Membran fosfolipidler içine bakteriyel patojen yağ asidi kuruluş çalışması için tavuk yumurtası sarısı lipoprotein parçacıklarının yalıtım

Phillip  C. Delekta; Todd  A. Lydic; Neal D. Hammer

doi:10.3791/59538

Yöntem makalesi

Membran fosfolipidler içine bakteriyel patojen yağ asidi kuruluş çalışması için tavuk yumurtası sarısı lipoprotein parçacıklarının yalıtım

DOI:

10.3791/59538

⸱

15 Mayıs 2019

Phillip C. Delekta¹ , Todd A. Lydic² , Neal D. Hammer¹

¹Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University, ²Department of Physiology, Michigan State University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntem, özellikle Staphylococcus aureusgibi kompleks ana kaynaklardan gelen eksojen yağ asitleri dahil etmek için bir çerçeve sağlar. Bunu başarmak için, tavuk yumurtası sarısı ve kütle spektrometresi kullanan bakteriyel fosfolipidlerin sonraki yağ asidi profillerinden lipoprotein parçacıklarının zenginleşmesi için protokoller açıklanmıştır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Staphylococcus aureus ve diğer gram-pozitif patojenler, çevreye gelen yağ asitleri membranlı fosfolipidlere dahil ederler. Enfeksiyon sırasında, eksojen yağ asitleri çoğunluğu ana lipoprotein parçacıkları içinde mevcut. Belirsizlik, ana yağ asitleri rezervuarında ve bakterilerin lipoprotein parçacıklarından yağ asitleri özü olan mekanizmalar olarak kalır. Bu çalışmanın içinde, tavuk yumurtası sarısı ile düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) parçacıklarının zenginleşmesi ve LDL 'Lerin S. aureusiçin yağ asidi rezervuarları olarak hizmet edip etmediğini belirlemek için protokoller açıklanmaktadır. Bu yöntem, tarafsız lipidomik analiz ve tavuk Ldıs, Ldıs ve bakteriler arasındaki etkileşimlerin keşfi için etkili ve ekonomik bir model istismar. LDL 'lerden eksojen yağ asitleri S. aureus entegrasyonu Analizi yüksek çözünürlüklü/doğru kütle spektrometresi ve tandem kütle spektrometresi kullanılarak gerçekleştirilir, bakteriyel yağ asidi bileşiminin karakterizasyonu sağlayan membran ve Ldıs maruz kaldıktan sonra bakteriyel membran lipidlerde ortaya çıkan yağ asitleri yeni kombinasyonları tarafsız tanımlaması. Bu gelişmiş kütle spektrometresi teknikleri, fosfolipidlere dahil edilen özel eksojen yağ asitlerini açığa çıkararak yağ asidi birleştirmesi için eşsiz bir perspektif sunar. Burada özetlenen Yöntemler diğer bakteriyel patojenlerin incelenmesi ve karmaşık yağ asitleri alternatif kaynaklarının uyarlanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metikiline dayanıklı S. aureus (MRSA) sağlık bağlantılı enfeksiyonun önde gelen nedenidir ve ilişkili antibiyotik direnci önemli bir klinik zorluk¹^,²^,³. Bu nedenle, yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesi yüksek önceliktir. Gram-pozitif patojenler için umut verici bir tedavi stratejisi yağ asidi sentezini inhibe ediyor, S. aureus'ta fosfatidilgliserin (PG), lysyl-PG ve kardiyolipin⁴içeren membran fosfolipid üretiminin bir gereksinimi. Bakterilerde, yağ asidi üretimi yağ asidi sentezi II yolu (fasii)⁵ile ger....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: tavuk yumurtası sarısı gelen LDL partiküllerin zenginleştirme için aşağıdaki protokol Moussa ve al. 2002³³.

1. LDL parçacıklarının zenginleşmesi için tavuk yumurtası sarısı hazırlanması

70% etanol çözeltisi ile kabukları yıkayarak iki büyük tavuk yumurtası sanitize ve kuru hava sağlar.
% 70 etanol çözeltisi kullanarak yumurta ayırıcı sanitize ve kuru hava sağlar. Yumurta ayırıcı orta ölçekli bir Beaker dudak üzerine takın.
Her yumurtayı tek başına yumurta ayırıcı içine çatlak ve albümin Beaker içine akmasına izin. Bozulmamış yumurta sarısı ayırıcı tarafından korunacaktır.
....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tavuk yumurtası sarısı tarafından LDL zenginleştirme Protokolü Şekil 1' de gösterilmiştir. Bu işlem, tüm yumurta sarısı ile tuz seyreltilerek başlar ve yumurta sarısı katıları ayrıştırmadan veya plazma kesir Ldıs içeren granül olarak adlandırılan ayıran (Şekil 1)³³. Plazma fraksiyonu LDL içeriği daha fazla yağış ile zenginleştirilmiştir ~ 30-40 kDa β-livetins (Şekil 2)

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S. aureus membran fosfolipidlerin içine eksojen yağ asitleri birleştirir²⁷^,³²^,⁴³. Eksojen yağ asitleri kullanarak fosfolipid sentezi fasii inhibisyonu atlar ama aynı zamanda membranın Biyofizik özelliklerini değiştirir²⁷^,³²^,⁴⁴. Gram-pozitif patojenlerin fosfolipidlerine eksojen yağ asitleri eklenmesi iyi belgelenmiş olmakla ber.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklamaları yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz bu işin el yazması ve destek kritik değerlendirme için Hammer laboratuar üyelerine teşekkür ederiz. Dr Alex Horswill üniversite Colorado Okulu tıp nazik AH1263 sağladı. Dr. Chris Waters laboratuar Michigan State Üniversitesi reaktifler sağladı. Bu çalışma Amerikan Kalp Derneği Grant 16, 30170026 ve başlangıç fonları Michigan State Üniversitesi tarafından sağlanan tarafından desteklenmektedir.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Amonyum sülfat	Fisher	BP212R-1	& ge; % 99,5 saf
Hücre kültürü inkübatörü	Thermo	MaxQ 6000
Centrafuge	Thermo	75-217-420	Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE
Costar test plakası	Corning	3788	96 kuyu
Filtre kağıdı	Schleicher & Schuell	597
Büyük tavuk yumurtası	N/A	N/A	Ortak mağaza satın alınan yumurta
Mikroplaka spektrofotometre	BioTek	Epoch 2
NaCl	Sigma	S9625
S. aureus suşu AH1263	N/A	N/A Colorado	Üniversitesi'nden Alex Horswill tarafından sağlanmıştır
Diyaliz tüpü	Pierce	68700	7,000 MWCO
Tripon	Becton, Dickison and Company	211705
0,5 mm zirkonyum oksit boncuklar	Sonraki İlerleme	ZROB05
Mermi Blender	Sonraki İlerleme	BBX24B
Metanol (LC-MS sınıfı)	Fisher	A4561
Kloroform (reaktif sınıfı)	Fisher	MCX10559
İzopropanol (LC-MS sınıfı)	Fisher	A4611
Dimyristoyl fosfatidilkolin	Avanti Polar Lipidler	850345C-25mg
Amonyum bikarbonat	Sigma	9830	≥ % 99,5 saf
Amonyum format	Sigma	70221-25G-F
Xcalibur yazılımı	Thermo Scientific	OPTON-30801
LTQ-Orbitrap Velos kütle spektrometresi	Thermo Scientific		yüksek çözünürlüklü/doğru kütle MS
Agilent 1260 kılcal HPLC	Agilent
SpeedVac Vakum Konsantratörleri	Thermo Scientific

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Noskin, G. A., et al. National trends in Staphylococcus aureus infection rates: impact on economic burden and mortality over a 6-year period (1998-2003). Clinical Infectious Diseases. 45 (9), 1132-1140 (2007).
Noskin, G. A., et al.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

LDL zolasyonu Staphylococcus aureus K tle Spektrometrisi Lipidomik Analiz Amonyum S lfat Presipitasyonu Diyaliz Membran Ak Enjeksiyonu

Membran fosfolipidler içine bakteriyel patojen yağ asidi kuruluş çalışması için tavuk yumurtası sarısı lipoprotein parçacıklarının yalıtım

Bu makalede

Özet

Özet

Giriş

Protokol

Sonuçlar

Tartışma

Açıklamalar

Teşekkürler

Malzemeler

Kaynaklar

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İlgili makaleler