Burada, sadece kısa sentetik DNA ve RNA oligonükleotides ve arıtılmış pol II gerektiren RNA polimeraz II (pol II) uzama kompleklerinin montajını tarif ediyoruz. Bu kompleksleri, Pol II uzama kompleksi ile ilişkili transkriptlerin Co-transcriptional işleme temel mekanizmaları eğitim için yararlıdır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Diseksiyon eş transkripsiyon RNA Işleme etkinlikleri için suni RNA polimeraz II uzama kompleksler
Bu makalede
Özet
Özet
Ökaryotik mRNA sentezi, bir DNA şablonunun, Multi-subunit enzim RNA polimeraz II ve Co-transcriptional kapatma ve preürosi RNA 'nın olgun mRNA 'yı oluşturacak şekilde birleştirilmesini gerektiren karmaşık bir biyokimyasal süreçtir. MRNA sentezi sırasında, RNA polimeraz II uzama kompleksi, katalitik aktivitesini kontrol eden büyük bir transkripsiyon faktörleri koleksiyonu ve olgun mRNA 'yı yaratan 3 ' işleme enzimleri ile düzenleme yapmak için bir hedeftir. MRNA sentezinin içsel karmaşıklığı nedeniyle, yalıtım ve çeşitli ortak transkripsiyon aşamalarında araştırma sağlayan basit deneysel sistemler büyük bir yarar vardır.
Bu yazıda, ortak transcriptional RNA kapatma soruşturması için uygun bir basit deneysel sistem açıklanmaktadır. Bu sistem, saflaştırılmış polimeraz ve yapay transkripsiyon kabarcıklarının montajında tanımlanan RNA polimeraz II uzama kompleksine dayanır. Biyotinlenmiş DNA ile immobilize zaman, bu RNA polimeraz II uzama kompleksleri bir kolayca manipülasyon ortak transcriptional RNA kapatma ve mekanizmalar tarafından uzama kompleksi acemi ve düzenler sırasında enzimi sırasında sabitleme bir araç sağlar RNA 'nın ortak transkripsiyon. Bu sistemin, RNA polimeraz II uzama kompleksine bağlanmış olan mRNA olgunlaşma diğer aşamalarında roller ile protein veya protein kompleksler istihdam ve/veya montaj eğitim için adapte olabilir tahmin.
Giriş
Ökaryotik haberci RNA (mRNA) sentezini RNA polimeraz II ve olgun mRNA verim için ön RNA işleme tarafından işlenmemiş bir ön-RNA sentezini içeren ayrıntılı bir biyokimyasal süreçtir. Capping, splicing ve Poliadenilasyon RNA işleme adımları büyük ölçüde ortak transkripsiyonlama gerçekleştirilir. Pol II uzama kompleksi, RNA işleme enzimlerinin çoğunun faaliyetlerini yapan ve düzenleyen bir iskele olarak hizmet vermektedir. Sonuç olarak, Olgun ökaryotik mrb 'ların nasıl üretilmesine ilişkin en son anlayışımız, işe temel alan biyokimyasal mekanizmaların uzama kompleksine atılmasına izin vermek için deneysel sistemlerin gelişmesine ağır bir şekilde dayanacak ve Co-transcrip....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. yapay uzama kompleksleri ve Pol II yürüyüş montajı
- Manyetik boncuk üzerinde 3 ' biotin molekül içeren olmayan şablon DNA oligo 1 nmol immobilize.
Not: aşağıdaki adımlar gelecekteki deneyler için hazırlamak için önceden yapılabilir. Bu protokolde kullanılan tüm oligo dizileri Tablo 1' de sağlanır. RNA oligos 5 '-trifosfat modifikasyonlarla sentezlenmiş durumdadır.- 200 μL manyetik boncuk (10 mg/mL) düşük protein bağlayıcı 1,5 mL tüp ekleyin ve sonra 2 dakika için bir manyetik raf yerleştirin.
- Tüp manyetik raf üzerinde iken, boncuklar rahatsız etmeden tüpten sıvı çıkarın. Boncuklar yıkamak için, rafa tü....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Rakamlar 2 ve 3 farklı kaynaklardan uzanan veya pol II genişleterek değişik uzunluklarda transkriptler içeren yapay uzama kompleksleri oluşturmak için kullanılan temsili sonuç reaksiyonları gösterir. Şekil 4 bu uzama kompleksleri, eş TRANSKRIPSIYON CTD phosphorylation bağımlı RNA kapatma tahlil için nasıl kullanılabilirler gösterir.
Şekil 2a
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
RNA işleme ve transkript uzaması düzenlemesi gibi pol II uzama kompleksine birleşen olayları incelemek isteyen çalışmalar, yüksek derecede arıtılmış bir enzim sisteminin kullanımı ile büyük ölçüde kolaylaştırılabilir. Bu tür enzim sistemlerini kurmak zor olabilir. Pol II tarafından organizöre bağımlı transkripsiyon en az beş genel transkripsiyon faktörü gerektirir. Bu faktörlerin hazırlanması ve stoklama ay sürebilir; Bu nedenle, bu süreçte oran sınırlayıcı adım genellikle sadece test tüpünde bazal transkripsiyon yeniden.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Biz meme kapatma enzim cDNA sağlayan S. Shuman teşekkür ederiz. Bu çalışma, büyük Kansas City Community Foundation 'da Helen Nelson Tıp Araştırma Fonu 'ndan yapılan Stowers Tıp Araştırmaları Enstitüsü 'ne hibe tarafından kısmen destekleniyordu. Bu yazıda temel alınan orijinal veriler http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434 adresinde bulunan Stowers Original veri deposundan erişilebilir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | RNA'yı radyoetiketleme için |
| 2x RNA yükleme boyası | New England Biolabs | B0363S | Şiddetle tavsiye edilir. Jel yüklemesi sırasında RNA hazırlamak için |
| % 40 Bis: Akrilamid çözeltisi | Biorad | 1610144 | |
| Sığır Serumu Albümini (20 mg / mL) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7 / Siklin H / MAT1 (CAK kompleksi) Protein, aktif, 10 ve mikro; g | Millipore Sigma | 14-476 | Pol II CTD |
| DNA oligonükleotidlerini | fosforile | Saflık özellikleri için Tablo 8'e bakın | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | Dynabeads M-280 streptavidin de sorunsuz kullandık ancak MyOne Streptavidin boncuklarını tercih ediyoruz çünkü daha yavaş çökeliyorlar |
| GlycoBlue Kopreçökitan (15 mg / mL) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | Şiddetle tavsiye edilir. Nükleik asit pelet mavisi boyalar, reaksiyonların işlenmesini çok daha kolay hale getirir |
| Hoefer SE600 standart, 1 mm ara parçalı ve 15 kuyulu tarak çift soğutmalı dikey elektroforez sistemi | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract yüksek yoğunluklu tüpler (1.5 mL) | Qiagen | 129046 | Şiddetle tavsiye edilir. Sulu ve organik fazlar arasında stabil bir bariyer oluşturan yüksek yoğunluklu bir jel içerir; ekstraksiyon sırasında RNA verimini artırır |
| Proteinaz K çözeltisi (20 mg/mL) | Yaşam Teknolojileri Invitrogen | 25530049 | |
| RNA oligonükleotidleri | Trilink | Daha fazla ayrıntı için Tablo 8'e bakın | |
| Maya İnorganik Pirofosfataz (100 birim/mL) | New England Biolabs | NEBM2403S | Yalnızca kapatma reaksiyonları sırasında gereklidir |
Kaynaklar
- Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. RNA polymerase II transcription: structure and mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).
- Daube, S. S., von Hippel, P. H. Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble du....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
