Kültürde memeliler hücrelerinde Disulfide bağlantıları ile stabilize Multimeric kompleksleri algılamak için non-azaltma SDS-sayfa analizi ve kimyasal Crosslinking birleştiren

Özet

Disulfide bağlantıları uzun birçok proteinlerin yapısını stabilize olduğu bilinmektedir. Bu bağlantıyla stabilize edilmiş multimerik kompleksleri analiz etmek için basit bir yöntem, SDS-PAGE analizinin azaltılması yoluyla yapılır. Burada, bu yöntem, insan kemiği osteosarkomu hücre hattı U-2 OS dutpase nükleer izoformu analiz ederek gösterilmektedir.

Özet

Birçok proteinlerin yapıları, kovalent disülfür bağlantıyla stabilize edilir. Son zamanlarda bu bağ da bir post-translational modifikasyon olarak sınıflandırılmıştır. Böylece, bu değişiklik yaşam hücrelerinde çalışma muktedir önemlidir. Bu sistein-stabilize multimerik kompleksleri analiz etmek için basit bir yöntem olmayan SDS-sayfa analizi ve formaldehit çapraz bağlama iki adımlı bir yöntem aracılığıyla. Bu iki adımlı Yöntem, teknik kolaylığı ve düşük kullanım maliyeti nedeniyle disülfit bağlantıyla stabilize edilmiş multimerik kompleksleri açığa çıkarmak için ilk adım olarak avantajlıdır. Burada, insan kemiği osteosarkomu hücre hattı U-2 OS özellikle dutpase nükleer izoformu analiz ederek bu yöntemi göstermek için kullanılır.

Giriş

Disulfide bağlantıları uzun birçok proteinlerin yapısını stabilize olduğu bilinmektedir. Son çalışmalar, bu Bond da geri dönüşümlü bir post-translational modifikasyon olarak sınıflandırılmıştır, bir sistein tabanlı olarak hareket "redox anahtarı" protein fonksiyonu modülasyonu için izin, konum ve etkileşim^{1,2, 3,4}. Böylece, bu değişiklik çalışabilmesi önemlidir. Bu sistein-stabilize multimerik kompleksleri analiz etmek için basit bir yöntem olmayan azaltarak SDS-sayfa analizi⁵. SDS-page analizi, sonuçların hızlı, kolay ve minimal maliyetlerle elde edileceği ve yorumlandığı birçok laboratuvarlarda kullanılan bir tekniktir ve Mass spektrometri 6 gibi disülfit bağlantıları tanımlamak için kullanılan diğer teknikler üzerinde avantajlıdır. ^,7 ve dairesel dikroizm⁸.

Bu yöntem bir çalışmada yardımcı olmak için uygun bir tekniği olup olmadığını belirlemede önemli bir adım iyice sistein kalıntı (ler) mevcut olması için faiz protein birincil sırasını incelemek için. Başka bir yararlı adım yayınlanan herhangi bir önceki kristal yapıları araştırma veya sistein kalıntı (ler) bulunabilir görselleştirmek için ilgi proteininin üç boyutlu yapısını keşfetmek için bir Biyoinformatik uygulama kullanın etmektir. Kalıntı (lar) dış yüzeyde varsa, yapının içinde gömülü bir sistein kalıntı yerine disülfür bağlantı oluşturmak için daha iyi bir aday olabilir. Ancak, proteinlerin substrat etkileşimleri veya protein-protein etkileşimleri üzerine yapısal değişiklikler geçirebilir ve bu kalıntıları daha sonra da çevreye maruz kalmalarına izin vermek önemlidir.

Tanımlanan multimerik kompleksleri daha sonra formaldehit kullanarak kimyasal çapraz bağlama ile doğrulanabilir. Formaldehit, yüksek hücreli geçirgenliği ve ~ 2-3 Å kısa çapraz bağlama aralığı nedeniyle bu doğrulama tekniği için ideal bir çapraz bağlayıcı, spesifik protein-protein etkileşimlerini tespiti sağlamak^9,10. Burada, bu yöntem, insan kemiği osteosarkomu hücre hattı U-2 OS¹¹dutpase nükleer izoformu analiz ederek gösterilmiştir. Ancak, bu protokol diğer hücre hatları, dokular ve organizmalar için adapte edilebilir.

Protokol

1. ıodoacetamid kullanarak serbest sistein kalıntılarının engellenmesini

1. U-2 OS hücrelerini 6 cm² ' ye% 50 –% 60 ' lık yüksek glikoz içeren asgari esansiyel ortamda% 10 fetal sığır serumu ve 37 °c ' de% 1 Sodyum piruvat% 5 Co₂' de büyütün.
2. Kullanmadan önce 10 mM iodoacetamid taze bir stok yapmak, daha sonra kullanılmayan reaktif atın.
3. 0,1 mM son konsantrasyon iodoacetamid doğrudan hücre kültürü medya ekleyin. Hafifçe 2 dakika için oda sıcaklığında çanak kaya.

2. hücreleri hasat

1. Medyayı hücrelerden aspirate.
2. Hücreleri üç kez 5 mL soğuk fosfat-tamponlu tuz (PBS) ile yıkayın. Son PBS yıkama solüsyonu aspirate sonra 1 mL soğuk PBS ekleyin.
3. Bir hücre sıyırıcı kullanarak çanak altındaki hücreleri scrape. 1 mL 'Lik bir pipet kullanarak PBS ve hücre süspansiyonunu çizin ve tüm sıvıyı 1,5 mL mikrosantrifüjü tüpüne dağıtın.
4. 4 °C ' de üç dakika için 7.500 x g 'de hücreleri döndürün. PBS aspirate, hücre Pelet arkasında bırakarak. Hücre Pelet olarak depolanabilir-80 °c işleme kadar

3. proteinin çıkarılması

1. Hazırlamak 100 μL ddH₂O seyreltilmiş 1x liziz tampon (bkz. malzeme tablosu). 1 mM final konsantrasyonuna kullanmadan hemen önce phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF) ekleyin.
2. Ekleme 50 μL 1x liziz tampon doğrudan hücre peleti ve askıya alın. Bunu 5 dakika boyunca buzda kulbe.
3. % 40 ' de sabit darbe modunu kullanarak 8 s için sonikat (sonicator için malzeme tablosuna bakın; farklı sonicators için gerektiği şekilde ayarlayın), özü buzun üzerinde tutarak.
4. 16.000 x g'de 5 dakika için özü 4 °c ' de döndürün. Süpernatant çözünür protein fraksiyonu olduğunu. Eğer istenirse, protein konsantrasyonu belirlemek için Bradford Analizi yapılabilir.

4. numune hazırlama

1. 10 μL çözünür protein ekstresi alın ve 10 μL 1x Laemmli SDS-numune tampon ekleyin (% 4 SDS,% 20 gliserol, 0,004% bromophenol mavi ve 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8). Herhangi bir azaltma reaktifleri eklemeyin.
2. SDS PAGE Analizi o gün gerçekleştirilecektir Eğer örnekleri buzda tutun; uzun süreli depolama için-20 °C uygundur. Jeli çalıştırmadan hemen önce, numuneyi 85 °C ' de 5 dakika ısıtın.

5. In vivo formaldehit çapraz-U-2 OS hücrelerinde endojen proteinlerin bağlama

1. U-2 OS hücrelerini bir 175 cm² Flask 'e% 70 –% 80 ' e kadar büyütün (bkz. Bölüm 1).
2. Formaldehit çapraz reaksiyonu gerçekleştirin
   1. Bir duman kaputu, bir 37% formaldehit çözüm ticari kaynaklardan satın kısım. Formaldehit fiktasyonunu doğrudan orta% 1 ' lik bir son konsantrasyona ekleyin ve 15 dakika boyunca yumuşak ajitasyon ile Oda sıcaklığında inküye yapın.
   2. Reaksiyonu gidermek için, 0,125 m son konsantrasyonuna 1,25 m glisin ekleyin ve 5 dakika boyunca bir rocker üzerinde nazik ajitasyon ile Oda sıcaklığında inküye.
3. Hücreleri üç kez 5 mL soğuk PBS ile yıkayın. Son PBS yıkama çözümünü aspirate ve 10 mL PBS ekleyin. Bir hücre kazıyıcı kullanarak Flask altındaki hücreleri scrape.
4. 10 mL 'Lik bir pipet kullanarak, PBS ve hücre süspansiyonunu çizin ve tüm sıvıyı 15 mL konik Santrifüjlü tüpüne dağıtın. 500 x g 'de hücreleri 4 °c ' de 2 dakika boyunca döndürün. PBS aspirate, hücre Pelet arkasında bırakarak.

6. çekirdeklerin fraksiyonlama

1. 10 mL homojenizasyon tamponu hazırlayın: 0,25 M sakaroz, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES ve pH 7,4 ' de% 0,5 BSA. 1 mM son konsantrasyon ve 3mL çekirdekleri süspansiyon tamponu (0,1% Triton X-100 PBS) için kullanmadan hemen önce PMSF ekleyin.
2. Doğrudan hücre Pelet 5 ml homojenizasyon tampon ekleyin ve tamamen askıya. 4 °C ' de 2 dakika için 500 x g 'de süspansiyon Santrifüjü sonra supernatant atın.
3. 5 ml homojenizasyon tamponunun içinde Pelet askıya alın. Sıkı sığdırıcı cam Teflon Homogenizer kullanın, 10 Strokes/500 rpm 'de hücreleri homojenize Dons.
4. Süspansiyonu 4 °C ' de 10 dakika 1.500 x g 'de Santrifüjden çıkarın, ardından süpernatant 'ı atın.
   Not: 10 dakika 10.000 x g santrifügleme ile mitokondri yalıtım için süpernatant kullanın.
5. 1 ml çekirdeğin süspansiyon tamponunun içinde Pelet askıya alın ve 10 dakika boyunca buzun üzerinde inkübe.
6. 600 x g 'de Santrifüjü 10 dakika boyunca çıkarın.
7. 1 mL çekirdekleri süspansiyon tamponunun içinde Pelet askıya ve tekrar Santrifüjü. Süpernatant atın. Son Pelet izole çekirdekler olacak.

7. proteinin çıkarılması

1. Bölüm 4 ' ü yineleyerek, doğrudan hücre peleti için 25 μL 1x liziz tamponu eklendikten sonra askıya alınması dışında.

8. numune hazırlama

1. Çözünür protein özü her biri 10 μL alarak SDS-sayfa için iki numune hazırlamak ve 10 μL 2x Laemmli SDS-numune tampon ve 1 μL 2-mercaptoethanol (BME) ekleyin.
2. 37 °C ' de 5 dk ve 98 °C ' de 15 dakika için ikinci numune ile formaldehit çapraz bağlantısını tersine çevirmek için bir numune ısı.

9. SDS-sayfa Analizi

1. 1 L 1x Tris-Glycine çalışan tampon (25 mM Tris, 192 mM Glycine, 0,1% (w/v) SDS) hazırlayın.
2. SDS-PAGE çalışan aparatı ayarlayın.
   Not: bu protokol% 16 prekast TGX sds-page kullanır. Not, herhangi bir yüzde jel kullanılabilir.
   1. Üretici protokolüne göre, jelin depolandığı paketi açın ve kaseti çıkarın.
   2. Kuyuları ve kaseti kasetin alt kısmından kaplayan tarağı çıkarın.
   3. Jeli çalışan aparatın içine yerleştirin.
   4. Kuyular sıvıya batıncaya kadar, odası 1x çalışan tampon ile doldurun. Plastik bir pipet kullanarak, kuyuları çalışan tampon ile durulayın.
3. 10 μL önceden eklenmiş standart işaretleyiciyle birlikte jel üzerindeki örnekleri yükleyin.
4. Jel altında yaklaşık 1 cm boya ön kadar 200 V jeli çalıştırın.

10. Batı Blot

1. 1 L 1x transfer tamponu hazırlayın (25 mM Tris, 192 mM gcine,% 20 metanol) ve kullanım kadar 4 °C ' de saklayın.
2. Jeli dikkatle çıkarın ve kaseti açın. Bir Razor kullanarak, dikkatle kesme ve istifleme jel atın. Bir köşe kullanarak jel alın ve transfer tampon ile bir tepsi içine yerleştirin, yavaşça 5 dakika boyunca kaya izin.
3. Jel sallanan iken, Transfer tankı içine bir buz bloğu (-20 °C saklanır) yerleştirin ve 3/4 tam transfer tampon ekleyin.
4. Poliviniliden fluorid (PVDF) membranı, 30 s için% 100 metanol içinde ıslatarak ıslansın.
5. 5 dakika geçtikten sonra, Transfer tampon ile bir tepsi içinde transfer kurmak için hazırlayın. Transfer arabelleği, Blot tamamen alt etmek için yeterli olmalıdır. Leke transferini aşağıdaki şekilde ayarlayın: altta, kaset tutucunun alt kısmı (siyah); sonra kalın bir sünger, ekstra kalın Blot kağıt, poliakrilamid jel, PVDF membran, ekstra kalın Blot kağıt, ve kalın bir sünger; sonra sonunda kaset tutucu (beyaz) üst üst.
6. Kaseti kilitle ve ünitesi, PVDF membranı ile pozitif anot ve jelin negatif yönüne doğru transfer tankına yerleştirin. Transferiniz tamamen batana kadar transfer tamponunun bulunduğu ünitenin üstü.
7. Üniteyi karıştırma plakasının üstüne yerleştirin. Birime bir karıştırın çubuk ekleyin ve 125 RPM 'de karıştırma başlar.
8. 60 dk için 100 V 'de çalıştırın.
9. Transfer çalışırken, ara-20, pH 7,5 (TBST) ile Tris-tamponlu salin içinde çözünmüş% 5 toz süt çözeltisi hazırlayın.
10. Üniteyi sökün ve zarı çıkarın, hangi tarafın jel ile temas ettiğini belirterek; Bu tarafın kalan adımlar için tepsiye kadar kalmasını sağlayın.
11. Membranı 2 dakika boyunca Tris-tamponlu tuz (TBS) olarak ıslatarak, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 5 mL 5% süt-TBST çözeltisi içinde inküklenerek membran engelleyerek takip edilir.
12. Sütünü taze 4 mL% 5 süt-TBST solüsyonu ile değiştirin ve birincil antikor doğru seyreltme (Bu durumda, seyreltme, dUTPase antikor için 1:2000 ' dir) ve 4 °C ' de hafif sallanan ile gece boyunca inküyeyin.
13. Ertesi gün, 4 °c rocker dan bir oda sıcaklığı rocker, birincil antikor çözeltisi atarak leke çıkarın.
14. TBST ile üç hızlı yıkayarak, tamamen Blot aşağı, 3 yıkayan, 5 dakika her, yavaş sallanan takip altına almak için yeterli sıvı kullanarak yapın.
15. Son yıkama sonrasında, 5% süt-tbst çözeltisi 5 ml ekleyin ve 15 dakika sonra atmak için leke kaya.
16. İstenen konsantrasyonda% 5 Milk-TBST ' a seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin. (Bu durumda, 1:5000 keçi Anti-tavşan% 5 süt-TBST çözeltisi 5 mL seyreltilmiş)
17. Oda sıcaklığında inküye, 1 h için sallanan, sonra solüsyonu atın.
18. TBST ile üç hızlı yıkamayı takip edin, 3 yıkanarak, 5 dakika her, yavaşça sallanan, sonra son yıkama atın ve 5 mL TBS ekleyin.
19. Bir ECL chemiluminesans algılama çözeltileri bir 1:1 karışımı hazırlamak (2 ml son hacmi için her reaktif 1 ml) ve 1 dakika boyunca kulyatan leke doğrudan bu ekleyin.
20. Membran Cımbız kullanarak çıkarın ve bir laboratuar silme ile köşe DAB, herhangi bir aşırı solüsyonu kaldırarak. Membranı Shrink SARINA yerleştirin ve protein tarafını bir x-ışını kasetine yerleştirin.
21. Membranı x-ışını filmini açığa çıkarın. Pozlama süresi farklılık gösterecektir.

Sonuçlar

Nükleer dUTPase her monomerik protein¹¹üçüncü amino asit konumlandırılmış iki sistein kalıntılarının etkileşimi ile istikrarlı bir dimer yapılandırma oluşturan bir moleküllü disülfür bağlantı oluşturur. Bu Şekil 1a, B'de gösterilmiştir. Bu disülfür bağlantıyı sağlamak için sınırlı olmayan ortamda göç anormallikleri nedeniyle spesifik olmayan bir etkileşim değil, t uygun bir kontrol eklenmesi esastı. Not, nükleer dutpas...

Tartışma

Burada özetlenen Yöntem, disülfür bağlantıları aracılığıyla stabilize multimerik kompleksleri analizi için düz ileri bir protokol verir. Bu protokol, geniş bir uygulama yelpazesi için izin veren diğer hücre kültürü hatları, dokulara ve organizmalara kolayca adapte edilebilir.

Bu prosedürün önemli bir adımı disülfit bağlantıların ekstraksiyon prosedürün bir sonucu olmadığından emin olmaktır. Herhangi bir ücretsiz sistein kalıntıları iodoacetamid¹³kullanılarak bloke edile...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
%16 prekast TGX jeller	ThermoFisher	Xp00160
175 cm2 Flask	Cell star	658175
18CO	ATCC	CRL-1459
6 cm2 çanak	VWR	10861-588
A549 ATCC		CCL-185
Amersham ECL algılama kiti	GE
Leke transfer aparatı	Biorad	153BR76789
BME	Sigma Aldrich	M3148
Bradford protein reaktifi	Biorad	5000006
Bromofenol Mavisi
BSA	Hücre sinyalizasyonu	99985
Hücre lizis tamponu	Hücre sinyali	9803
Santrifüj	Eppendor	5415D
DMEM	Gibco	11330-032
Matkap
EDTA	Sigma Aldrich	M101
Elektroforez aparatı	Invitrogen	A25977
Ekstra kalın batı kurutma kağıdı	ThermoFisher	88610
Fetal sığır serumu	Gibco	1932693
Formaldehit	ThermoFisher	28908
Cam-teflon homojenizatör
Gliserol	Sigma Aldrich	65516
Glisin	RPI	636050
Isı bloğu	Denville	10285-D
Hepes	Sigma Aldrich	H0527
Hidroklorik asit	VWR	2018010431
İyodoasetamid	ThermoFisher	90034
Kimwipe	Kimtech	34155
Metanol	Pharmco	339000000
Yağsız kuru süt	Hücresi sinyalizasyonu	99995
PBS	Sigma Aldrich	P3813
PMSF	Sigma Aldrich	329-98-6
Posi-tıklama tüpü	Denville	C2170
Güç kaynağı	Biorad	200120
Önceden boyanmış işaretleyici	ThermoFisher	26619
PVDF membran	Biorad	162-0177
Rocker	Güvenilir Bilimsel	55
Saos2	ATCC	HTB-85
SDS	Biorad	161-0302
İkincil antikor	Hücre sinyalizasyonu	70748
Küçük hücreli sıyırıcı	Tygon	S-50HL sınıf VI
Sodyum klorür	RPI	S23020
Sodyum piruvat	Gibco
Sonikatör	Branson	450
Lekeleme için sünger ped	Invitrogen	E19051
Karıştırma plakası	Corning	PC353
Sükroz	Sigma Aldrich	S-1888
Tris Baz	RPI	T60040
Tris Tamponlu Salin, Tween 20, pH 7.5	Sigma Aldrich	SRE0031
Tris-Glisin çalışan tampon	VWR	J61006
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
U-2 OS	ATCC	HTB-96
X-ışını filmi	ThermoFisher	34090

16817200 ile