı hücreleri kullanarak telafi etmek için çok düşük ise spektral örtüşme için ayarlamak için de kullanılabilir. Hücrelerin floresans eksi bir (FMO) kontrolleri her antikor için olası otomatik osilolojik sinyalleri algılamak için tavsiye edilir, ancak bu protokolde uygulanmadı.
  3. Ölçümü başlatın, uygun sayıda olayı toplayın (en az 50.000 olaylar) ve deneysel verileri kaydedin.
  4. FCS veri dosyalarını analiz için dışa aktarın ve gating stratejisini ayarlayın. Gate CD45+ lökosit üzerinde sonraki hücre nüfus tanımlamak için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Açıklanan protokol, diyet kaynaklı NASH modelinde murine perigonadal adipoz doku ve karaciğerden izole edilmiş, doğuştan ve adaptif immün hücrelerin yüzey işaretleyicilerinin karakterize edilmesini sağlar. Bu modelde, Nash HFD artı sakaroz (% 6) yönetimi ile indüklenmiş oldu İçme suyunda 7 ila 15 hafta C57Bl/6J fareler, daha önce bildirilen13. Önemlisi, fareler yarı steril koşullarda yer aldı ve böylece, deney boyunca çevresel antijenlere maruz. SPF koşullarında yer alan HFD beslenen fareler, SPF ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Steatohepatitin obezite, insülin direnci ve dislipidemi15gibi metabolik anomaliler ile güçlü bir ilişkisi vardır. Çoklu çalışmalar, yağ doku iltihabı tip 2 diyabet patogenezi sürücü olduğunu gösterir, hem doğuştan ve adaptif bağışıklık sistemi hücreleri değişen seviyeleri de dahil olmak üzere4,5,16,17 . Buna ek olarak, obezite karaciğer komplikasyonlarına yol açabilir ba...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Biz deneysel prosedürler ve gating stratejisi üzerinde yararlı yorumlar için Biolegend gelen Benjamin Tiburzy yardım için Anke hukuk, Diana Woellner, Dr Kathrin Witte ve Cornelia Heckmann teşekkür ederiz. JS, Helmholtz Grant (ıCEMED) tarafından destekleniyordu. Bu çalışmada, Almanya Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı ve Einstein Vakfı tarafından "BCRT-Grant" Berlin Sağlık Enstitüsü (BH) klinik araştırma birimi 'nden hibe tarafından destekleniyordu. KAHRAMAN-B. ve H.-D.V. tarafından finanse edilir FOR2165.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
100 ve mikro; M hücreli süzgeçler Falcon352340
1 mL şırınga BD   
26 G x 5/8 iğne BD 
35 mm Petri Kapları Falcon353001
40 ve mikro; M hücreli süzgeçler Falcon352340
ACK lizis tamponu GIBCOA1049201
Alexa Fluor 700 anti-fare CD45Biolegend 103127AB_493714 (BioLegend Kedi. 103127)
Analiz yazılımı FlowJo 10.0.8 yazılımı
APC anti-fare CD11c AntikorBiolegend 117309AB_313778 (BioLegend Cat. 117309)
APC anti-fare KLRG1 (MAFA) AntikorBiolegend 138411AB_10645509 (BioLegend Cat. 138411)
BV421 anti-fare CD127 AntikorBiolegend 135023AB_10897948 (BioLegend Cat. 135023)
BV421 anti-fare F4/80 AntikorBiyoefsanesi 123131AB_10901171 (BioLegend Cat. 123131)
BV605 anti-fare CD279 (PD-1) AntikorBiyoefsanesi 135219AB_11125371 (BioLegend Cat. 135219)
BV605 anti-fare NK-1.1 AntikorBiolegend 108739AB_2562273 (BioLegend Cat. 108739)
BV650 anti-fare/insan CD11b AntikoruBiolegend 101239AB_11125575 (BioLegend Cat. 101239)
BV711 anti-fare/insan B220 Antikoru Biolegend 103255AB_2563491 (BioLegend Cat. 103255)
BV785 anti-fare CD8a AntikorBiyoefsanesi 100749AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749)
C57Bl/6J fareler, erkek, 5 haftalık Forschungseinrichtungen fü r experimentelle Medizin (FEM)
CaCl2 Hayırsever ve eacute; - Universitä tsmedizin BerlinA119.1 
Kollajenaz NB 4G Kanıtlanmış Sınıf SERVA 
Kollajenaz Tipi I Worthington 
Konik santrifüj tüpü 15mL Falcon352096
Konik santrifüj tüpü 50 mL Falcon352070
DNAse   Sigma-Aldrich 
Fetal sığır serumu BiochromS0115
Filtre 30 ve mikro; m Celltrics 
FITC anti-fare CD3 AntikorBiolegend & nbsp;100203AB_312660 (BioLegend Cat. 100203)
Akım sitometrisi BD-LSR Fortessa 
Forseps Sigma-Aldrich F4142-1EA
HBSS Biyoanalitik GmBH 085021-0500 
Yüksek yağlı diyet SSNIFE15741– 34 Yağdan %60 kJ, 19  proteinlerden kJ% ve 21  karbonhidratlardan kJ%
mikro diseksiyon makası Sigma-Aldrich S3146 
PE anti-fare CD25 AntikorBiyoefsanesi 101903AB_312846 (BioLegend Cat. 101903)
PE / Cy7 anti-fare CD62L AntikorBiolegend & nbsp;104417AB_313102 (BioLegend Cat. 104417)
PE/Cy7 anti-fare I-A/I-E (MHCII) AntikorBiyoefsanesi 107629AB_2290801 (BioLegend Cat. 107629)
PE/Dazzle 594 anti-fare CD4 AntikorBiolegend 100565AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565)
Percoll çözeltisi BiochromL6115
PerCP / Cy5.5 anti-fare CD44 AntikorBiolegend & nbsp;103031AB_2076206 (BioLegend Cat. 103031)
PerCP / Cy5.5 anti-fare Gr-1 AntikorBiolegend 108427AB_893561 (BioLegend Cat. 108427)
Fosfat tamponlu tuzlu su Gibco12559069
Hücre süzgeç kapaklı Yuvarlak Tabanlı TüplerSTEMCELL Technologies 38030
TruStain fcX anti-fare CD16/32Biolegend 101301AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301)
Tripan Mavisi Sigma-Aldrich T6146
Zombi NIR Tamir Edilebilir Canlılık KitiBiolegend 423105viablity stain 
30965930511511427513LS0041974716728001400422316Diseksiyon amaçlı kullanılan

Kaynaklar

  1. Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis. BMC Public Health. 9, 88(2009).
  2. Prentki, M. Islet β cell failure in type. J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 (2006).
  3. Shoelson, S. E., Lee, J., Goldfine, A. B. Inflammation and insulin resistance. Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1793-1801 (2006).
  4. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, 840(2006).
  5. Exley, M. A., Hand, L., O'Shea, D., Lynch, L. Interplay between the immune system and adipose tissue in obesity. Journal of Endocrinology. 223 (2), R41-R48 (2014).
  6. Ferrante, A. W. Macrophages, fat, and the emergence of immunometabolism. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 4992-4993 (2013).
  7. Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610(2011).
  8. Onodera, T., et al. Adipose tissue macrophages induce PPARγ-high FOXP3(+) regulatory T cells. Scientific Reports. 5, (2015).
  9. Lackey, D. E., Olefsky, J. M. Regulation of metabolism by the innate immune system. Nature Reviews Endocrinology. 12, 15(2015).
  10. Calle, E. E., Kaaks, R. Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms. Nature Reviews Cancer. 4, 579(2004).
  11. Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame. Digestive Diseases and Sciences. 61 (5), 1325-1336 (2016).
  12. Beura, L. K., et al. Recapitulating adult human immune traits in laboratory mice by normalizing environment. Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).
  13. Sbierski-Kind, J., et al. Distinct Housing Conditions Reveal a Major Impact of Adaptive Immunity on the Course of Obesity-Induced Type 2 Diabetes. Frontiers in Immunology. 9 (1069), (2018).
  14. Japp, A. S., et al. Wild immunology assessed by multidimensional mass cytometry. Cytometry Part A. 91 (1), 85-95 (2017).
  15. Benedict, M., Zhang, X. Non-alcoholic fatty liver disease: An expanded review. World Journal of Hepatology. 9 (16), 715-732 (2017).
  16. McNelis, J. C., Olefsky, J. M. Macrophages, Immunity, and Metabolic Disease. Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).
  17. Ferrante, A. W. The Immune Cells in Adipose Tissue. Diabetes, Obesity & Metabolism. 15, 34-38 (2013).
  18. Bertola, A., et al. Hepatic expression patterns of inflammatory and immune response genes associated with obesity and NASH in morbidly obese patients. PloS One. 5 (10), e13577(2010).
  19. Turnbaugh, P. J., Bäckhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. Diet-Induced Obesity Is Linked to Marked but Reversible Alterations in the Mouse Distal Gut Microbiome. Cell Host & Microbe. 3 (4), 213-223 (2008).
  20. Singh, R. K., et al. Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 73(2017).
  21. Müller, V. M., et al. Gut barrier impairment by high-fat diet in mice depends on housing conditions. Molecular Nutrition & Food Research. 60 (4), 897-908 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Yüksek Yağlı Diyet FareleriSPF-Dışı KoşullarStromal Vasküler FraksiyonAkış Sitometrisi AnaliziDoku Sindirim Protokolüİmmün Hücre İzolasyonuKaraciğer Adipoz DokusuGating Stratejisi
Tip 2 diyabet ile Ilişkisi olmayan alkollü steatohepatit için gelişmiş bir Murine modeli
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.