Yöntem makalesi

Fare Buzağılarına Tutarlı Masaj Benzeri Pertürbasyonların Uygulanması ve Bunun Sonucu Kas içi Basınç Değişikliklerinin İzlenmesi

DOI:

10.3791/59475

⸱

20 Eylül 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Rehabilitation for Motor Functions, National Rehabilitation Center for Persons with Disabilities, 2Graduate School of Sport Sciences, Waseda University, 3Faculty of Sport Sciences, Waseda University, 4Department of Orthopaedic Surgery, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 5Frontier Research Institute for Interdisciplinary Sciences, Tohoku University, 6University of Cincinnati College of Medicine, 7Department of Assistive Technology, National Rehabilitation Center for Persons with Disabilities, 8Department of Clinical Research, National Rehabilitation Center for Persons with Disabilities

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada fare buzağılarına tanımlanmış mekanik yüklerin uygulanması ve eşlik eden kas içi basınç değişikliklerinin izlenmesi için protokolleri açıklıyoruz. Geliştirdiğimiz deneysel sistemler, fiziksel egzersiz ve masajın yararlı etkilerinin arkasındaki mekanizmayı araştırmak için yararlı olabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Masaj genellikle ağrı ve iltihabı giderici için yararlı olduğu kabul edilmektedir. Önceki çalışmalarda iskelet kasları üzerinde masaj anti-inflamatuar etkileri rapor olmasına rağmen, arkasındaki moleküler mekanizmalar kötü anlaşılmaktadır. Biz son zamanlarda yerel döngüsel sıkıştırma uygulamak için basit bir cihaz geliştirdik (LCC), değişen genlikleri ile kas içi basınç dalgaları üretebilir. Bu cihazı kullanarak, LCC'nin makrofajların inflamatuar yanıtlarını yerinde modüle ettiğini ve immobilizasyona bağlı kas atrofisini hafifletdiğini gösterdik. Burada, lcc optimizasyonu ve uygulanması için protokolleri immobilizasyona bağlı inflamasyona ve fare arka larının iskelet kaslarının atrofisine karşı masaj benzeri bir müdahale olarak tanımlıyoruz. Geliştirdiğimiz protokol, fiziksel egzersiz ve masajın yararlı etkilerinin altında yatan mekanizmayı araştırmak için yararlı olabilir. Deneysel sistemimiz kas homeostazının mekanik regülasyonunun aydınlatılması için analitik yaklaşımın bir prototipini sağlar, ancak daha kapsamlı çalışmalar için daha fazla geliştirme yapılması gerekmektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Masaj genellikle hem ağrı kesici ve rekabetçi sporcular ve olmayan sporcular arasında fiziksel performansın iyileştirilmesi için yararlı olduğu kabul edilmektedir1,2. Aslında, önceki çalışmalarda masaj yerel inflamasyon bastırır göstermiştir3 ve egzersiz sonrası kas hasarı kurtarma ister4,5. Masajın yararlı etkilerinin altında yatan moleküler mekanizmalar büyük ölçüde bilinmemektedir.

Masaj üzerine mekanistik araştırma ile zorluklardan biri hangi masaj gibi müdahaleler test edilir deneysel tekniklerin tekrarlanabilirlik ile ilgilidir. Önceki çalışmalarda, masaj taklit deneysel prosedürler çoğunlukla avuç içi ve parmak lar 6 gibi uygulayıcıların vücut parçaları kullanarak fiziksel müdahalelerin uygulanması içerir6,7,8. Bu, büyüklüklerini, sıklıklarını, sürelerini ve modlarını tam olarak yeniden oluşturmayı zorlaştırır.

Birçok cihaz hedef dokulara tanımlanmış mekanik yükler uygulamak için geliştirilmiştir. Örneğin, Zeng ve diğerleri farelerin arka bacaklar9 ve Wang ve ark için uzunluk bilge mekanik yükleme için bir pnömatik sistem geliştirdik sıçan ve tavşan arka bacaklar için masaj gibi mekanik yükler uygulayabilirsiniz bir mekatronik cihaz geliştirdik gerçek zamanlı geri bildirim kontrolü10. Onlarla karşılaştırıldığında, bizim yerel döngüsel sıkıştırma (LCC) sistemi inşaat için çok daha az maliyet talep, çok daha basittir. Yine de, biz hafif kas kasılması sırasında oluşturulan intramüsküler basınç değişiklikleri çoğaltabilir. Bu cihazı kullanarak, başarıyla masaj benzeri mekanik müdahaleler lokal interstisyel akışkanlar dinamikleri modüle ve immobilizasyon kaynaklı kas atrofisi hafifletmek göstermiştir11.

Burada, egzersiz ve masajların olumlu etkilerinin ardındaki moleküler mekanizmaları keşfetmeye yardımcı olabilecek cihazımızın ayrıntılarını ve protokolü anlatıyoruz. Protokolün şemaları Ek Şekil 1olarak sunulmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan deneyleri, Ulusal Engelliler Rehabilitasyon Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin onayı ile gerçekleştirilmiştir.

1. Farenin iki taraflı arka ayaklarının immobilizasyonu

NOT: Erkek C57BL/6 fareler en az 7 gün uyum sonra 11 - 12 hafta yaşında deneyler için kullanılmıştır.

  1. Sodyum pentobarbital (50 mg/kg i.p.) kullanarak fareyi yeterince anestezi edin. Farelerin arka bacak lı bir sıkışmaya yanıt vermediğinden emin olun.
    NOT: Farelerin beslenme aktivitesi üzerindeki olası etkilerini en aza indirmek için 10:00 ile 19:00 saatleri arasında immobilizasyon işlemini gerçekleştirin.
  2. Diz eklemleri uzatılmış ve ayak bileği eklemleri plantar-fleksile bir supine pozisyonda koydu farenin çift arka bacaklar için cerrahi bantlar uygulayın.
  3. L4-5 omurga seviyesinde gövdeye alüminyum bir tel yerleştirin (Bkz. Malzeme Tablosu)ve spiral tabakanın her bir dönüşü arasında 5 mm boşluk olan arka bacaklar etrafında spiral konfigürasyonda teli bobinleyin(Şekil 1A). Teli çok sıkı bir şekilde sarmamaya ve yerel kan akışını bozmamaya özenmeyin.
  4. Kablolamadan kaçış olasılığını en aza indirmek için, alüminyum telin konfigürasyonunu manuel olarak ayarlayarak kalça eklemlerini 90° kaçırma pozisyonunda hareketsiz hale getirin.
  5. Fareleri orijinal kafeslerine geri getirin. 3 saat sonra, onlar anestezi ve her zamanki gibi gıda ve suya erişim kurtarmak emin olun.
  6. House 3 - 6 immobilizasyon öncesi gibi kafes başına fareler hareketsiz.

2. Fare gastroknemius kaslarının kas içi basıncının ölçülmesi

NOT: LCC ile birlikte yapılan basınç izleme deneylerinde silindirik ünitelerin (36 g, 66 g ve 200 g) birkaç farklı ağırlıkları test edilmiştir. Bu ölçüm kas iltihabı ve atrofi analiz etmek için deneylerden ayrı olarak yapılmıştır (daha fazla ayrıntı için 3 - 5. adıma bakınız) yani basınç ölçümü yapılan fareler histolojik analizlerde kullanılmadı.

  1. Basınç ölçümü, arka ekstremite kablolama ve LCC ile karşılaştırıldığında daha invaziv prosedürler (örn. cilt kesive iğne ekleme) içerdiğinden, üç anestezik ajanın karışımını (medetomidin 0.75 mg/kg, midazolam 4.0 mg/kg ve butorphanol 5.0 mg/kg, i.p.). Farelerin arka bacak takimı sıkışmasına yanıt vermediğinden emin olun.
  2. Fareyi yatkın bir pozisyonda yerleştirin, elektrikli bir tıraş edici ile depilating ve yarı sterilize cilt yüzeyini% 70 etanol ve Klorheksidin-ıslatılmış emici pamuk ile sonra arka buzağı üzerinde bir neşter ile 2-mm kesi yapmak.
  3. Cilt yüzeyine kalın bir açıyla (150° – 170°) gastroknemius kaslarına 20 G'lik bir iğne yerleştirin.
  4. Bir kılavuz olarak iğne plastik kılıf kullanarak, gastroknemius kas orta karın kan basıncı telemetre (Malzeme Tablosubakınız) bir sensör yerleştirin ve sonra kas kılıfı çıkarın.
  5. 4-0 naylon sütür ile cildi diktikten sonra, farelerdeki buzağıya silindirik ünitelerin birkaç farklı ağırlıkta LCC uygulayın (daha fazla ayrıntı için 3. adıma bakın) ve biyolojik sinyal analizi için yazılım kullanarak kas içi basıncı izleyin (Bkz. Tablo Malzemeler).
  6. Fareleri orijinal kafeslerine geri getirin. 3 saat sonra, onlar anestezi / analjezi kurtarmak ve her zamanki gibi gıda ve suya erişimi olduğundan emin olun.

3. Fare buzağılarında lokal döngüsel sıkıştırma (LCC)

  1. İntramüsküler basınç ölçümü ve ötenazi (yani servikal çıkış) dışında anestezi için sodyum pentobarbital (50 mg/kg i.p.) kullanın.
  2. Fareyi arka ekstremite kablolarından uzaklaştırın ve diz eklemleri uzatılmış ve ayak bileği eklemleri dikilmiş, böylece buzağılar yukarı doğru karşı karşıya kalın. Sahnede fare arka bacaklar sabitlemeyin.
  3. Silindirik ağırlık ünitesini(Şekil 1B)yastık pedi(Şekil 1C)ile kaplanmış, günde 30 dk,7 gün boyunca 1 Hz'de dikey olarak hareket ettirerek buzağıya LCC uygulayın.
  4. Günlük LCC her nöbetsonra, fare arka bacaklar yeniden tel.

4. Gastroknemiusun immünohistokimyasal analizi

  1. Üç anestezik ajanın (medetomidin 0.75 mg/kg, midazolam 4.0 mg/kg ve butorphanol 5.0 mg/kg) karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile yeterli anestezi/analjezi altında servikal çıkış ile fareyi ötenazi edin.
  2. Posterior baldır yüzeyini depilating sonra, bir deri kesi yapmak, ve cerrahi bir makas kullanarak tibio-fibular kemik ayırarak gastrocnemius kasları incelemek ve hızlı bir şekilde optimal kesme sıcaklığı bileşik çözeltisi onları dondurmak.
  3. Bir kriyostat kullanarak, cam slaytlar üzerinde gastroknemius kaslarıkro-kesit örnekleri hazırlamak. Numuneleri analiz edilene kadar -80 °C'lik bir dondurucuda saklayın.
  4. Dondurucudan analiz edilecek gastroknemius kriyo-kesit örneklerini alın ve oda sıcaklığında hava kurutularak kurutun.
  5. Slayttaki tüm kriyo bölümlerini içeren bir alan çizmek için sıvı engelleyici kalem kullanın. Daire, çözümlerin slayttan akmasını önler.
  6. Slaytları suyla ıslatılmış kağıt bezle nemli bir ortamın yaratıldığı bir tepsiye yerleştirerek numunelerin kurumasını önleyin.
  7. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca %0,25 kazein, taşıyıcı protein ve 0,015 M sodyum azit içeren 100 μL bloke tamponu (fosfat tamponlu salin (PBS) uygulayın.
  8. 5 dakika boyunca PBS-T (PBS %0,1 polioksietilen sorbitan monolaurate içeren PBS) ile kuluçkaya yatarak slaytları iki kez durular.
  9. Her numuneye PBS ile seyreltilmiş 100 μL primer antikor uygulayın, tepsiyi bir kapakla kapatın ve oda sıcaklığında gece boyunca kuluçkaya yatırın.
  10. PBS-T ile 3 kez yıkayın (her yıkama için 5 dk).
  11. Her numuneye PBS ile seyreltilmiş 100 μL ikincil antikor uygulayın ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın.
    NOT: Anti-laminin boyama için Alexa Fluor 568 konjuge ikincil antikor kullanın. Anti-F4/80, anti-MCP-1 ve anti-TNF-α için Alexa Fluor 568 veya 488 konjuge ikincil antikor kullanın.
  12. PBS-T ile 3 kez yıkayın (her yıkama için 5 dk).
  13. Her numuneye PBS-T ile seyreltilmiş 100 μL DAPI çözeltisi uygulayın ve oda sıcaklığında 3 dakika kuluçkaya yatırın.
  14. PBS-T ile 3 kez yıkayın (her biri için 5 dk).
  15. Numuneleri montaj ortamına yerleştirin ve üzerini kapaklı dudaklarla kapatın.

5. Gastroknemius histo-morfometrik analizi

  1. Örnek slaytları bir floresan mikroskobuna yerleştirin (Bkz. Malzeme Tablosu)ve numuneleri uygun filtrelerle (DAPI-B, uyarma için 360/40 nm ve emisyon için 460/50 nm) 20× bir hedef kullanarak görüntüleyin; GFP-B, 470/40 nm uyarma ve emisyon için 535/50 nm; FRITC, uyarma için 540/25 nm ve emisyon için 605/55 nm.
  2. Görüntü analizi için yazılımı kullanarak (Bkz. Malzemeler Tablosu),her miyofiberin kesit alanını (CSA) ölçün ve F4/80-, MCP-1-ve TNF-α-pozitif hücrelerin sayısını sayın.
    NOT: Anti-laminin-2 immünboyama ile görselleştirilen bodrum zarının iç kenarlığını izleyerek her miyofonun CSA'sını belirleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Önceki gözlemlerimizle tutarlı12,gastroknemius miyofiberlerinin CSA'sı arka ekstremite immobilizasyonu ile önemli ölçüde azalmıştır(Şekil 2A,B). Ayrıca, immünofloresan boyama analizimiz, mcp-1 ve TNF-α'yı ifade eden hücrelerin, her ikisi de inflamatuar süreçlerin düzenlenmesinde kilit rol oynadığını ortaya çıkardı13,14, gastroknemius kaslarında önemli ölçüde arttı immobilize arka bacak dokular...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz anti-inflamatuar etkileri olan bir masaj benzeri mekanik uyarıcı uygulamak için bir yöntem tarif ettik. Sistemimiz, daha önce bildirilenlerle karşılaştırıldığında bile aşağıdaki avantajlara sahiptir. İlk olarak, önceki çalışmalarda nicel uygulanan mekanik kuvvetler tanımlamak vermedi2 veya vücut yüzeyinde ölçümdayalı büyüklükleri tanımlanan, ancak dokular içinde10. Buna karşılık, bir kan basıncı telemetre kullanarak kas içi basıncı ölçtü. İkinci olarak, cihazımızın basi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, el yazması ile ilgili hiçbir rakip çıkarları olduğunu beyan.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

K. Nakanishi, K. Hamamoto, N. Kume ve K. Tsurumi'ye proje boyunca verdikleri sürekli destekten dolayı teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Japonya Sağlık, Çalışma ve Refah Bakanlığı'ndan Intramural Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir; Japonya Bilimin Teşviki Derneği'nden Bilimsel Araştırma Için Hibeler; Özel Üniversitelerde Stratejik Araştırma Vakfı MEXT Destekli Programı, 2015-2019 Japonya Eğitim, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı'ndan (S1511017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Alüminyum telDAISO JAPANB028Telin kaçma kısıtlamasını önlemek için bir alüminyum tel kullanılır
Kan basıncı telemetresiMillarSPR-671Kas içi basıncı ölçmek için bir kan basıncı telemetresi kullanılır.
DAPIThermo Fisher ScientificD1306DAPI, floresan mikroskobu için DNA'yı boyamak için yaygın olarak kullanılan bir floresan probdur.
Keçi anti-tavşan Alexa Fluor 488 (Seyreltme oranı, 1:500)İmmünohistokimyasal boyama içinInvitrogen A11034
Keçi anti-sıçan Alexa Fluor 568 (Seyreltme oranı, 1:500))İmmünohistokimyasal boyama içininvitrojen A11077
ImageJNIHN/AGörüntü için analiz yazılımı
LabChart8Cihazları Biyolojik sinyalleri elde etmek için analiz yazılımı.
Prolong goldThermo Fisher ScientificP36930Prolong gold, lekeli numuneleri monte etmek içindir.
Protein Blok SerumsuzDakoX090930-2İmmünohistokimyasal prosedürlerde spesifik olmayan arka plan lekelenmesini engellemek için.
Sıçan monoklonal anti-laminin-2 antikoru (Seyreltme oranı, 1:1000)İmmünohistokimyasal boyama içinSigma AldrichL0663
Sıçan monoklonal anti-F4/80 antikoru (Seyreltme oranı, 1:500)Abcamab6640İmmünohistokimyasal boyama için antikor.
Tavşan poliklonal anti-MCP-1 antikoru (Seyreltme oranı, 1:1000)Abcamab25124İmmünohistokimyasal boyama için antikor.
Tavşan poliklonal anti-TNF-&alfa; antikor (Seyreltme oranı, 1:1000)Abcamab66579İmmünohistokimyasal boyama için antikor.
Cerrahi bant3M Japan1530EP-0Eklem hareketini kısıtlamak için cerrahi bant kullanılır.
Antikoru. Antikoru. Antikoru.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Furlan, A. D., Imamura, M., Dryden, T., Irvin, E. Massage for low back pain: an updated systematic review within the framework of the Cochrane Back Review Group. Spine. 34 (16), 1669-1684 (2009).
  2. Robertson, A., Watt, J. M., Galloway, S. D. R. Effects of leg massage on recovery from high intensity cycling exercise. British Journal of Sports Medicine. 38 (2), 173-176 (2004).
  3. Waters-Banker, C., Butterfield, T. A., Dupont-Versteegden, E. E. Immunomodulatory effects of massage on nonperturbed skeletal muscle in rats. Journal of Applied Physiology. 116 (2), 164-175 (2014).
  4. Haas, C., et al. Massage timing affects postexercise muscle recovery and inflammation in a rabbit model. Medicine & Science in Sports & Exercise. 45 (6), 1105-1112 (2013).
  5. Crane, J. D., et al. Massage therapy attenuates inflammatory signaling after exercise-induced muscle damage. Science Translational Medicine. 4 (119), 119ra113(2012).
  6. Bove, G. M., Harris, M. Y., Zhao, H., Barbe, M. F. Manual therapy as an effective treatment for fibrosis in a rat model of upper extremity overuse injury. Journal of the Neurological Sciences. 361, 168-180 (2016).
  7. Andrzejewski, W., et al. Increased skeletal muscle expression of VEGF induced by massage and exercise. Folia Histochemica et Cytobiologica. 53 (2), 145-151 (2015).
  8. Mantovani Junior, N., et al. Effects of massage as a recuperative technique on autonomic modulation of heart rate and cardiorespiratory parameters: a study protocol for a randomized clinical trial. Trials. 19 (1), 459(2018).
  9. Zeng, H., Butterfield, S., Agarwal, F., Haq, T., Zhao, Y. An engineering approach for quantitative analysis of the lengthwise strokes in massage therapies. Journal of Medical Devices. 2 (4), (2008).
  10. Wang, Q., et al. A mechatronic system for quantitative application and assessment of massage-like actions in small animals. Annals of Biomedical Engineering. 42 (1), 36-49 (2014).
  11. Saitou, K., et al. Local cyclical compression modulates macrophage function in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Clinical Science. 132 (19), 2147-2161 (2018).
  12. Onda, A., et al. A New mouse model of skeletal muscle atrophy using spiral wire immobilization. Muscle Nerve. 54 (4), 788-791 (2016).
  13. Luster, A. D. Chemokines--chemotactic cytokines that mediate inflammation. The New England Journal of Medicine. 338, 436-445 (1998).
  14. Reid, M. B., Li, Y. P. Tumor necrosis factor-α and muscle wasting: a cellular perspective. Respiratory Research. 2 (5), 269-272 (2001).
  15. Baumann, J. U., Sutherland, M. D., Hangg, A. Intramuscular pressure during walking: An experimental study using the wick catheter technique. Clinical Orthopaedics Related Research. 145, 292-299 (1979).
  16. Lee, I., et al. Effect of physical inactivity on major non-communicable diseases worldwide: an analysis of burden of disease and life expectancy. Lancet. 380, 219-229 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Local Cyclical CompressionIntramuscular Pressure MonitoringMouse Hindlimb ImmobilizationGastrocnemius Muscle AnalysisHistomorphometric AnalysisImmunofluorescent StainingMacrophage AccumulationMuscle AttenuationMechanical RegulationBiological Signal Analysis

İlgili makaleler