Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Diseksiyon eş transkripsiyon RNA Işleme etkinlikleri için suni RNA polimeraz II uzama kompleksler

9.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/59497

⸱

13 Mayıs 2019

 ,  , 
1Stowers Institute for Medical Research, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Kansas University Medical Center

Bu makalede

Özet

Burada, sadece kısa sentetik DNA ve RNA oligonükleotides ve arıtılmış pol II gerektiren RNA polimeraz II (pol II) uzama kompleklerinin montajını tarif ediyoruz. Bu kompleksleri, Pol II uzama kompleksi ile ilişkili transkriptlerin Co-transcriptional işleme temel mekanizmaları eğitim için yararlıdır.

Özet

Ökaryotik mRNA sentezi, bir DNA şablonunun, Multi-subunit enzim RNA polimeraz II ve Co-transcriptional kapatma ve preürosi RNA 'nın olgun mRNA 'yı oluşturacak şekilde birleştirilmesini gerektiren karmaşık bir biyokimyasal süreçtir. MRNA sentezi sırasında, RNA polimeraz II uzama kompleksi, katalitik aktivitesini kontrol eden büyük bir transkripsiyon faktörleri koleksiyonu ve olgun mRNA 'yı yaratan 3 ' işleme enzimleri ile düzenleme yapmak için bir hedeftir. MRNA sentezinin içsel karmaşıklığı nedeniyle, yalıtım ve çeşitli ortak transkripsiyon aşamalarında araştırma sağlayan basit deneysel sistemler büyük bir yarar vardır.

Bu yazıda, ortak transcriptional RNA kapatma soruşturması için uygun bir basit deneysel sistem açıklanmaktadır. Bu sistem, saflaştırılmış polimeraz ve yapay transkripsiyon kabarcıklarının montajında tanımlanan RNA polimeraz II uzama kompleksine dayanır. Biyotinlenmiş DNA ile immobilize zaman, bu RNA polimeraz II uzama kompleksleri bir kolayca manipülasyon ortak transcriptional RNA kapatma ve mekanizmalar tarafından uzama kompleksi acemi ve düzenler sırasında enzimi sırasında sabitleme bir araç sağlar RNA 'nın ortak transkripsiyon. Bu sistemin, RNA polimeraz II uzama kompleksine bağlanmış olan mRNA olgunlaşma diğer aşamalarında roller ile protein veya protein kompleksler istihdam ve/veya montaj eğitim için adapte olabilir tahmin.

Giriş

Ökaryotik haberci RNA (mRNA) sentezini RNA polimeraz II ve olgun mRNA verim için ön RNA işleme tarafından işlenmemiş bir ön-RNA sentezini içeren ayrıntılı bir biyokimyasal süreçtir. Capping, splicing ve Poliadenilasyon RNA işleme adımları büyük ölçüde ortak transkripsiyonlama gerçekleştirilir. Pol II uzama kompleksi, RNA işleme enzimlerinin çoğunun faaliyetlerini yapan ve düzenleyen bir iskele olarak hizmet vermektedir. Sonuç olarak, Olgun ökaryotik mrb 'ların nasıl üretilmesine ilişkin en son anlayışımız, işe temel alan biyokimyasal mekanizmaların uzama kompleksine atılmasına izin vermek için deneysel sistemlerin gelişmesine ağır bir şekilde dayanacak ve Co-transcriptional kapatma, birleştirme ve polyadenilasyon sorumlu enzimlerin düzenlenmesi.

Şaşırtıcı değil, bu tür deneysel sistemlerin geliştirilmesi zor olmuştur. Büyük bir engel sadece pol II in vitro tarafından bazal transkripsiyon reconstituting beş genel transkripsiyon başlatma faktörleri en az bir dizi gerektirir pol II transkripsiyon kendisi olağanüstü karmaşıklığı olmuştur: TGı, TFııD, TGı, TFııF ve TFııH 1. dahası, her türlü DÜZENLENMIŞ pol II transkripsiyon içinde vitro reconstituting transkripsiyon faktörleri ve coregulators daha büyük bir dizi gerektirir. Böylece, önemli bir amaç, Pol II transkripsiyon ve RNA işleme fonksiyonel bağlantı incelemeleri için uygun aktif pol II uzama kompleksler reanayasa sağlayan basit deneysel sistemler geliştirmek olmuştur.

Aktif pol II uzama kompleksler reconstituting için böyle basit bir yöntem, uzun pol II ve daha Geçenlerde, Co-transcriptional RNA işleme araştırmak için yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için yararlı olduğunu kanıtladı2,3 ,4,5. Bu yazıda, nasıl pol II uzama kompleksleri saflaştırılmış pol II ve sentetik transkripsiyon kabarcıkları hazırlanan gösterir nasıl etkili mekanizmalarını araştırmak için kullanılabilir Co-transcriptional, nazcent pol II transkripsiyonlarını üst altta yatan.

Capping, 5 '-guanosin "Cap" ' in 5 '-trifosfat sonuna kadar bulunan pol II transkriptlerinin kovalent ilavesi anlamına gelir. Cap, mRNA olgunlaşma, taşıma, çeviri ve diğer süreçler6,7sonraki adımlar için önemlidir. Kap, enzimin tıkanması olarak adlandırılan bir enzim tarafından pol II transkriptleri için ortak transcrip, eklenir. Mammalin hücrelerinde, kapatma enziminin RNA 5 '-trifosfataz ve Guanil transferaz faaliyetlerinden sorumlu aktif siteler tek bir polipeptid8içinde yer alır. Kapatma enzim pol II vücut ve Rpb1 karboky-terminal alanı (CTD) Ser5 heptapeptid tekrarlar üzerinde fosforylated yüzeyler üzerinde henüz tanımlanmalıdır ile etkileşimler ile yan II uzama kompleksi için işe5. Uzama kompleksinde, en az 18 nükleotib uzunluğuna ulaştığında ve polimeraz RNA çıkış kanalından ortaya çıkan bir kez, 5 '-guanozin kapağının ilavesi ile katlanma enzimi katalizler. Kapatma reaksiyonu ilk adımda, trifosfataz 5 '-difosfat verim RNA 5 '-trifosfat hidrolize. İkinci adımda, GTP, Guanil transferase tarafından GMP 'ye hidrolize edilir ve bir GMP-capping enzim orta oluşturur. Son olarak, Guanil transferaz, GMP 'yi 5 '-difosfat sonuna kadar aktarıyor ve kapağı üretecektir.

Kapatma reaksiyonunun dikkat çekici bir özelliği, Co-transcriptional (örn., fonksiyonel pol II uzama kompleksler ile ilişkili transkripsiyon), serbest RNA5,9' dan çok daha etkilidir. Böylece, alandaki önemli bir soru, Pol II uzama kompleksi ile kapatma enziminin etkileşimleri yoluyla nasıl bu dramatik etkinleştirme işlemi elde edilmiştir. Bu protokolde, sadece arıtılmış RNA polimeraz II ve yapay transkripsiyon kabarcıkları kullanılarak aktif RNA polimeraz II uzama kompleklerinin montajı açıklanmaktadır. Bu yöntemler, tanımlanan uzunluk ve sıralı transkriptler ile RNA polimeraz II uzama kompleksleri oluşturulması sağlar. Son zamanlarda yapılan bir çalışmada, RNA kaplama5mekanizmalarının yönlerini araştırmak için bir model olarak bu tanımlanan RNA polimeraz II uzama kompleksini kullandık. Özellikle, biz (i) RNA bu uzama kompleksleri ile ilişkili üst 100-kat daha fazla ücretsiz RNA ve (ii), Pol II CTD TFIıH bağımlı fosforilasyon tarafından uyarılmış daha verimli olduğunu gösterdi. Burada açıklanan yaklaşım, Pol II uzama kompleksine bağlı diğer ortak transcriptional RNA işleme reaksiyonları okumak için substratlar oluşturmak için uyarlanabilir.

Bu protokolün Bölüm 1 ' de, yapay uzama kompleksleri, sentetik bir şablon Strand DNA oligonükleotid bir RNA oligonükleotid tavlama tarafından oluşturulan 3 '-End yaklaşık 9 nükleotid şablon Strand DNA. Pol II daha sonra DNA üzerine yüklenir: RNA dubleks. Uzama kompleksi daha sonra, 3 ' End (Şekil 1 ve Şekil 2a) ile biotin ile etiketlenmiş kısmen tamamlayıcı, şablon içermeyen, DNA oligonükleotit ilavesi ile tamamlanır. RNA oligonükleotit, radyoaktif nükleotidler uygun kombinasyonları ilavesi üzerine tanımlanan uzunluk ve dizi radyoaktif transkriptler yapmak için bu uzama kompleksler pol II tarafından uzatılır. Buna ek olarak, uncorporated nükleotidler ve nükleotid farklı kombinasyonları daha da ilavesi kaldırmak için yıkımların bir kombinasyonu kullanarak, bir "pol II DNA şablonu boyunca farklı pozisyonlara yürüyebilir ve tanımlanan uzunlukları RNA sentezlemek. RNA daha sonra arıtılır ve denatüre üre-sayfa jeller içinde Elektroforez maruz. Protokolün Bölüm 2 ' de, yapay uzama kompleksleri, eş transkripsiyon RNA 'nı analiz etmek için kullanılır. Bu örnek, Pol II CTD 'nin TFIıH bağımlıdır fosforilasyonu ile birlikte transcriptional RNA 'nın tıkanması üzerindeki etkisini ölçer. Bu deneyde, enzim konsantrasyonunun (5, 15 ve 45 ng reaksiyon başına) ve zaman (1, 2 ve 4 dk) olarak bir fonksiyon olarak ortak transcriptional kapak kapsamını ölçüyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. yapay uzama kompleksleri ve Pol II yürüyüş montajı

  1. Manyetik boncuk üzerinde 3 ' biotin molekül içeren olmayan şablon DNA oligo 1 nmol immobilize.
    Not:     aşağıdaki adımlar gelecekteki deneyler için hazırlamak için önceden yapılabilir. Bu protokolde kullanılan tüm oligo dizileri Tablo 1' de sağlanır. RNA oligos 5 '-trifosfat modifikasyonlarla sentezlenmiş durumdadır.
    1. 200 μL manyetik boncuk (10 mg/mL) düşük protein bağlayıcı 1,5 mL tüp ekleyin ve sonra 2 dakika için bir manyetik raf yerleştirin.
    2. Tüp manyetik raf üzerinde iken, boncuklar rahatsız etmeden tüpten sıvı çıkarın. Boncuklar yıkamak için, rafa tüp kaldırmak, eklemek 1 mL 5 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, raf için tüp iade ve 2 dakika sonra yıkama solüsyonu çıkarın.
    3. Aynı arabelleğin 200 μL kullanarak 2 kez daha tekrar yıkanıyor.
    4. 400 μL 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, tampon içinde resuspend manyetik boncuk. Sonra 380 μL H2O ve 20 μl 10 μM şablon olmayan biyotinlenmiş DNA oligo ile karıştırın. Tüpü bir fındığa yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inküye yapın.
    5. 5 mM Tris-HCl pH 7,5 200 μL ile yıkama immobilize olmayan şablon DNA oligo 3 kez, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, ve sonra 3 kez 200 μL 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9,% 20 gliserol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL Sığır serum albümin.
    6. BSA ile engelleme boncuk bitirmek için 4 °C gece tüp bırakın.
    7. Ertesi gün, manyetik rafa tüp yerleştirin, kaldırmak ve sıvı atmak, ve pelletini boncuk 200 μL 20 mm HEPES-NaOH pH 7,9, 20% gliserol, 100 mm KCL, 1 mm EDTA, 0,5 mg/ml Sığır serum albümin ve yeni bir tüp transfer. Bu DNA şablonu için son konsantrasyon yaklaşık 5 μM ' dir.
      Not: İnkübasyon süresi ve oligo konsantrasyonu her biyotinlenmiş DNA oligo için ampirik olarak belirlenmelidir. Bu şablon 200 reaksiyon için yeterli sağlamalıdır ve 4 °C ' de saklanırken en az 6 ay sürecek.
  2. Anneal RNA ve DNA şablonu bir 2:1 molar oranı (sırasıyla 20 ve 10 pmol), DNA elde etmek için oligonükleotide oligos: RNA dubleks.
    1. Tablo 2' de açıklandığı gibi 10 μL tavlama karışımı ayarlayın.
      Not: 10 μL tavlama karışımı 10 reaksiyon için yeterlidir. Daha fazla bilgi gerçekleştirilirse, tavlama karışımı gerektiği gibi ölçeklendirilebilir.
    2. Aşağıdaki programı kullanarak bir termal bisikletçinde tavlama reaksiyonları gerçekleştirin: 45 °C ' de 5 dakika, her biri 43 °C ' den başlayarak 12 döngüden sonra, her döngü için 2 °C sıcaklık azalması. 4 °C ' de boşta.
      Not: Bu esnek bir zaman noktasıdır. Tavlama ~ 30 dakika içinde biter ancak daha uzun bir süre için 4 °C ' de bırakılabilirler. Laboratuvarda, tavlama karışımları, reaksiyon verimliliğinde herhangi bir azalma gözlemlemeden 4 saate kadar oturarak bırakılmıştır.
    3. RNA 'nın şablona DNA 'yı tavlama sırasında, protokolün daha sonraki adımlarında arabellekleri hazırlayın. Her tampon ile tek bir reaksiyon için her arabellek hazırlamak için gerekli malzemeler 2 ila 8 tablolarda listelenir. Diğer tüm arabellekler için yıkama ve (X + 1) için [Y (X + 1) + 1] faktörüyle tarifleri ölçeklendirin. X = hazırlanacak reaksiyon sayısı; Y = gerekli yıkama adımlarının sayısı (en az 3).
      Not: tüm arabellekleri deneme günü taze hazırlayın. PVA tamponlara eklendikten sonra tüpleri buzda yerleştirmeyin. Kullanmadan önce arabelleğine pol II veya nükleotidler ekleyin.
  3. DNA: RNA melez üzerine saflaştırılmış RNA polimeraz II yükleyin.
    1. Mix 1 pmol (1 μL) DNA: 13 μL pol II tampon ile RNA Dubleks ( Tablo 3).
    2. Adım 1.3.1 ' den gelen karışımına ~ 0,02 adet saf RNA pol II (1 μL) ekleyin ve kabarcıkları tanıtmadan, pipet ucu ile hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme yaparak karıştırın. 30 °C ' de 10 dakika boyunca inkübe.
      Not: Burada verilen birimler tek bir reaksiyon içindir; denemede reaksiyon sayısı için gerektiği kadar ölçeklendirin. RNA pol II, bu örnekte10 kullanılır olarak açıklanan sıçan karaciğerinden arındırılmış; Ancak, diğer kaynaklardan arındırılmış RNA pol II, kültürlü mammalin hücreleri veya Maya da dahil olmak üzere3,4,5,11,12,13de kullanılabilir.
  4. Biyotinlenmiş olmayan şablon DNA ilavesi ile uzama kompleksi tamamlayın.
    1. 5 pmol ekleyin (1 μL) immobilize olmayan şablon DNA oligo için 14 μL şablon olmayan DNA tamponu ( Tablo 4), adım 1.3.2 tüp ekleyin ve 37 °c ' de 10 dakika boyunca inküye.
    2. Numuneyi manyetik rafa 2 dk. yıkayın 1x ile 30 μL yıkama tamponu ( Tablo 7' den), Uncorporated pol II ve oligos 'u çıkarın.
  5. Radyoaktif RNA 23mers içeren uzama kompleksleri oluşturun.
    1. 30 °C ' de diğer tüm inküler gerçekleştirin. 1 μL 15 μM ATP ve 10 μcı (1 μL) [α-32P] UTP (3.000 ci/mmol) için 23 μL Pulse tampon ekleyin ve bunu kullanarak yıkanmış manyetik boncuklar yeniden pelletini.
      Dikkat: Radyoaktif malzeme tehlikelidir. Uygun koruyucu ekipman giydiğinizden ve Radyoaktif malzemenin güvenli kullanım ve bertaraf edilmesi için tüm Laboratuvar yönergelerine uytığınızdan emin olun.
      Not: Radyoaktif UTP 'i, Batı leke deneyleri gibi radyoaktif RNA gerekli olmadığında 15 μM UTP ile değiştirin.
    2. Radyoaktif 23mers sentezini sağlamak için 10 dakika reaksiyonu inküye.
    3. 100 μM ATP ve 100 μM UTP karışımı içeren 1,5 μL çözelti eklemek için 3,5 μL kovalamaca tamponu, önceden monte edilmiş uzama kompleksleri içeren tüpe ekleyin ve tüm nazcent transkriptleri 23mers 'a kovalamak için 5 dakika boyunca inküye yapın.
    4. Numuneyi 2 dakika boyunca manyetik rafa yerleştirin, supernatant 'ı çıkarın, bir kez 30 μL yıkama tamponu ile yıkayın ve 30 μL yıkama tamponunun içinde pelletini yapın.
    5. Veya reaksiyonları sonlandırmak için proteinaz K ve glikojen (Tablo 9) ile stop Mix 94 μL ekleyin ya da uzun transkriptler veya bölüm 2 ile uzama kompleksler oluşturmak için Bölüm 1,6 devam etmek için yol gösterimini gerçekleştirmek için.
  6. Isteğe bağlı 23, 25 ve 29 nükreotid transkriptleri yapmak için pol II Walk
    1. Adım 1.2.1 ile 1.5.4 arasında açıklanan prosedürü izleyin radyoaktif 23mers içeren uzama kompleksleri hazırlamak için. 4 tepki için yeterli kompleksleri olan yıkanmış uzama kompleksler 120 μL oluşturmak için 4 kat ölçeklendirin.
    2. Etiket 3 yeni tüpler "23mer", "25mer" ve "29mer". 30 μL yıkanmış uzama kompleksini "23mer" tüpüne aktarın ve 94 μL 'ye proteinaz K ve glikojen ile stop karışımı ekleyin.
    3. Manyetik rafa kalan 90 μL yıkanmış uzama kompleksleri içeren tüpü 2 dakika boyunca yerleştirin, supernatant 'ı çıkarın, ve 90 μL 'de, 1,5 mm ATP ve 1,5 mm CTP her biri 1,2 μL ile tamamlayıcı olarak pelletini boncuk. 30 °C ' de 10 dakika boyunca inkübe.
    4. Bir kez 90 μL yıkama tamponu ile yıkadıktan sonra, adım 1.5.4 açıklandığı gibi 90 μL yıkama tamponunun içinde resuspending, 30 μL 'lik uzama kompleksini "25mer" tüpüne aktarın ve 94 μL 'yi proteinaz K ve glikojen ile durdur karışımı ekleyin.
    5. Manyetik rafa kalan 60 μL uzama kompleksini içeren tüpü 2 dakika boyunca yerleştirin, supernatant 'ı çıkarın, ve 60 μL 'de, 1,5 mm ATP ve 1,5 mm CTP her biri 0,8 μL ile tamamlayıcı olarak pelletini boncuk.
    6. 30 °c ' de 10 dakika boyunca kulyarım, 60 μL yıkama tampon ile bir kez 1.5.5 bölüm olarak yıkayın ve 60 μL yıkama tamponunun içinde pelletini.
    7. 30 μL 'yi 2x örnekten "29mer" tüpüne aktarın ve 94 μL 'ye proteinaz K ve glikojen ile stop karışımı ekleyin ya da Bölüm 2 ' ye geçin.
    8. RNA arıtma ve analizine devam edin (Bölüm 3).

2. test Cotranscriptional capping için yapay uzama kompleksleri kullanma

  1. 1.2.1 ile 1.5.5 13 kat arasında açıklanan prosedürü ölçeklendirerek 23mers içeren yıkanmış uzama kompleksleri oluşturun. Bu 12 reaksiyon için yeterlidir + 1 ekstra.
  2. Pol II CTD fosforilasyon
    1. 2 dakika boyunca manyetik rafa yıkanmış uzama kompleksler içeren tüp yerleştirin, supernatant çıkarmak, ve pelletini boncuk 377 μL 1,5 mm ATP 13 μL ile tamamlayıcı.
    2. Sırasıyla + H ve-H etiketli iki yeni Tüp hazırlayın. Etiketli tüp + H eklemek 3 μL ~ 300 ng/μL TFIıH, ve etiketli tüp-H 9 μL eklemek 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% gliserol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL Sığır serum albumin.
      Not: Biz genellikle TFııH sıçan karaciğerinden arındırılmış kullanmak, ama biz benzer sonuçlar elde ettik ~ 0,6 μg/ticari-mevcut rekombinant Cdk7/siklin H/MAT1 reaksiyon (CAK, TFııH gelen kinaz modülü). Bilgi için malzeme tablosunu görün.
    3. Adım 2.2.1 ' den yıkanan uzama kompleklerinin 87 μL 'i + H etiketli tüpe ve 270 μL 'ye yıkanmış uzama kompleksini etiketli tüpe ekleyin-H. 30 °C ' de 10 dak.
    4. 2 dakika için manyetik rafa örnek yerleştirin. Aşırı nükleotidler ve ilişkisiz proteini kaldırmak için, sırasıyla 90 μL veya 270 μL yıkama tamponunu içeren + H ve-H reaksiyonlarında uzama kompleksini yıkayın.
  3. RNA kapatma
    1. 87 μL 'de + H etiketli tüpteki resuspend uzama kompleksleri (50 μM GTP (Tablo 10) ile desteklenen BTB. Resuspend uzama kompleksler-H etiketli tüp içinde 261 μL kapak karışımı.
    2. Hazırlamak 4 yeni tüpler etiketli 5 NG CE + H, 5 NG CE, 15 ng CE, 45 ng CE. Seyreltik kapatma enzim (CE) içine 20 mm HEPES-NaOH pH 7,9,% 20 gliserol, 100 mm KCL, 1 mm EDTA, 0,5 mg/ml Sığır serum albümin 5 NG CE/μL, 15 ng CE/μL veya 45 ng CE/μL içeren çözümler hazırlamak ve 4 tüpün her birinin içine uygun çözeltinin 3 μL 'ini dağıtılması.
    3. Her biri için 94 μL stop Buffer (2.1.1) ile 12 yeni Tüp hazırlayın.
    4. Her bir kapak reaksiyonu, TFııH ile tedavi edilen 87 μL veya etiketlenmemiş borular ile kaplama enzimini ekleyerek başlatın. Bir ısı bloğunda 30 °C ' de inküye yapın.
    5. 1, 2 veya 4 dk sonra, 94 μL stop tampon içeren tüplere her reaksiyon karışımı 30 μL aktararak reaksiyonları durdurun. Reaksiyon ürünlerini Bölüm 3 ' te açıklandığı gibi arındırın ve analiz edin.

3. RNA arıtma ve Analizi

  1. RNA 'yi arındırın
    1. Stop arabelleğindeki reaksiyon ürünlerini oda sıcaklığında 20 dakika boyunca kulyın.
      Not: Nokta duraklatma. Bu arabellekteki numuneler RNA 'nın kaybı veya bozulması olmadan 4 saate kadar korunur.
    2. 124 μL fenol ile bir kez ayıklayın: kloroform: isoamill alkol (25:24:1) ve bir kez kloroform: isoamill alkol (24:1).
      Dikkat: Phenol son derece toksik ve hızla cilt tarafından emilir. Uygun koruyucu ekipman giyin.
      Not: Ekstraksiyon sırasında RNA 'nın kurtarılmasını en üst düzeye çıkarmak için, sulu ve organik fazlar arasında istikrarlı bir bariyer oluşturan yüksek yoğunluklu jel içeren ticari olarak kullanılabilen tüpleri kullanın. Bkz. tartışma ve malzeme tablosu.
    3. 3 M sodyum asetat pH 5,2 12,4 μL içeren yeni tüpler için sulu faz (üst katman) aktarın.
  2. Etanol yağış
    1. 100% etanol 350 μL ekleyin ve inversion tarafından iyice karıştırın.
    2. Kuru buzda en az 10 dakika boyunca inküye yapın.
      Not: Nokta duraklatma. Kolaylık sağlamak için, biri burada durabilir ve ertesi gün prosedürü tamamlayın; Ancak, doğrudan adım 3,3 devam etmek ve aynı gün jel çalıştırmak mümkündür. RNA, daha fazla işlemden önce birkaç gün boyunca-80 °C ' de tutulabilir, ancak daha uzun süre bırakmayın.
  3. Jel elektroforezi için RNA örneklerinin hazırlanması
    1. Numunelerin çözülmesine izin verin, 2-3 kez ters çevirme ile karıştırın ve 21.000 x g, 4 °c ' de 15 dakika santrifüjte bir masa Santrifüjü. Bu arada, denatüre jel karışımı (Bölüm 3.4.1) ayarlayın.
    2. Dikkatle örneklerden rahatsız edici Pellet olmadan etanol kaldırın.
    3. 70% etanol 500 μL Ekle, Pelet yıkamak için birkaç kez tüp ters çevir, ve sonra yeniden Santrifüjü 21.000 x g 5 dakika ya oda sıcaklığında ya da 4 °c.
    4. Mümkün olduğunca çok etanol çıkarın ve bir masa üstü santrifüjte tüpler hızlı bir spin (5-10 s) yapmak. Daha sonra, bir jel yükleme ucu ile, etanol kalan son hacmi çıkarın.
    5. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca hava kuru Pelet.
    6. Her bir pelenin üstüne 4 μL H2O ekleyerek RNA 'nın çözülmesini sağlar. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe.
    7. Mix 'e 4 μL 2x RNA boya ( malzeme tablosunabakın) ekleyin ve sonra her tüpün tam olarak pelletini RNA 'ya birkaç saniye boyunca girdap yapın.
      Not: Iken düşük sıcaklıklarda çökelir çünkü üre yerine Formamid içeren RNA boya tavsiye edilir.
    8. Tüpleri hızlı Döndür ve sonra 70 °C ' de bir ısı bloğunda 10 dakika boyunca inküye edin.
    9. Jel üzerinde yük hazır olana kadar kuru buz üzerinde depolar tüpler.
      Not:       RNA 'nın kuru buzda tutulması, jel polimerizasyon sırasında diğer deneyler üzerinde çalışma esnekliği sağlar. Numunelerin çözülme sonrası yeniden ısıtılması gerekmez. Ancak, RNA jel çalışmaya hazır ise Isıtma sonra doğrudan yüklenebilir.
  4. Üre-sayfa jeli hazırlama
    1. 40 mL jel karışımı için, 50 mL konik tüpte birleştirin: 16,7 g Urea, 15 mL 40% bis: akrilamid çözeltisi (19:1 oranı), 4 mL 10X TBE (1 M Tris-HCl, 1 M sodyum borate, 20 mM EDTA) ve 8 mL H2O. Bu hacim 1,0 mm Spacers ile bir standart boy jel (18 cm yükseklik x 16 cm genişlik) için yeterlidir.
      Dikkat: Akrilamid son derece zehirlidir. Solüsyonda inhalasyon riski olmadığında, her zaman işleme sırasında laboratuvar ceket, eldiven ve güvenlik gözlükleri giyin.
      Not: Bu karışım bir denatüre% 15 Poliakrilamid jel döküm için, hangi kolayca RNA arasında giderir 15-50 NT. farklı uzunluklarda farklı RNA transkriptleri çözmek için gerekli bis/akrilamid konsantrasyonunu değiştirin.
    2. Üre tamamen çözülene kadar bir nutator üzerinde jel karışımı içeren kapalı tüp yerleştirin.
    3. Cam plakaları, 1 mm mesafe tutucular ve 15 kuyu tarak ile jel döküm istasyonu ayarlayın.
    4. Hızlı çalışma, Ekle 40 μL TEMED ve 400 μL% 10 amonyum Persülfat solüsyonu jel çözeltisi ve karışımı iyi. 25 mL pipet kullanarak, plakalar arasında jel çözeltisi dökün, tarak ve jel polimerize en az 2 h için izin verin.
      Not: Eğer jel kullanmadan önce 2 saat daha dökülür ise, bir kez o polimerize nemli kağıt havlu ile kapak (yerinde tarak bırakarak) ve plastik şal ile sarma kuruma önlemek için.
  5. Denaturing jel RNA elektroforezi
    1. Polimerizasyon sonrası jeli çalışan tankına aktarın ve 15-30 dk için 1x TBE 'de 20 mA 'da önceden çalıştırın.
    2. Bu arada, numune (dondurulmuş ise), Vortex ve 4 dk 2.000 x g, 4 °c ' de döndürün.
    3. Hazır olduğunda, güç kaynağını kapatın ve her iyi 1x TBE ile bir şırınga kullanarak dikkatlice durulayın.
    4. Numuneleri jel üzerine yüklemek için jel yükleme ipuçlarını kullanın.
    5. Yaklaşık 2 saat ya da alt boya (Xylene cyanol FF) kadar jel altına ulaşıncaya kadar bir sabit 20-30 mA jel çalıştırın.
  6. Jel çıkarın, bir parça emici kağıt üzerine yerleştirin ve plastik wrap ile sarın.
  7. Radyoaktif jel bir fosfora maruz.
  8. Phosphorımager kullanarak tarama fosforör ve görüntü analiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Rakamlar 2 ve 3 farklı kaynaklardan uzanan veya pol II genişleterek değişik uzunluklarda transkriptler içeren yapay uzama kompleksleri oluşturmak için kullanılan temsili sonuç reaksiyonları gösterir. Şekil 4 bu uzama kompleksleri, eş TRANSKRIPSIYON CTD phosphorylation bağımlı RNA kapatma tahlil için nasıl kullanılabilirler gösterir.

Şekil 2a

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

RNA işleme ve transkript uzaması düzenlemesi gibi pol II uzama kompleksine birleşen olayları incelemek isteyen çalışmalar, yüksek derecede arıtılmış bir enzim sisteminin kullanımı ile büyük ölçüde kolaylaştırılabilir. Bu tür enzim sistemlerini kurmak zor olabilir. Pol II tarafından organizöre bağımlı transkripsiyon en az beş genel transkripsiyon faktörü gerektirir. Bu faktörlerin hazırlanması ve stoklama ay sürebilir; Bu nedenle, bu süreçte oran sınırlayıcı adım genellikle sadece test tüpünde bazal transkripsiyon yeniden...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Biz meme kapatma enzim cDNA sağlayan S. Shuman teşekkür ederiz. Bu çalışma, büyük Kansas City Community Foundation 'da Helen Nelson Tıp Araştırma Fonu 'ndan yapılan Stowers Tıp Araştırmaları Enstitüsü 'ne hibe tarafından kısmen destekleniyordu.  Bu yazıda temel alınan orijinal veriler http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434 adresinde bulunan Stowers Original veri deposundan erişilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
[α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCiPerkin ElmerNEG007H001MCRNA'yı radyoetiketleme için
2x RNA yükleme boyasıNew England BiolabsB0363SŞiddetle tavsiye edilir. Jel yüklemesi sırasında RNA hazırlamak için
% 40 Bis: Akrilamid çözeltisiBiorad1610144
Sığır Serumu Albümini (20 mg / mL)New England BiolabsB9000S
Cdk7 / Siklin H / MAT1 (CAK kompleksi) Protein, aktif, 10 ve mikro; gMillipore Sigma14-476Pol II CTD
DNA oligonükleotidlerinifosforileSaflık özellikleri için Tablo 8'e bakın
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Life Technologies Invitrogen65001Dynabeads M-280 streptavidin de sorunsuz kullandık ancak MyOne Streptavidin boncuklarını tercih ediyoruz çünkü daha yavaş çökeliyorlar
GlycoBlue Kopreçökitan (15  mg / mL)Life Technologies InvitrogenAM9516Şiddetle tavsiye edilir. Nükleik asit pelet mavisi boyalar, reaksiyonların işlenmesini çok daha kolay hale getirir
Hoefer SE600 standart, 1 mm ara parçalı ve 15 kuyulu tarak çift soğutmalı dikey elektroforez sistemiHoeferSE600-15-1.5
MaXtract yüksek yoğunluklu tüpler (1.5 mL)Qiagen129046Şiddetle tavsiye edilir. Sulu ve organik fazlar arasında stabil bir bariyer oluşturan yüksek yoğunluklu bir jel içerir; ekstraksiyon sırasında RNA verimini artırır
Proteinaz K çözeltisi (20  mg/mL)Yaşam Teknolojileri Invitrogen25530049
RNA oligonükleotidleriTrilinkDaha fazla ayrıntı için Tablo 8'e bakın
Maya İnorganik Pirofosfataz (100 birim/mL)New England BiolabsNEBM2403SYalnızca kapatma reaksiyonları sırasında gereklidir
etmek için kullanılır IDT

Kaynaklar

  1. Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. RNA polymerase II transcription: structure and mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).
  2. Daube, S. S., von Hippel, P. H. Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes. Science. 258, 1320-1324 (1992).
  3. Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. S., Kashlev, M. The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex. Journal of Biological Chemistry. 275 (9), 6530-6536 (2000).
  4. Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (8), 831-833 (2012).
  5. Noe Gonzalez, M., Sato, S., Tomomori-Sato, C., Conaway, J. W., Conaway, R. C. CTD-dependent and -independent mechanisms govern co-transcriptional capping of Pol II transcripts. Nature Communications. 9 (1), 3392(2018).
  6. Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 2 (2), 277-298 (2011).
  7. Ramanathan, A., Robb, G. B., Chan, S. H. mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7511-7526 (2016).
  8. Ghosh, A., Lima, C. D. Enzymology of RNA cap synthesis. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 1 (1), 152-172 (2010).
  9. Moteki, S., Price, D. Functional coupling of capping and transcription of mRNA. Molecular Cell. 10, 599-609 (2002).
  10. Conaway, J. W., Conaway, R. C. An RNA polymerase II transcription factor shares functional properties with Escherichia coli sigma 70. Science. 248, 1550-1553 (1990).
  11. Wang, D., et al. Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution. Science. 324 (5931), 1203-1206 (2009).
  12. Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).
  13. Martinez-Rucobo, F. W., et al. Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping. Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).
  14. Mandal, S. S., et al. Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).
  15. Chiu, Y. L., et al. Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA. Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).
  16. Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF. Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).
  17. Vos, S. M., et al. Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6. Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).
  18. Kujirai, T., et al. Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage. Science. 362 (6414), 595-598 (2018).
  19. Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Elongasyon KompleksiKo-transkripsiyonel Keplere eklemeYapay Transkripsiyon BaloncuklarıManyetik Boncuk İmmobilizasyonuDNA-RNA DupleksiTFIIH FosforilasyonuKeplere ekleme Enzim AnaliziDenatüre Poliakrilamid JelRadyoetiketli Transkript Analizi
Diseksiyon eş transkripsiyon RNA Işleme etkinlikleri için suni RNA polimeraz II uzama kompleksler
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.