Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Hücre Kültüründe ve Drosophila melanogaster'de Çinko Oksit Nano partiküllerinin Toksisite Çalışması

10.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/59510

⸱

19 Eylül 2019

 ,  ,  ,  , 
1NUS Environmental Research Institute & Department of Anatomy, National University of Singapore, 2NUS Environmental Research Institute & School of Public Health, National University of Singapore, 3Department of Civil and Environmental Engineering, National University of Singapore, 4Department of Anatomy, National University of Singapore

Bu makalede

Özet

Biz çinko oksit nano tanecikleri toksikolojik profilleri değerlendirmek için ayrıntılı bir protokol tarif (ZnO NPs) özellikle, insan MRC5 akciğer fibroblastları hücre ölümü türü ve meyve sinek DrosophilaROS oluşumu .

Özet

Çinko oksit nano tanecikleri (ZnO NPs) uygulamaları geniş bir yelpazede var, ancak ZnO NP ilişkili toksisite rapor sayısı son yıllarda hızla artmıştır. Ancak, ZnO NP kaynaklı toksisite için altta yatan mekanizmaları açıklığa kavuşturan çalışmalar yetersizdir. Hem in vitro hem de in vivo deneysel modelleri kullanarak ZnO NP'lerin toksisite profillerini belirledik. ZnO NP'ye maruz kalan MRC5 akciğer fibroblastlarında hücre canlılığında önemli bir azalma gözlendi ve ZnO NP'lerin sitotoksik etkiler uyguladığı nı gösterdi. Benzer şekilde, ilginç, Bağırsak ZnO NPs maruz meyve sinek Drosophilareaktif oksijen türleri düzeylerinde dramatik bir artış sergiledi (ROS). ZnO NP'lerinin tüketiciler tarafından artan kullanımı için bir risk değerlendirmesi oluşturmak için daha derinlemesine çalışmalar agereklidir.

Giriş

Nanoteknoloji tıp, malzeme bilimi ve biyokimya da dahil olmak üzere tüm bilimsel alanlarda kullanılan nanoboyutlu malzemelerin uygulanması anlamına gelir. Örneğin, ultraviyole saçılma, kimyasal algılama ve anti-mikrobiyal özellikleri nin yanı sıra yüksek elektriksel iletkenlikleriyle bilinen ZnO NP'leri, gıda ambalajı, kozmetik, kozmetik, tekstil, kauçuk, pil, otomobil kuyruk gazı tedavisi için katalizör ve biyomedikal ile ilgili uygulamalar1,2,3.

Ancak, ZnO NP tabanlı ürünlerin gelişen uygulamaları, ZnO NPs artan insan maruziyetine yol açan, insan sağlığı üzerindeki potansiyel olumsuz etkileri hakkında endişeler emdi. In vitro hücresel çalışmaların bir dizi ZnO NPs oksidatif stres, otofaji ile ilgili sitotoksisite, inflamasyon ve genotoksisite4,5,6,7,8 neden olabileceğini göstermiştir . Özellikle, ZnO NPs toksisitesi Zn serbest Zn2 + iyonları için çözülmesi, hem de ZnO yüzey reaktivitesi, bozulmuş iyonik homeostaz ve bir bağlı hücresel iyonik ve metabolik dengesizlikler sonuçlanan neden olduğu varsayılır iyon taşıma nın inhibisyonu4,7,9,10. Daha da önemlisi, çalışmalar reaktif oksijen türlerinin (ROS) neslinin ZnO NP'lerle ilişkili toksisitenin altında yatan birincil mekanizmalardan biri olduğunu göstermiştir. ROS hakareti sonrası yetersiz anti-oksidatif aktivitesi sitotoksisite ve DNA hasarı nın ortaya çıkarılmasından sorumlu olduğu gösterilmiştir9. ZnO NPs toksik etkileri de hayvan modellerinde bildirilmiştir, kemirgen dahil1, zebra balığı11,12, yanı sıra omurgasız Drosophila13.

Drosophila kimyasal varlıklar ve nanomalzemeler (NMs)14,15toksisite tarama için iyi kurulmuş bir alternatif hayvan modeli olarak hizmet vermektedir. Daha da önemlisi, Insan ve Drosophila arasında, NM gibi çevresel kirleticilere verilen biyolojik tepkilerin değerlendirilmesi nde drosophila'nın in vivo model olarak kullanılmasını haklı gösteren yüksek düzeyde genetik ve fizyolojik benzerlik vardır. 16. Ayrıca, drosophila kullanarak küçük boyutu, kısa ömrü, genetik amenability ve kolay ve uygun maliyetli bakım nedeniyle birçok avantajı vardır. Dahası, Drosophila genetik, moleküler ve gelişimsel biyoloji çalışmaları için yaygın olarak benimsenmiştir, çünkü tam genomu yıllar önce 2000 yılında tam olarak sıralanmıştır, bu nedenle çeşitli yüksek iş gücü taraması için uygundur. ve çözülmemiş biyolojik sorular la mücadele için17,18,19,20,21. Son yıllarda, Drosophila NPs farklı türleri kullanılarak immüntoksisite ile ilgili çalışmaların bir dizibildirilmiştir 15,22,23,24. Drosophila kullanarak çalışmalardan elde edilen bu temel yeni bilgi nanotoksikoloji anlayışımız hakkında daha fazla bilgi sağlamak için yardımcı olmuştur.

ROS, özellikle metal bazlı NPs25,NPs neden sitotoksisite ve genotoksisite için iyi bilinen bir suçludur. ROS moleküler oksijenden daha yüksek reaktif özelliklere sahip oksijen içeren kimyasal türlerdir. Süperoksit radikal (O 2-) ve hatta hidrojen peroksit (H2O2)gibi radikal olmayan moleküller ROS olarak hareket edebilir. Normal fizyolojik durum altında, onlar hücresel homeostaz korumak için gereklidir26, Ancak, aşırı ROS aşırı üretim veya antioksidan savunma sisteminin disregülasyonu nedeniyle oksidatif strese neden olabilir, proteinlere zarar yol açan, lipidler ve deoksiribonükleik asit (DNA)27. Örneğin, ROS düzeyleri arttıkça ve glutatyon (GSH) düzeyi eşlik eden azalır, adenozin trifosfat bozulması (ATP) sentezi gerçekleşir ve laktat dehidrogenaz (LDH) düzeyi orta artar, hücre ölümü ile sonuçlanan27.

Burada, ZnO NPs'nin potansiyel yan etkilerini belirlemek için kültürlü memeli hücreleri ve Drosophila kullanarak hücresel ve genetik analizler yapmak için protokoller salıyoruz. ZnO NPs toksisite çalışması için kullanılan yöntemin genel bir bakış Şekil 1gösterilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) Yaşanmış/Sabit hücreler üzerinde analiz

  1. Sonicate ZnO NPs süspansiyon içinde 15 dakika.
  2. Kültürlü hücrelerin tedavisi için 1 mg/mL ZnO NP stok çözeltisi kullanarak Çeşitli konsantrasyonlarda (örneğin, 0, 0, 10, 25, 50,100 ve 200 μg/mL) ZnO NP'leri hazırlayın.
  3. Tohum MRC5 insan akciğer fibroblastları (1 x 105 hücre / iyi) bir 6-iyi kültür plaka üzerine bir gün önceden, ve sonra 8 saat, 16 saat ve 24 saat znO NPs 2 mL (üç aylık) ile hücreleri tedavi.
  4. Her zaman noktasında, 5 dakika için 300 x g santrifüj ederek hücreleri toplamak.
  5. Hücre peletlerini iki kez fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
  6. 0,1 M HEPES/sodyum hidroksit (NaOH), 1,4 M sodyum klorür (NaCl) ve 25 m kalsiyum klorür (CaCl2)oluşan 1x bağlayıcı tampon ile hücreleri 100 μL başına 1 x 105 hücre konsantrasyonu ile askıya alın.
  7. 5 μL Floresan isotiyoyanat (FITC) Annexin V lekesi ve 5 μL propidium iyodür (PI) DNA lekesi ekleyin ve hücreleri 15 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT; 25 °C) karanlıkta kuluçkaya yatırın.
  8. Hücreleri akış sitometrisine göre sıralamadan önce numuneleri 400 μL'lik 1x bağlama tamponu ile toplayın. Her örnek için en az 10.000 hücre analiz edilir.
  9. Elde edilen ortanca yoğunluğu kullanarak çubuk grafiği tabloya alın.

2. Drosophila ZnO NPs maruz kalma

  1. Şişelere farklı konsantrasyonlarda 1 mL nano partikül ler ekleyin, ardından 9 mL sinek gıdası 0.1 mg/mL, 0.25 mg/mL veya 0.5 mg/mL ZnO NP'lik son konsantrasyonu yapın.
  2. Pipet kullanarak şişelerde iyice gıda ile nano tanecikleri karıştırın.
  3. Kullanmadan önce En az 2-3 saat soğuması için ZnO NPs içeren sinek gıda izin verin.
  4. Yetişkin erkek ve dişi 5 gün boyunca şişeler içine sinekler tanıtmak ve onları çiftleşmek ve yumurtlamak için izin (beyaz noktalar olarak görünür) gıda yüzeyinde.
  5. Ebeveyn sinekleri çıkarın ve yumurta 4 farklı gelişim aşamalarında (embriyonik, larva, pupal ve yetişkin aşaması) oluşur daha fazla gelişme geçmesine izin.

3. Sinek Diseksiyonu

  1. Analizler için şişelerin duvarından3. Taze yumurtlu yumurtalar normalde RT'de 72-120 saat sonra3'ün sonlarında instar larvalarına dönüşür.
  2. Diseksiyon kabını temizleyin ve kuyuyu diseksiyon ortamı/PBS ile doldurun.
  3. Bir çift forceps kullanarak larvaları (3inç'in sonlarında) stereomikroskop altında inceleyin.
  4. Küçük bir delik yapmak ve larvalar için manikür tabakası açık kırmak için forceps ucu kullanın. Dikkatle bağırsak çekin ve Schneider'ın Drosophila orta içeren bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüp içine yerleştirin, sabitleme adımı önce 1 mL kullanarak 4% paraformaldehit (PF).
  5. 3.5 Immunostaining gibi sonraki deneyler için, RT'de 10 dakika boyunca PF'deki bağırsağı sabitle.

4. Dihidroethidyum (DHE) Boyama Kullanarak ROS Algılama

  1. Adım 2.1'de açıklandığı gibi larvaları çeşitli ZnO NPs konsantrasyonlarıyla tedavi edin.
  2. Bölüm 3'te açıklandığı gibi3.instar larvasından bağırsak diseksiyonu yapıldıktan sonra, doku boyama işlemi yapılmadan önce SCHNEIDER'ın Drosophila ortamında bağırsakları RT'de kuluçkaya yatırın. Schneider'ın orta 1 mL'sinde 1 μL DHE boyasını (30 mM'lik stok konsantrasyonundan) eritin ve 10-30 μM DHE boyası üzerinde son çalışma konsantrasyonu elde edin.
  3. Karanlıkta RT'de 5 dakika boyunca bağırsağı kuluçkaya yatırın ve her 5 dakika schneider'ın orta sını kullanarak üç kez yıkayın.
  4. % 4 PF (isteğe bağlı adım) ile bağırsak düzeltmek ve cam slaytlar üzerine bağırsak monte, anti-fade montaj ortamı içeren 4′, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI). Konfokal mikroskop altında görüntüleri yakalayın.

5. ImageJ Yazılımını Kullanarak Floresan Ölçme

  1. Floresan mikroskobu veya konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak elde edilen yakalanan floresan görüntülerini ImageJ yazılımına aktarın.
  2. Analiz menüsüne tıklayın ve ölçümleri ayarla'yıseçin.
  3. Alan tümleşik yoğunluğu ve ortalama gri değeri gibi çıktı ölçüsünü seçin.
  4. Ölçü'yetıklayın.
  5. Arka planı ayarlamak için floresan olmayan bir bölge seçin.
  6. Verileri Excel elektronik tablosuna aktarın ve aşağıda gösterildiği gibi hesaplamayı kullanarak düzeltilmiş toplam hücre floresansını (CTCF) belirleyin.
    CTCF = Entegre Yoğunluk - (Seçilen hücrenin alanı X Arka plan okumalarının ortalama floresansı)
  7. Bir çubuk grafik oluşturve istatistiksel analiz gerçekleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

NP'ye maruz kalan hücreler hücre boyama reaktif kiti ile işlendi, ardından akış sitometrisi kullanılarak hücre sıralaması yapıldı. ZnO NP ile tedavi edilen hücreler (alt, sağ panel) kontrol hücrelerine (R5, alt, sol panel) göre erken (R3)/ geç apoptotik hücreler (R6) daha yüksek bir yüzdesi sergiler. Nekrotik hücre ölümü R4 (üst, sağ panel) ile gösterilir (Şekil 2). ZnO NP ile tedavi edilen MRC-5 fibroblastlar üzerinde FITC/Annexin V TahtSonuçları

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

ZnO NP'nin MRC5 fibroblastlarında apoptozisi tetikleyip tetiklemeyebileceğini değerlendirmek için hücreleri nekrotik veya apoptotik hücre ölümlerinden ayırt etmek için akış sitometrisini kullanırız. Normal canlı hücrelerde, fosfatidilserin (PS) hücre zarında lokalize. Apopoz oluşursa, PS plazma membranın hücre dışı broşüre geçirilir, floresan ile etiketlenmiş Annexin V bağlanmasını sağlayan (FITC Annexin V)29. Öte yandan, kırmızı floresan propidium iyodür (PI), bir nükleik asit bağlayıcı boya, can...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.

Teşekkürler

Çalışma, R706-000-043-490 hibe numarası ile desteklenmiştir. Çalışma hibe sponsorunun görüşünü temsil etmez.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Kanton-S
Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%15 Metil 4-HidroksibenzoatSigma Aldrich
%4 ParaformaldehitSigma AldrichP6148
Bacto AgarBD biosciences
cncCK6/TM3, SbDr. Kerppola T'den bir hediye
Mısır unu, glikoz, maya bira üreticisiSigma Aldrich
CyAn ADP ile Zirve YazılımıDAKOhttps://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf
Dihidroetidyum (Hidroetidin)Thermo Fisher ScientificD11347
FITC Annexin V Apoptoz Tespit Kiti IBD biyolojik bilimler556547
Floresan mikroskopOlympus
GlukolinSüpermarket
ImageJ yazılımıNIH
MRC5 insan akciğeri fibroblastATCCCCL-171
Schneider' s Drosophila ortaThermo Fisher Scientific21720-024
Vector LaboratoriesH-1200ile Vectashield antifade montaj ortamı
; Sod2N308/CyONIG-FLY
Çinko Oksit NanopartiküllerSigma Aldrich721077Sayfa 2'ye bakın
DAPI Vahşi tip

Kaynaklar

  1. Kim, Y. R., et al. Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats. International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).
  2. Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni. Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).
  3. Colvin, V. L. The potential environmental impact of engineered nanomaterials. Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).
  4. De Angelis, I., et al. Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells. Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).
  5. Johnson, B. M., et al. Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death. Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).
  6. Singh, N., et al. NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials. Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).
  7. Song, W., et al. Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles. Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).
  8. Wahab, R., et al. ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).
  9. Namvar, F., et al. Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).
  10. Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).
  11. Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio). Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).
  12. Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
  13. Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model. Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).
  14. Rand, M. D. Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicology and Teratology. 32, 74-83 (2010).
  15. Ong, C., Yung, L. Y., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity. Nanotoxicology. 9, 396-403 (2015).
  16. Hoffmann, J. A., Reichhart, J. M. Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective. Nature Immunology. 3, 121-126 (2002).
  17. Hughes, T. T., et al. Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses. Virology. 423, 1-5 (2012).
  18. Jennings, B. H. Drosophila - a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14, 190-195 (2011).
  19. Adams, M. D., Sekelsky, J. J. From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3, 189-198 (2002).
  20. Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287, 2185-2195 (2000).
  21. Ong, C., et al. Silver nanoparticles disrupt germline stem cell maintenance in the Drosophila testis. Scientific Reports. 6, (2016).
  22. Alaraby, M., Demir, E., Hernandez, A., Marcos, R. Assessing potential harmful effects of CdSe quantum dots by using Drosophila melanogaster as in vivo model. Science of the Total Environment. 530-531, 66-75 (2015).
  23. Barik, B. K., Mishra, M. Nanoparticles as a potential teratogen: a lesson learnt from fruit fly. Nanotoxicology. , 1-27 (2018).
  24. Jovanovic, B., et al. The effects of a human food additive, titanium dioxide nanoparticles E171, on Drosophila melanogaster - a 20 generation dietary exposure experiment. Scientific Reports. 8, (2018).
  25. Cao, Y. The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).
  26. Akhtar, M. J., Ahamed, M., Alhadlaq, H. A., Alshamsan, A. Mechanism of ROS scavenging and antioxidant signalling by redox metallic and fullerene nanomaterials: Potential implications in ROS associated degenerative disorders. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1861, 802-813 (2017).
  27. Akter, M., et al. A systematic review on silver nanoparticles-induced cytotoxicity: Physicochemical properties and perspectives. Journal of Advanced Research. 9, 1-16 (2018).
  28. Vecchio, G. A fruit fly in the nanoworld: once again Drosophila contributes to environment and human health. Nanotoxicology. 9, 135-137 (2015).
  29. Marino, G., Kroemer, G. Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure. Cell Research. 23, 1247-1248 (2013).
  30. Stoddart, M. J. Cell Viability Assays: Introduction. Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , Chapter 1 (2011).
  31. Yazdani, M. Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro. Toxicology in Vitro. 30, 578-582 (2015).
  32. Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. Analysis of kinetics of dihydroethidium fluorescence with superoxide using xanthine oxidase and hypoxanthine assay. Annals of Biomedical Engineering. 41, 327-337 (2013).
  33. Hartig, S. M. Basic image analysis and manipulation in ImageJ. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14, Unit14.15 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Hücre CanlılığıReaktif Oksijen TürleriAkış SitometrisiFloresan MikroskobuKonfokal MikroskopiMRC5 Akciğer FibroblastlarıBağırsak AnaliziAnnexin V Boyama
Hücre Kültüründe ve Drosophila melanogaster'de Çinko Oksit Nano partiküllerinin Toksisite Çalışması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.