Disulfide bağlantıları uzun birçok proteinlerin yapısını stabilize olduğu bilinmektedir. Bu bağlantıyla stabilize edilmiş multimerik kompleksleri analiz etmek için basit bir yöntem, SDS-PAGE analizinin azaltılması yoluyla yapılır. Burada, bu yöntem, insan kemiği osteosarkomu hücre hattı U-2 OS dutpase nükleer izoformu analiz ederek gösterilmektedir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kültürde memeliler hücrelerinde Disulfide bağlantıları ile stabilize Multimeric kompleksleri algılamak için non-azaltma SDS-sayfa analizi ve kimyasal Crosslinking birleştiren
Bu makalede
Özet
Özet
Birçok proteinlerin yapıları, kovalent disülfür bağlantıyla stabilize edilir. Son zamanlarda bu bağ da bir post-translational modifikasyon olarak sınıflandırılmıştır. Böylece, bu değişiklik yaşam hücrelerinde çalışma muktedir önemlidir. Bu sistein-stabilize multimerik kompleksleri analiz etmek için basit bir yöntem olmayan SDS-sayfa analizi ve formaldehit çapraz bağlama iki adımlı bir yöntem aracılığıyla. Bu iki adımlı Yöntem, teknik kolaylığı ve düşük kullanım maliyeti nedeniyle disülfit bağlantıyla stabilize edilmiş multimerik kompleksleri açığa çıkarmak için ilk adım olarak avantajlıdır. Burada, insan kemiği osteosarkomu hücre hattı U-2 OS özellikle dutpase nükleer izoformu analiz ederek bu yöntemi göstermek için kullanılır.
Giriş
Disulfide bağlantıları uzun birçok proteinlerin yapısını stabilize olduğu bilinmektedir. Son çalışmalar, bu Bond da geri dönüşümlü bir post-translational modifikasyon olarak sınıflandırılmıştır, bir sistein tabanlı olarak hareket "redox anahtarı" protein fonksiyonu modülasyonu için izin, konum ve etkileşim1,2, 3,4. Böylece, bu değişiklik çalışabilmesi önemlidir. Bu sistein-stabilize multimerik kompleksleri analiz etmek için basit bir yöntem olmayan azaltarak SDS-sayfa analizi5. SDS-page analizi, sonuçların hızlı, kol....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. ıodoacetamid kullanarak serbest sistein kalıntılarının engellenmesini
- U-2 OS hücrelerini 6 cm2 ' ye% 50 –% 60 ' lık yüksek glikoz içeren asgari esansiyel ortamda% 10 fetal sığır serumu ve 37 °c ' de% 1 Sodyum piruvat% 5 Co2' de büyütün.
- Kullanmadan önce 10 mM iodoacetamid taze bir stok yapmak, daha sonra kullanılmayan reaktif atın.
- 0,1 mM son konsantrasyon iodoacetamid doğrudan hücre kültürü medya ekleyin. Hafifçe 2 dakika için oda sıcaklığında çanak kaya.
2. hücreleri hasat
- Medyayı hücrelerden aspirate.
- Hücreleri üç kez 5 mL soğuk fosfat-tamponlu tuz (PBS) ile....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Nükleer dUTPase her monomerik protein11üçüncü amino asit konumlandırılmış iki sistein kalıntılarının etkileşimi ile istikrarlı bir dimer yapılandırma oluşturan bir moleküllü disülfür bağlantı oluşturur. Bu Şekil 1a, B'de gösterilmiştir. Bu disülfür bağlantıyı sağlamak için sınırlı olmayan ortamda göç anormallikleri nedeniyle spesifik olmayan bir etkileşim değil, t uygun bir kontrol eklenmesi esastı. Not, nükleer dutpas.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada özetlenen Yöntem, disülfür bağlantıları aracılığıyla stabilize multimerik kompleksleri analizi için düz ileri bir protokol verir. Bu protokol, geniş bir uygulama yelpazesi için izin veren diğer hücre kültürü hatları, dokulara ve organizmalara kolayca adapte edilebilir.
Bu prosedürün önemli bir adımı disülfit bağlantıların ekstraksiyon prosedürün bir sonucu olmadığından emin olmaktır. Herhangi bir ücretsiz sistein kalıntıları iodoacetamid13kullanılarak bloke edile.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, bu makalenin içeriğiyle ilgili çatışmalara sahip olmadıklarını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu taslağı düzenlemeye yardımcı olmak için tüm çabalarını dutpase poliklonal antikor ve Kerri ciccaglione arıtma için Dr Jennifer Fischer tarafından ileriye koymak çabaları minnettarız. Bu araştırma kısmen New Jersey Sağlık Vakfı (Grant #PC 11-18) bir hibe tarafından desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| %16 prekast TGX jeller | ThermoFisher | Xp00160 | |
| 175 cm2 Flask | Cell star | 658175 | |
| 18CO | ATCC | CRL-1459 | |
| 6 cm2 çanak | VWR | 10861-588 | |
| A549 ATCC | CCL-185 | ||
| Amersham ECL algılama kiti | GE | ||
| Leke transfer aparatı | Biorad | 153BR76789 | |
| BME | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bradford protein reaktifi | Biorad | 5000006 | |
| Bromofenol Mavisi | |||
| BSA | Hücre sinyalizasyonu | 99985 | |
| Hücre lizis tamponu | Hücre sinyali | 9803 | |
| Santrifüj | Eppendor | 5415D | |
| DMEM | Gibco | 11330-032 | |
| Matkap | |||
| EDTA | Sigma Aldrich | M101 | |
| Elektroforez aparatı | Invitrogen | A25977 | |
| Ekstra kalın batı kurutma kağıdı | ThermoFisher | 88610 | |
| Fetal sığır serumu | Gibco | 1932693 | |
| Formaldehit | ThermoFisher | 28908 | |
| Cam-teflon homojenizatör | |||
| Gliserol | Sigma Aldrich | 65516 | |
| Glisin | RPI | 636050 | |
| Isı bloğu | Denville | 10285-D | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H0527 | |
| Hidroklorik asit | VWR | 2018010431 | |
| İyodoasetamid | ThermoFisher | 90034 | |
| Kimwipe | Kimtech | 34155 | |
| Metanol | Pharmco | 339000000 | |
| Yağsız kuru süt | Hücresi sinyalizasyonu | 99995 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P3813 | |
| PMSF | Sigma Aldrich | 329-98-6 | |
| Posi-tıklama tüpü | Denville | C2170 | |
| Güç kaynağı | Biorad | 200120 | |
| Önceden boyanmış işaretleyici | ThermoFisher | 26619 | |
| PVDF membran | Biorad | 162-0177 | |
| Rocker | Güvenilir Bilimsel | 55 | |
| Saos2 | ATCC | HTB-85 | |
| SDS | Biorad | 161-0302 | |
| İkincil antikor | Hücre sinyalizasyonu | 70748 | |
| Küçük hücreli sıyırıcı | Tygon | S-50HL sınıf VI | |
| Sodyum klorür | RPI | S23020 | |
| Sodyum piruvat | Gibco | ||
| Sonikatör | Branson | 450 | |
| Lekeleme için sünger ped | Invitrogen | E19051 | |
| Karıştırma plakası | Corning | PC353 | |
| Sükroz | Sigma Aldrich | S-1888 | |
| Tris Baz | RPI | T60040 | |
| Tris Tamponlu Salin, Tween 20, pH 7.5 | Sigma Aldrich | SRE0031 | |
| Tris-Glisin çalışan tampon | VWR | J61006 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| U-2 OS | ATCC | HTB-96 | |
| X-ışını filmi | ThermoFisher | 34090 |
Kaynaklar
- Klomsiri, C., Karplus, P. A., Poole, L. B. Cysteine-based redox switches in enzymes. Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1065-1077 (2011).
- Antelmann, H., Helmann, J. D. Thiol-based redox switches and gene regulation. Antioxidants and Redox Signaling. 14 (....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
