Method Article

Fırça hücrelerinin Mouse tracheas 'tan izolasyon ve nicel değerlendirilmesi

DOI:

10.3791/59496

⸱

June 12th, 2019

 ,  ,  , 
1Division of Rheumatology, Allergy and Immunology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fırça hücreleri naif fare trakea bulunan nadir kolinerjik kemoduyusal epitelyal hücrelerdir. Sınırlı sayılar nedeniyle, havayolu bağışıklık ve remodeling fonksiyonel rolünün ex vivo değerlendirilmesi zordur. Trakeal fırça hücrelerinin Akış sitometrisi ile yalıtımına yönelik bir yöntem tarif ediyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trakeal fırça hücreleri, hava yolu lümeninden bağışıklık ve sinir sistemlerine sinyal iletimi için uygulanan kolinerjik kemoduyusal epitelyal hücrelerdir. Onlar bağırsak mukozasında tutam hücreleri, trakea fırça hücreleri ve burun mukozasında soliter kemoduyusal ve mikrovillöz hücreler içeren kemoduyusal epitelyal hücreler ailesinin bir parçasıdır. Farklı epitelyal bölmeler içindeki kemoduyusal hücreler anahtar hücre içi işaretçileri ve çekirdek transkripsiyonel imzayı paylaşır, aynı zamanda önemli transkripsiyonel heterojenliği de gösterir, muhtemelen yerel doku ortamını yansıtırlar. Tek hücreli süspansiyonların trakeal fırça hücrelerinin yalıtımı ayrıntılı olarak bu nadir epitelyal hücrelerin fonksiyonunu tanımlamak için gereklidir, ama onların yalıtım zorlu, potansiyel trakeal fırça hücreleri ve sinir uçları arasındaki yakın etkileşimi nedeniyle veya sıkı ve yapışır kavşak hava yolu özgü bileşimi nedeniyle. Burada, fare trakeal epitelyumdan fırça hücrelerinin yalıtımına yönelik bir prosedür açıklanmaktadır. Yöntem, submukoza gelen trakeal epitel ilk ayrımı dayanmaktadır, papain ile epitelyal levha bir sonraki kısa kuluçarı için izin. Bu prosedür, akış cytometrik sıralama ve uygulanabilir trakeal fırça hücrelerinin fonksiyonel analizi için hızlı ve kullanışlı bir çözüm sunar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fırça hücreleri, acı tat reseptörlerinin ifadesi ve tat tomurcuğu hücrelerinde bulunan tat reseptörü dönüştürücü makinelerinin karakterize olduğu kemoduyusal epitelyal hücreler sınıfına aittir. Tat tomurcuk hücrelerinin aksine, kemoduyu epitelyal hücreler epitelyal yüzeylerde dağılmış ve burun epiteli hücreler (SCCS) ve microvillous hücreleri olarak adlandırılır1,2, trakea fırça hücreleri 3,4, ve tüft hücreler bağırsak5,6. Acı tat reseptörleri ve acı tat dönüştürücü makine ifade epitelyal hücreler de üretra7,8 ve işitsel tüp9bulunur. Hava yolu fırça hücreleri nörojenik ve bağışıklık havayolu yanıtlarında benzersiz işlevlere sahiptir. Onlar asetilkolin üreten kemoduyusal hücreler, acı bileşikler ve çekirdek algılama maddeleri gibi bakteriyel metabolitler ile aktivasyon üzerine koruyucu solunum refleksleri uyandıran10. Havayolu fırça hücreleri de Il-25 baskın hava yolu epitelyal kaynağıdır, hangi hava yolları3aeroallerjen-elicited tip 2 inflamasyon düzenler.

Alt hava yolu fırça hücrelerinin tam transkriptom karakterizasyonu ve çevresel uyaranlara yanıt onların düşük sayılar trakeal epitelyum ve büyük bronşi10ötesinde çok sınırlı sayıda ile sınırlıdır. Bağırsak epitelinin kemoduyusal hücrelerin izolasyonunda kullanılan teknikler, trakea 'dan orantılı olarak yüksek sayılar vermedi, muhtemelen sinir uçları ile trakeal fırça hücrelerinin samimi temasları nedeniyle10 veya diğer yapışkanslar ve sıkı kavşak proteinlerinin bileşimi gibi solunum mukozasında dokuya özgü faktörler. Tek hücreli RNA sıralama analizi için daha yüksek sayılarda trakeal fırça hücrelerinin başarılı bir şekilde yalıtılmasının son raporları, papain ile 2 h inkübasyon ya da pronase11,12ile 18 h inkübasyon kullanılmıştır. Sindirim enzimleri ile uzun kuluzlar hücre canlılığı azaltabilir ve sindirilmiş dokulardan hücrelerin transkripsiyonel profilini değiştirmek beri13, bu diğer chemosensory epitelyal nüfusu ile önyargı karşılaştırmalı analiz olabilir.

Burada, RNA sıralaması3için trakeal fırça hücrelerinin yalıtımına yönelik bir yöntem bildiriyoruz. Yüksek doz dispaz ile trakea tedavisi submukoza epitel ayırır. Papain ile epitelyal sac sonraki sindirim Bu yapısal hücrenin mükemmel iyileşme sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıdaki denemeleri yapmadan önce, tüm hayvan bakım kullanımı ve protokollerinin kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (IAUC) tarafından onaylanması ve Ulusal Araştırma Konseyi 'nin "bakım ve Kullanım Kılavuzu "ile uyumlu olarak gerçekleştirildiğinden emin olun. Lab Animals " (8 . sürüm, 2011) ve gelmesi yönergeleri. Aşağıda açıklanan tüm prosedürler Brigham ve kadın Hastanesi 'nde kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından incelenip onaylanmıştır.

1. Reaktiflerin hazırlanması

  1. 16 U/mL dispaz ve 20 μg/mL DNase ı içeren bir PBS çözeltisi olan Dispase sindirim çözümünü hazırlayın. 37 °C ' de bir su banyosundan solüsyonu ısınmadan önce dispaz tozunun tamamen çözünmesini sağlayın.
  2. Bir durdurma çözüm yapmak için Dulbecco modifiye kartal Orta (DMEM) için% 5 ısı inaktive fetal sığır serumu (FBS) ekleyin.
  3. Tyrode ı tamponunu hazırlayın: 26 U/mL papain (20 μL/mL 48 U/mg papain çözeltisi) ve 10 μL/mL L-sistein ile HEPES-Tyrode ' n e s tamponunu kalsiyum olmadan ekleyin.
  4. Tyrode II tamponunu hazırlayın: 2 μL/mL leupeptin (5 mg/mL) ile HEPES-Tyrode ' l e m tamponunu kalsiyum ile ekleyin.
  5. FACS buffer hazırlayın: Hanks ' dengeli tuz çözeltisi (HBSS) kalsiyum olmadan kullanın, magnezyum & fenol kırmızı, 2 mM Etilen ile tamamlayıcı diaminetetraasetic asit (EDTA) ve ekleyin 2% FBS.

2. fare trakea diseksiyon

Not: Bu protokolde kullanılan fareler sohbet(BAC)-EGFP (B6. CG-TG (RP23-268L19-EGFP) 2Mik/J), 3-6 ay yaş her iki cinsiyeler. EGFP fotobleaching azaltmak için doğrudan ışık doku pozlama minimize.

  1. 100 mg/kg pentobarbital ötenazi çözeltisi intraperitoneal enjekte veya ıasuc tarafından onaylanan standart protokolleri kullanarak fareyi ötenize.
  2. Genişletilmiş üst ve alt ekstremite ile 21 G iğneler ile fitil pozisyonunda bir cerrahi tahta üzerinde fareyi düzeltin. Alanı sterilize etmek için% 70 EtOH ile kürk sprey.
  3. Düz forseps kullanarak, karın cilt ve kürk kaldırın ve Diseksiyon makas (düz makas, 3 cm) ile merkezinde bir kesi yapmak. Makası kullanarak, cildin subkutan dokusundan mandibula için karından ayırın. Subkutan dokusu forseps ile tutarak, karın duvarının merkezinde makas ile küçük bir kesi yapın.
  4. Peritonumu V şeklinde bir kesi ile açın. Forseps kullanarak, yavaşça kenara ince bağırsak hareket, abdominal aort ve Vena Cava bulmak ve hızlı Exsanguination için izin Diseksiyon makas ile bir kesi yapmak.
  5. Diyaframı bulun. 18 G iğne kullanarak, akciğerleri saptırmak için sternum hemen altında diyaframda bir açılış yapın. Kaburgaların tabanı boyunca kesim yapmak için keskin sivri düz kesimli makas kullanarak diyaframı dikkatli bir şekilde kaburga kafesinden ayırın.
  6. Forseps kullanarak, sternum maruz sonu kaldırın ve boynunda kaburga kafesi tabanına boyuna sternum kesti. Kısa düz makas (2 cm) ile merkezi bir servikal kesi yapın ve submandibular bezin iki lobları ayırın.
  7. Dikkatle çevreleyen bağ dokusu ve ince nokta yüksek hassasiyetli forseps bir çift ile Carina üzerinde timus çıkarın.
  8. İlk olarak epiglot seviyesinde proksimal ucunu ayırarak ve sonra distal ucunu trakea bifurkasyonu seviyesinde keserek trakea 'yı serbest bırakmak.
  9. Epiglot 'i bulun ve epiglot 'ten Carina 'ya kadar uzunlamasına trakea 'ya kesin.

3. trakeal epitelyal sindirim

  1. Trakea 'yi 750 μL ön ısıtılmış (37 °C) dispaz sindirim solüsyonu içeren 1,5 mL 'Lik bir tüpe yerleştirin. Oda sıcaklığında 40 dakika için 200 rpm de bir shaker üzerinde inkübe. Doğrudan ışığa maruz kalma azaltmak için alüminyum folyo ile tüp kapak.
  2. Reaksiyon durdurmak için% 5 FBS ile soğuk DMEM 750 μL ekleyin. Buzun üzerine yerleştirin.
  3. Trakea 'ya bir petri tabağı (100 mm x 15 mm) aktarın ve Diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Epitel tarafı yukarı bakacak şekilde trakea yönlendirmek. Uzunlamasına disseke trakea, kıkırdak halkalar tarafından tutulan yarı silindirik bir şekle sahiptir. Epitelyum konkav yüzeyinde.
  4. Epiglot alan trakea düz forseps ile Petri tabak ve bir boyutu 22 tek kullanımlık neşter kullanarak, trakea dan epitelyum kazımak. Epitelyal tabaka yarı saydam bir sac olarak ayrılır.
  5. Epitel, neşter ile Mince. Epitelyal tabakası 2 mL tüpüne aktarın.
  6. Petri tabağı ile durulayın 750 μL Tyrode ı tampon ve Transfer 2 mL tüp içeren epitelyal tabaka.
  7. Tyrode ı tamponunda trakeal epitel tabakasını 37 °C ' de 200 rpm 'de bir shaker üzerinde 30 dakika boyunca inküd. Doğrudan ışığa maruz kalma azaltmak için alüminyum folyo ile tüp kapak.
  8. 750 μL soğuk Tyrode II tampon ekleyin. 20-30 için şiddetle sindirilmiş doku Vortex s. 18 G iğne 10 kez bağlı bir şırınga ile Homojenat Triturate.  21 G Gauge iğne ve triturate 10-20 daha fazla kez geçin.
  9. 100 μm süzgeciyle hücreleri 50 mL konik tüpüne filtreleyin. Soğuk FACS tampon 30:1 vol/Vol ekleyin.
  10. 4 °C ' de 10 dakika için 350 x g 'de spin ve supernatant atın. Soğuk FACS tampon içinde Pelet resuspend ve 12 mm x 75 mm (5 mL) polistiren tüp süspansiyon transfer. 4 °C ' de 10 dakika için 350 x g 'de tekrar Döndür ve supernatant atın.
  11. 100 μL FACS arabelleğinde Pelet yeniden askıya alın.
  12. Özel olmayan bağlayıcılığı engellemek için 1 μL Anti-fare CD16/32 engelleme antikor ekleyin ve buzda 15 dakika boyunca inküye yapın. Yıkanmayın.
  13. Aşağıdaki antikorları ve ilgili izotype denetimlerini ekleyin: Pasifik mavisi Anti-fare CD45 veya sıçan IgG2a, k (0,25 μg/106 hücreler 100 μL hacimde) ve allofikosiyanin (APC) fare karşıtı EpCAM veya sıçan IgG2b, k (0,5 μg/106 hücreler, 100 μL hacminde) monoklonal antikorlar. Doğrudan ışıkta korunan buz üzerinde 45 dk için inküye yapın. 350 x g 'de 4 °c ' de 10 dakika soğuk FACS tampon, mix ve spin 4,5 ml ekleyin. FACS arabelleği atın ve 300 μL soğuk FACS tampon içinde Pelet yeniden askıya.
  14. Akış cytometrik sıralamadan hemen önce propidium iyodür (PI) (5 μg/ml) ekleyin.
    Not: Fırça hücrelerinin, filtrelere uyumu artırabilir (Şekil 3C) çeşitli süreçlerle düzensiz bir şekli vardır. 30 mm ile 70 mm ve 100 mm filtrelere kıyasla daha büyük gözenek filtreleri daha iyi verim sağladı. Buna ek olarak, papain sindirimi sonrasında hücre süspansiyonunun kapsamlı triturasyonu fırça hücresi verimleri önemli ölçüde geliştirir. Hücrelerin daha ince bir şekilde dağılması için daha küçük bir delik (21 veya 23 G iğne) tarafından izlenen ilk triturasyon için 18G iğne kullanmanızı öneririz.

4. akış cytometry gating stratejisi

  1. İleri ve yan dağılım açısı ile enkaz hücreleri tanımlayın. İleri dağılım yüksekliği ve genişliği ve yan dağılım yüksekliği ve genişliğini kullanarak ceketleri hariç. Ceketleri yüksek genişlik değerlerine sahip hücreler olacaktır.
  2. Tek hücreler içinde, canlı hücreleri PI negatif olan nüfus olarak tanımlayın.
  3. Canlı tek hücreler içinde CD45 düşük negatif hücrelere izotype denetimine göre tanımlayın.
  4. CD45 düşük/negatif hücreler içinde de eGFP pozitif olan EpCAM pozitif hücreleri tanımlayın (FITC kanalında). Bu fırça hücrelerinin nüfusu (Şekil 2A).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yordam, RNA sıralama3için trakeal fırça hücrelerini yalıtmak için başarıyla uygulandı. 2 adımlı protokol (Şekil 1) ile doku trakea ve sindirim yalıtım sonra, hücreler toplanan ve PI ile ölü hücrelerin dışlama sonra floresan etiketli CD45 ve EpCAM ile lekelenmiş. İleri ve yan dağılım özelliklerine dayanarak ceketleri dışarı gating sonra, biz CD45 için düşük/negatif olarak fırça hücreleri tanımlanan, EpCAM için pozitif ve EGFP için pozitif (Şekil...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz 40 dakika için yüksek doz dispaz tedavisi bir arada kısa papain tedavisi (30 dk) takip, trakeal sindirim ve fırça hücre yalıtımı için optimum bir protokol sağlar bulundu. Bu kombinasyon hem geniş sindirim önler ve fırça hücrelerinin en yüksek verim üretir, alternatif protokollere kıyasla.

Hematopoetik hücreler ayıklamak için akciğer sindirimi klasik kolajenaz IV15gibi hafif sindirim enzimleri üzerinde dayanırken, epitelyal hücrelerin yalıtım daha karmaşık protokolle...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz Brigham ve kadın ınsan Immünoloji merkezi Flow Core akış cytometrik sıralama ile onun yardımı için adam Chicoine teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık bağışları R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N. A. B), U19 AI095219 (N.A.B., L. G. B) ve K08 AI132723 (L. G. B) ve Amerikan alerji, astım ve Immünoloji (AAAAI)/Amerikan Akciğer alerjisi tarafından destekleniyordu Solunum hastalığı Ödülü (N.A.B.), AAAAI Vakfı fakülte geliştirme Ödülü (L.G.B.) tarafından, Steven ve Judy Kaye genç yenilikçiler Ödülü (N.A.B.) tarafından, JoYcElYn C. Austen Fonu kadın hekim bilim adamları kariyer gelişimi için (L.G.B.), ve bir vinik ailesi (L.G.B.) tarafından cömert bağış.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Antikorlar< / güçlü >
Anti-GFP (Poliklonal keçi Ig)Abcamkedi # ab5450
APC anti-fare CD326 (EpCAM)  (G8.8)Biyoefsanekedi#118214
APC Sıçan IgG2a, k izotip kontrolüBiyoefsanekedi#400511
DAPIBiyoefsanekedi#422801
Eşek anti-keçi IgG (H+L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 488Yaşam Teknolojileri/Moleküler Problarkedi#A-11055
Normal Keçi IgGR& D Sistemlerikedi # AB-108-C
Pasifik Mavisi anti-fare CD45 (30F-11)Biolegendkedi # 103126
Pasifik Mavi Sıçan IgG2b, k izotip kontrolüBiolegendkedi # 400627
TruStain FcX (anti-fare CD16 / 32) AntikorBiolegendkedi # 101320
Kimyasallar, Peptitler ve Rekombinant Proteinler Dispase
Gibcokedi# 17105041 
DNase ISigma kedi# 10104159001
HEPES-Tyrode' s Kalsiyumsuz Tampon (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2< / sub>, 12 mM NaHCO3< / sub>, 0.4 mM NaH2< / sub>PO4< / sub>,% 0.25 BSA, 5.5 mM Glikoz. 18.2 megaohm suda hazırlanır ve 0.22 & ile süzülür; m filtreBoston BioProductskedi # PY-912
Tyrode ' s Çözeltisi (HEPES Tamponlu) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2< / sub>, 2 mM MgCl2< / sub> ve 10 mM glikoz. 18.2 megaohm suda hazırlanır ve 0.22 & ile süzülür; m filtresi. )Boston BioProductscat# BSS-355
L-SisteineSigmacat# C7352
Leupeptin trifloroasetat tuzuSigmacat# L2023
Papaya lateksSigmacat# P3125
Propidium iyodür Sigmacat# P4170
Deneysel Modeller: Organizmalar/Suşlar
ChATBAC<>-eGFP (B6. Cg-Tg (RP23-268L19-EGFP) 2Mik / J)Jackson Laboratuvarı7902
Ekipman< / güçlü >
Airyscan konfokal sistemli LSM 800 & nbsp; a  üzerinde; Zeiss Axio Observer Z1 Ters MikroskopZeiss
LSRFortessaBD647465
tek kullanımlık ekipman
1,5 mL steril tüplerThomas Scientific1157C86
5 mL Poysterene Yuvarlak Tabanlı Tüp, 12 mm x 75 mm stilFalcon14-959-1A
50 mL Polipropilen konik boru, 30 mm x 115 mm stilFalcon352098
Tüy Tek Kullanımlık Neşter no.12Fisher ScientificNC9999403
Petri kabı, 100 mm x 15 mm StyleFalcon351029
Steril hücre süzgeci, 100 μ mBalıkçı markasıkedi#22363549

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tizzano, M., et al. Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).
  2. Genovese, F., Tizzano, M. Microvillous cells in the olfactory epithelium express elements of the solitary chemosensory cell transduction signaling cascade. PLoS One. 13 (9), 0202754(2018).
  3. Bankova, L. G., et al. The cysteinyl leukotriene 3 receptor regulates expansion of IL-25-producing airway brush cells leading to type 2 inflammation. Science Immunology. 3 (28), (2018).
  4. Krasteva, G., Canning, B. J., Papadakis, T., Kummer, W. Cholinergic brush cells in the trachea mediate respiratory responses to quorum sensing molecules. Life Sciences. 91 (21-22), 992-996 (2012).
  5. Nadjsombati, M. S., et al. Detection of Succinate by Intestinal Tuft Cells Triggers a Type 2 Innate Immune Circuit. Immunity. 49 (1), 33-41 (2018).
  6. von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).
  7. Deckmann, K., et al. Bitter triggers acetylcholine release from polymodal urethral chemosensory cells and bladder reflexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8287-8292 (2014).
  8. Liu, S., et al. Members of Bitter Taste Receptor Cluster Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126 Are Expressed in the Epithelium of Murine Airways and Other Non-gustatory Tissues. Frontiers in Physiology. 8, 849(2017).
  9. Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the auditory tube. Histochemistry and Cell Biology. 137 (4), 483-497 (2012).
  10. Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the trachea regulate breathing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9478-9483 (2011).
  11. Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
  12. Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
  13. Dwyer, D. F., Barrett, N. A., Austen, K. F. Immunological Genome Project, C. Expression profiling of constitutive mast cells reveals a unique identity within the immune system. Nature Immunology. 17 (7), 878-887 (2016).
  14. Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
  15. Bankova, L. G., Dwyer, D. F., Liu, A. Y., Austen, K. F., Gurish, M. F. Maturation of mast cell progenitors to mucosal mast cells during allergic pulmonary inflammation in mice. Mucosal Immunology. 8 (3), 596-606 (2015).
  16. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  17. Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 1475-1483 (2011).
  18. Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).
  19. Rock, J. R., et al. Transmembrane protein 16A (TMEM16A) is a Ca2+-regulated Cl- secretory channel in mouse airways. Journal of Biological Chemistry. 284 (22), 14875-14880 (2009).
  20. Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular and Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).
  21. Verma, S., Dixit, R., Pandey, K. C. Cysteine Proteases: Modes of Activation and Future Prospects as Pharmacological Targets. Frontiers in Pharmacology. 7, 107(2016).
  22. Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
  23. Kaiser, O., et al. Dissociated neurons and glial cells derived from rat inferior colliculi after digestion with papain. PLoS One. 8 (12), 80490(2013).
  24. Aoyagi, T., Takeuchi, T., Matsuzaki, A., Kawamura, K., Kondo, S. Leupeptins, new protease inhibitors from Actinomycetes. Journal of Antibiotics (Tokyo). 22 (6), 283-286 (1969).
  25. Kohanski, M. A., et al. Solitary chemosensory cells are a primary epithelial source of IL-25 in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (2), 460-469 (2018).
  26. Patel, N. N., et al. Solitary chemosensory cells producing interleukin-25 and group-2 innate lymphoid cells are enriched in chronic rhinosinusitis with nasal polyps. International Forum of Allergy & Rhinology. , (2018).
  27. Kouzaki, H., O'Grady, S. M., Lawrence, C. B., Kita, H. Proteases induce production of thymic stromal lymphopoietin by airway epithelial cells through protease-activated receptor-2. The Journal of Immunology. 183 (2), 1427-1434 (2009).
  28. Cambier, J. C., Vitetta, E. S., Kettman, J. R., Wetzel, G. M., Uhr, J. W. B-cell tolerance. III. Effect of papain-mediated cleavage of cell surface IgD on tolerance susceptibility of murine B cells. The Journal of Experimental Medicine. 146 (1), 107-117 (1977).
  29. Nishikado, H., et al. Cysteine protease antigens cleave CD123, the alpha subunit of murine IL-3 receptor, on basophils and suppress IL-3-mediated basophil expansion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (2), 261-266 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tracheal Brush CellsEpithelial IsolationPapain DigestionFlow Cytometric SortingDispase TreatmentCell ViabilityChAT eGFP ReporterFACS BufferPropidium IodideEpCAM Positive

Related Articles