Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Membran fosfolipidler içine bakteriyel patojen yağ asidi kuruluş çalışması için tavuk yumurtası sarısı lipoprotein parçacıklarının yalıtım

9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/59538

⸱

15 Mayıs 2019

 ,  , 
1Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University, 2Department of Physiology, Michigan State University

Bu makalede

Özet

Bu yöntem, özellikle Staphylococcus aureusgibi kompleks ana kaynaklardan gelen eksojen yağ asitleri dahil etmek için bir çerçeve sağlar. Bunu başarmak için, tavuk yumurtası sarısı ve kütle spektrometresi kullanan bakteriyel fosfolipidlerin sonraki yağ asidi profillerinden lipoprotein parçacıklarının zenginleşmesi için protokoller açıklanmıştır.

Özet

Staphylococcus aureus ve diğer gram-pozitif patojenler, çevreye gelen yağ asitleri membranlı fosfolipidlere dahil ederler. Enfeksiyon sırasında, eksojen yağ asitleri çoğunluğu ana lipoprotein parçacıkları içinde mevcut. Belirsizlik, ana yağ asitleri rezervuarında ve bakterilerin lipoprotein parçacıklarından yağ asitleri özü olan mekanizmalar olarak kalır. Bu çalışmanın içinde, tavuk yumurtası sarısı ile düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) parçacıklarının zenginleşmesi ve LDL 'Lerin S. aureusiçin yağ asidi rezervuarları olarak hizmet edip etmediğini belirlemek için protokoller açıklanmaktadır. Bu yöntem, tarafsız lipidomik analiz ve tavuk Ldıs, Ldıs ve bakteriler arasındaki etkileşimlerin keşfi için etkili ve ekonomik bir model istismar. LDL 'lerden eksojen yağ asitleri S. aureus entegrasyonu Analizi yüksek çözünürlüklü/doğru kütle spektrometresi ve tandem kütle spektrometresi kullanılarak gerçekleştirilir, bakteriyel yağ asidi bileşiminin karakterizasyonu sağlayan membran ve Ldıs maruz kaldıktan sonra bakteriyel membran lipidlerde ortaya çıkan yağ asitleri yeni kombinasyonları tarafsız tanımlaması. Bu gelişmiş kütle spektrometresi teknikleri, fosfolipidlere dahil edilen özel eksojen yağ asitlerini açığa çıkararak yağ asidi birleştirmesi için eşsiz bir perspektif sunar. Burada özetlenen Yöntemler diğer bakteriyel patojenlerin incelenmesi ve karmaşık yağ asitleri alternatif kaynaklarının uyarlanabilir.

Giriş

Metikiline dayanıklı S. aureus (MRSA) sağlık bağlantılı enfeksiyonun önde gelen nedenidir ve ilişkili antibiyotik direnci önemli bir klinik zorluk1,2,3. Bu nedenle, yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesi yüksek önceliktir. Gram-pozitif patojenler için umut verici bir tedavi stratejisi yağ asidi sentezini inhibe ediyor, S. aureus'ta fosfatidilgliserin (PG), lysyl-PG ve kardiyolipin4içeren membran fosfolipid üretiminin bir gereksinimi. Bakterilerde, yağ asidi üretimi yağ asidi sentezi II yolu (fasii)5ile gerçekleşir, bu da ökaryotik mevkidaşı 'ndan önemli ölçüde farklıdır, antibiyotik gelişimi için fasii 'ye cazip bir hedef haline gelir5,6 . FASıı inhibitörleri öncelikle FabI hedef, yağ asidi karbon zincir uzaması için gerekli bir enzim7. Fabi inhibitörü triklosan, tüketici ve tıbbi malların8,9' da geniş çapta kullanılmaktadır. Ek Fabi inhibitörleri S. aureus enfeksiyonu tedavisi için çeşitli ilaç şirketleri tarafından geliştirilmiştir10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26. Ancak, S. aureusdahil olmak üzere birçok gram-pozitif patojenler, fosfolipid sentezi için eksojen yağ asitleri atma yeteneğine sahiptir, fasii inhibisyonu bypass27,28,29. Bu nedenle, fasii inhibitörlerinin klinik potansiyeli, ana yağ asitleri kaynaklarının bilgilerimizde önemli boşluklar ve patojenler,27,28ana gelen yağ asitleri ayıklamak mekanizmaları nedeniyle tartışılır. Bu boşlukları ele almak için, lipoprotein parçacıklarından S. aureusmembran fosfolipidlerine kadar eksojen yağ asidin birleştirildiğini izlemek için tarafsız bir lipidomik analiz yöntemi geliştirdik.

Sepsis sırasında, ana yağ asitleri çoğunluğu parçacıklar30ile ilişkili olarak ev sahibi lipoprotein parçacıkları damar içinde ev sahibi türetilmiş yağ asitleri potansiyel bir kaynak temsil eder. Lipoproteinler, trigliserid ve kolesterol esterlerinin hidrofobik çekirdeğini kapsayan fosfolipidler ve proteinlerden oluşan hidrofilik bir kabuk oluşur31. Lipoproteinleri dört ana sınıfları--chylomicron, çok düşük yoğunluklu lipoprotein, yüksek yoğunluklu lipoprotein, ve düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL)-, lipid taşıma araçları olarak ev sahibi ve fonksiyon tarafından üretilen yağ asitleri ve kolesterol teslim ve hücreleri damar üzerinden barındırabilir. LDLs trigliserid ve kolesterol esterleri de dahil olmak üzere esterleşmiş yağ asidi bol31. Daha önce son derece saflaştırılmış insan Ldıs PG sentezi için eksojen yağ asitleri uygun bir kaynak olduğunu göstermiştir, böylece FASıı inhibitörü bypass32için bir mekanizma sağlar. İnsan LDL 'Leri arındırmak, teknik olarak zorlu ve zaman alıcı olabilir, çünkü saflaştırılmış insan LDL 'lerin ticari kaynakları rutin olarak kullanmak veya büyük ölçekli bakteriyel ekranlar gerçekleştirmek için yasak şekilde pahalıdır. Bu sınırlamaları gidermek için, biz tavuk yumurta sarısı, lipoprotein parçacıkları33zengin bir kaynak ldls zenginleştirme için bir prosedür değiştirildi. İnsan LDL türevi yağ asitlerinin S. aureus32membranı içine eklenmesi için hedefsiz, yüksek çözünürlüklü/doğru kütle spektrometresi ve tandem kütle spektrometresi başarıyla kullandık. Daha önce bildirilen yöntemlerden farklı olarak, bu yaklaşım üç büyük stafilokok fosfolipid türünün her biri için bireysel yağ asidi izomerleri ölçebilir. Oleik asit (18:1) S. aureus fosfolipidler29,30,32içine kolayca dahil tüm ev sahibi lipoprotein parçacıkları içinde mevcut doymamış bir yağ asidi. S. aureus oleik asit sentezi29yeteneğine sahip değildir; Bu nedenle, fosfolipid-Incorporated oleik asit miktarı stafilokok membran içinde Host lipoprotein türetilmiş yağ asitleri varlığı kurar29. Bu fosfolipid türler, burada açıklanan State-of-the-art kitle spektrometresi yöntemi ile tespit edilebilir, bir yağ asidi kaynağının varlığında S. aureus küllik eşsiz çözünürlüğü sunan büyük olasılıkla enfeksiyon sırasında karşılaşır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Not: tavuk yumurtası sarısı gelen LDL partiküllerin zenginleştirme için aşağıdaki protokol Moussa ve al. 200233.

1. LDL parçacıklarının zenginleşmesi için tavuk yumurtası sarısı hazırlanması

  1. 70% etanol çözeltisi ile kabukları yıkayarak iki büyük tavuk yumurtası sanitize ve kuru hava sağlar.
  2. % 70 etanol çözeltisi kullanarak yumurta ayırıcı sanitize ve kuru hava sağlar. Yumurta ayırıcı orta ölçekli bir Beaker dudak üzerine takın.
  3. Her yumurtayı tek başına yumurta ayırıcı içine çatlak ve albümin Beaker içine akmasına izin. Bozulmamış yumurta sarısı ayırıcı tarafından korunacaktır.
  4. Kalıntı Albumen kaldırmak için 30 mL steril fosfat-tamponlu tuz (PBS) ile yumurta sarısı iki kez yıkayın.
  5. Yumurta sarısı hafifçe filtre kağıdı üzerine yerleştirin.
  6. Vitellus membranı steril bir pipet ucu ile delin ve membran içeriğini steril 50 ml konik Santrifüjlü tüpüne boşaltın. Membranı ve filtre kağıdını atın.

2. tavuk yumurtası sarısı gelen LDL içeren plazma fraksiyonlama

  1. Yaklaşık iki hacim ekleyin 0,17 M NaCl pH 7,0 için yumurta sarısı ve karıştırma şiddetle. Daha sonra 60 dk için 4 °C ' de bu çözümü karıştırın.
  2. Yumurta sarısı seyreltme 10 °C de 10.000 x g 45 dk. plazma fraksiyonu (supernatant) granüler fraksiyondan (Pelet) steril bir 50 ml konik tüpüne çıkarın.
  3. 2,2 adımı yineleyin.

3. LDL partiküllerinin plazma yalıtımı

  1. Plazma fraksiyonu 60 dk için 4 °C ' de% 40 amonyum sülfat (w/v) ile karıştırın.
  2. 8,7 için 420 mM NaOH çözeltisi ile plazma fraksiyonu pH ayarlayın.
  3. Yumurta sarısı seyreltmesini 4 °c ' de 10.000 x g 'de 45 dakika süreyle santrifüjün. üst yarı sert sarı kesir 7 kDa gözenek boyutu Dializ boru içine çıkarın. Şişmesine izin vermek için tüpte Oda sağlayın.
  4. Dialyze gece 4 °c içinde 3 L ultra saf su amonyum sülfat kaldırmak için. Hafifçe karıştırın Bar kullanarak su karıştırır.
  5. Transfer Medil çözeltisi steril 50 ml konik Santrifüjlü tüp içine.
  6. Solüsyonu 4 °c ' de 10.000 x g 'de 45 dakika süreyle santrifüjle çıkarın. üst yarı sert sarı fraksiyonu steril bir tüpe ve 4 °c ' de saklamak için dikkatle kaldırın.

4. yağ asitleri kaynağı olarak tavuk Ldıs değerlendirmesi

  1. Subculture S. aureus hücreleri 5 ml yağ asidi-ücretsiz% 1 Tripton suyu ve gece 37 °c ' de sallama (225 rpm) ile inkübe edilir. Yağ asidi auxotrophs için, yağ asitleri kaynağı ile kültürler ek.
  2. % 1 Tripton suyu içinde 0,1 600 Nm (OD600) bir optik yoğunluklu (OD) bir gece kültürlerini seyreltmeli. Pipet 50, hücre süspansiyonunun her bir yuvarlak alt 96-kuyu plakasının her bir kuyunun içine μL.
    Not: yağ asidi auxotrophs ile çalışırken, tryptone suyu ve pelletini iki hacim içinde gece kültürlerini yıkayın 5 ml Tripton suyu kültür od belirlenmeden önce yağ asitleri ile sınırlamak için.
  3. Tedavi edilmeyen kontroller içeren kuyular için, iyi başına% 1 tryptone suyu 50 μL ekleyin.
  4. Deneysel hücre süspansiyonları içeren kuyular için,% 10 yumurta sarısı türevi LDL, 2 μM Triclosan veya% 10 yumurta sarısı türevi LDL ve 2 μM Triclosan karışımı ile% 1 Tripton suyu 50 μL ekleyin.
    Not: Bu noktada, her iyi 100 μL içerir ve yumurta sarısı türevi LDL ve Triklosan son konsantrasyonu sırasıyla 5% ve 1 μM olacaktır.
  5. Ölçüm OD600 zaman içinde, 37 °c ' de ayarlanan bir Mikroplaka okuyucuyu kullanarak sürekli, doğrusal sallayarak büyümeyi izlemek için.

5. membran lipid analizi için S. aureus 'un ldıs ile inkübasyon.

  1. 5 mL yağ asidi-ücretsiz% 1 Tripton suyu içine izole koloniye kültür ve 37 °C ' de sallama (225 rpm).
  2. Dilute gece kültürler 1:100 steril bir 250 mL 1% Tripton suyu ile 50 mL içeren şaşkın Flask içine. 37 °C ' de sallama aşamasında (yaklaşık 4 saat) giriş aşamasına kadar inküye yapın.
  3. Transfer 25 mL kültür steril 50 mL santrifüj tüp ve Pelet hücreleri. Süpernatant kaldırmak ve% 1 Tripton suyu 750 μL içinde hücre Pelet pelletini.
  4. Hücre süspansiyonunun resuspended hücreleri ve kısım 300 μL 'yi steril 1,5 ml santrifüj tüpüne birleştirin.
  5. İstenen son konsantrasyona Ldıs ekleyin ve 37 °C ' de 4 saat boyunca sallayarak (225 rpm)
  6. 2 dakika süreyle 16.000 x g 'de 4 °c ' de kültürler Santrifüjü ve iki adet steril PBS hücre Pelet yıkayın sonra tekrar.
  7. Her ıslak hücre Pelet ağırlığı kaydedin. Kuru buzda veya sıvı nitrojendeki hücre pelalini,-80 °C ' de saklayın veya doğrudan Bölüm 6 ' ya geçin.

6. S. aureus membran lipidlerinin çıkarılması

  1. Dondurulmuş S. aureus hücre peletleri kuru buzda yerleştirin. Her hücre Pellet üstüne 0,5 mm Zirkonyum oksit boncuk ekleyin, yaklaşık hücre Pellet hacmine eşit boncuk hacmi kullanarak.
    Not: lipid ekstraksiyon bu yönteme bir alternatif olarak, araştırmacılar bakteriyel hücrelerden34için titiz lipidler için Iyi kurulan Bligh ve Dyer veya Folch yöntemlerini kullanabilirsiniz.
  2. 75% metanol (HPLC Grade) 740 μL 'yi doğrudan hücre pelletine-80 °C ' ye soğutulmuş şekilde ekleyin.
  3. Dahili standart olarak 1 mg hücre başına 2 μL 50 μM dimyristoyl Fosfatidilkolin (metanol içinde hazırlanmış) ekleyin. Test tüpünü kapatın ve her bir numuneyi içeren 1,5 mL Santrifüjü tüpleri Bullet Blender doku homogenizer içinde kullanılabilir bir bağlantı noktasına yerleştirin. Düşük hızda örnekleri homojenize, ayar 2-3, 3 dakika.
  4. Numuneleri homojenlik için görsel olarak inceleyin. Hücrelerin kümeleri görünür ise, 2 dk artışlarla Bullet Blender homojenizasyon devam edin.
  5. Bullet Blender örnekleri çıkarın ve kimyasal duman kaputu transfer.
  6. Her numune tüpüne 270 μL kloroform ekleyin. Numuneleri 30 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde Vortex.
    DIKKAT: kloroform olası bir kanserojendir.
  7. Numuneleri en az 2.000 x g'de 30 dakikaya kadar olan bir tezgah santrifüjinde santrifüjün. Uyumlu santrifüj tüpleri ile daha hızlı kullanılabilir ve santrifüjleme süresi 10 dakikaya kısalabilir.
  8. Bir kimyasal duman kaputu içinde, monohasik süpernatant toplamak ve yeni bir test tüpü transfer, dikkatle ekstraksiyon tüp altındaki protein Pelet kaçınarak.
  9. Ekleme 740 μL 75% metanol (HPLC Grade) ve 270 μL kloroform protein Pellet, ve yeniden her örnek olarak açıklandığı gibi ayıklamak 6.6-6.8 yukarıda. Her örnek için daha önce toplanan süpernatant ile ikinci ekstraksiyon süpernatant birleştirin.
  10. Ekstraksiyon çözücüleri nitrojen veya Argon gibi inert gaz akışı altında veya santrifüj konsantratörü (malzeme tablosu) kullanarak vakum altında buharlaştırıcı.
  11. 1,0 mL sulu 10 mM Amonyum Bikarbonat çözeltisi ile üç kez kurutulur ve 6,10 adımda olduğu gibi numuneleri yeniden kurutun.
  12. Kuru lipid özleri isopropanol gibi uygun bir polar olmayan çözücüde yeniden resuspend. 5,7 adımda belirlenen 20 μl başına 1 mg taze hücre ağırlığı kullanılarak pelletini örnekleri alternatif olarak, hücre Pelet ağırlığı bilinmiyorsa, 200 μL izopropanol içinde örnekleri pelletini ve Bölüm 7 ' ye geçin.

7. yüksek çözünürlüklü/doğru kütle spektrometresi kullanılarak S. aureus lipid profillerinin Analizi

  1. Tam bir lipid analizi yapmadan önce, deneysel gruptan (s) temsili test örneklerini seçin ve toplam lipid konsantrasyonunun doğrusal olarak düşeceği örnek seyreltme aralıklarını belirlemek için bir dizi numune seyreltme faktörü üzerinden bunları analiz edin daha önce açıklandığı gibi kitle spektrometresi için dedektör yanıtı aralığı35.
  2. Her örnek lipid ekstresinin plakaya lipid analizine tabi olmak için buharlaştırıcı, inert gaz veya vakum altında bir Santrifüjü konsantratörde (malzeme tablosu) altında plakaya kurutmak.
  3. Sıvı kromatografi – kütle spektrometresi (LC-MS) dereceli isopropanol: metanol (2:1, v:v) ile 20 mM amonyum format içeren her bir kurutulmuş lipid ekstresi, 7,1 adımda belirlenen optimal bir örnek seyreltme faktörüne eşdeğer birimler kullanarak yeniden resuspend.
  4. Hedeflenen olmayan bir lipid analizi için numuneler, akış enjeksiyonu veya ekstrelerin doğrudan infüzyon35,36ile Kromatografi kullanmadan yüksek çözünürlüklü/doğru kütle spektrometresi platformuna doğrudan sunulabilir. 7,3 adımda hazırlanan seyreltilmiş lipid ekstrelerini uygun bir Otomatik Örnekleyici şişe veya 96-Well plakaya aktarın.
  5. Akış enjeksiyonu bazlı analiz için, Otomatik Örnekleyici şişeleri, elektronik akışa sahip bir HPLC (malzeme tablosu) gibi kapiller/düşük akış uygulamaları yapabilen bir HPLC sisteminin sıcaklık kontrollü (15 °c) Otomatik Örnekleyici içine yerleştirin Ölçüleme ve akış izleme sistemi.
  6. HPLC solvent rezervuarları LC-MS Grade isopropanol ile doldurun: metanol (2:1, v:v), 20 mM amonyum Format içerir.
  7. Agilent Chemstation yazılımını kullanarak, HPLC Otomatik Örnekleyici programını 5 μL numune enjeksiyonunu gerçekleştirin. Enstrüman menüsünden enjektör ayarla'Yı seçin ve enjeksiyon hacmi alanına 5,0 yazın. Birimler microliters olarak verilir. HPLC 'nin en az 2:1 (v:v) Isopropanol: 20 mM amonyum format içeren metanol başına 1 μL 'de izokrat akışına ayarlandığından emin olun.
  8. Chemstation Instrument menüsünden pompa ayarla... öğesini seçin ve ardından mikro akış modu geçiş anahtarını seçin.
  9. Zamanlama alanlarına girin: zaman 0,00, 100% B, Flow 1,0. ENTER tuşuna basın ve saat 10,0, 100% B, Flow 1,0girerek zamanlama ikinci bir satır oluşturun. Set up pompa menüsünün altındaki ok düğmesini seçin. Bu ayarlar, dakikada 1,0 μL akış hızında 10 analiz çalıştırmasını sağlayacaktır.
  10. Düşük akışlı (34 G) metal iğne ile donatılmış bir elektrosprey iyonizasyon kaynağı kullanarak HPLC transfer hattından kütle spektrometresi ile birlikte kurtulabilirsiniz.
  11. Thermo Tune Plus enstrüman kontrol yazılımını kullanarak Kurulum menüsünü SEÇIP ısıtmalı ESI kaynağı'nı seçin. Bu değerleri diyalog kutusunun ilgili alanlarına yazarak, iyonlaştırma voltajını 4000 V ve kılıf gazına 5 (rasgele üniteler) olarak ayarlayın. Benzer şekilde, kapiller Temp 150 °C ve S-lens% 50 için ayarlayın.
    Not: Bu değerlerin her kütle spektrometresi platformu için optimize edilmesi gerekir.
  12. Hedefsiz lipid analizi için dedektör olarak yüksek çözünürlüklü/doğru kütle MS platformu (malzeme tablosu) kullanın.
  13. Thermo Tune Plus yazılımını kullanarak tarama tanımla düğmesini tıklayın ve Analyzer menüsünde FTMs'i seçin. Kütle aralığı alanını normal olarak ayarlayın ve çözünürlük alanında 100.000seçin. Tarama türünün tamolarak ayarlandığından emin olun. Tarama aralıkları menüsünün altında, ilk kütle (m/z) alanına 200 girin ve son kütle (m/z) alanına 2000 girin.
  14. En bol S. aureus lipidleri tespit etmek için negatif polariteden yararlandığından emin olun.
  15. Lipid yapılarını ve yağlı asit bileşenlerinin onaylanması için spektral bir bölgede tüm lipid iyonlarının iyon haritalama tandem kütle spektrometresi (MS/MS) parçalanma kullanarak örnek analizini tekrarlayın. Alternatif olarak, Bölüm 8 ' de ilk lipid tanımlayıcısı atantıktan sonra seçilen lipid iyonları MS/MS analizine tabi tutulabilir.

8. endojen S. aureus ve EKSOJEN LDL türevi lipidleri tanımlamak için veritabanı arama

  1. Daha fazla gözlenen kütle doğruluğu rafine Thermo Xcalibur yazılımı kullanın. Xcalibur 'da, Araçlar menüsünün altında, çevrimdışı yeniden kalibreetme seçeneğini belirleyin. Çevrimdışı yeniden kalibre etme penceresi açıldığında, Dosya menüsü seçerek ve Açık seçeneğini belirleyerek yeniden kalibre edilecek kütle spektrumlu dosyasını yükleyin.
  2. İlgi dosyasını açın, MS çalıştırmak için toplam iyon kromatogram görüntülemek için görünüm penceresinin üst satırında satır ekle düğmesini değiştirin. Toplam iyon kromatogram içinde gözlenen sinyal zirvesinde bir kenar üzerinde bilgisayar fareyi sol tıklayarak ve zirveye en geniş kısmı boyunca fareyi sürükleyerek alınan MS sinyalleri ortalama.
  3. Tarama filtresi menüsünün altında, tam tarama MS verilerine karşılık gelen filtreyi seçin. Yük ref... düğmesini seçip referans dosyasını seçerek en az üç bilinen S. aureus endojen lipidlerinin teorik monoizotopik kitlelerini içeren bir referans dosyası yükleyin. Her lipid monoizotopik kütlenin yanındaki kullanım kutusunu işaretleyin.
  4. Görüntüleme penceresinin altındaki Ara düğmesini tıklatın. Daha önce yapılan toplam iyon kromatogram içinde sinyal zirvesinde MS sinyali yeniden ortalama.
  5. Görüntüleme penceresinin alt kısmına yakın olan Dönüştür düğmesini tıklatın. Dönüştür iletişim kutusu açıldığında, Tamam'ı tıklatın. Veri, Thermo Scientific dışındaki satıcılardan gelen kütle spektrometresi platformlarda toplanırsa bu adımı atlayın.
  6. Xcalibur yazılımını kullanarak, bir Excel dosyasının çalışma sayfalarını ayırmak için her tedavi edilmemiş veya LDL tedavi edilen örnek için yeniden kalibre edilmiş doğru kitle tepe listelerini dışa aktarın. Qual tarayıcı simgesini seçin. Dosya menüsünü seçip açık... seçeneğini belirleyerek yeniden kalibre edilen ilgi alanı dosyasını açın.
  7. 8,2 adımda açıklandığı gibi toplam iyon kromatogram içinde geniş tepe genelinde sinyal ortalama.
  8. Kütle spektrumlu görüntüleme penceresindeki raptiye simgesine sağ tıklayın ve Görünüm | Spektrum listesi. Aynı menüden görüntüleme seçenekleri 'ni ve ardından görüntü menüsündeki Tüm zirveler geçiş kutusunu seçin. İzleme penceresini kapatmak için Tamam düğmesini tıklatın.
  9. Kütle spektrumlu görüntüleme penceresinde tekrar raptiye simgesine sağ tıklayın ve ihracat | Pano (tam kütle). Dışa aktarılan veri hücresini ilk çalışma sayfasının a1 'i yeni bir Excel elektronik tablosuna yapıştırın.
  10. Dışa aktarılan veri dosyasındaki ilk 8 satır metnini, Excel elektronik tablosunun a1 hücresinin kitle spektrumundan ilk kitle veri noktasını içerdiğinden silin. Her dışa aktarılan en yüksek liste için Excel dosyasındaki yeni bir çalışma sayfasını kullanarak, her yeniden kalibre edilmiş MS dosyasının dışa aktarmayı yineleyin.
  11. Excel için eklenti37 lipid kütle spektral analizi (lımsa) yazılımı kullanarak, bilinen S. aureus lipid türlerinin moleküler formülleri Hewelt-belka ve ark. 201438tarafından açıklandığı gibi içeren bir veritabanı inşa LDL 'de varsayımsal olarak mevcut olabilecek lipid türlerini temsil eden formüller.
    Not: Ayrıca, önemli LDL yağ asitleri, oleik (18:1) ve linoleik (18:2) yağ asitleri gibi dahil olan varsayımsal bakteriyel lipidler için veritabanında potansiyel moleküler formüller eklemek için bakım alınmalıdır32.
  12. Veritabanını oluşturmak için boş bir Excel elektronik tablosu açın. İlk çalışma sayfasının a1 hücresinde, veri tabanına eklenecek olan lipid türlerinin teorik/hesaplanan monoizotopik kütlesini, kütle spektrometresini gözlemlenen iyonik durumda lipid türlerinin kütlesine karşılık gelen yazın. B1 hücresinde, örneğin PG (34:0) gibi lipid türleri için bir ad girin.
  13. C1 hücresinde, kütle spektrometresi gözlenen lipid iyonik durumuna karşılık gelen lipid türleri için moleküler formülü girin. D1 hücresinde, kütle spektrometresi gözlenen lipid türünün şarj girin. Aranabilir veritabanında girilen sonraki lipid türlerinin yeni girişini başlatmak için a2 hücresine gidin.
  14. 8,12 ve 8,13 tüm istenen lipid türleri veritabanına girilinceye kadar adımları yineleyin. Veritabanı dosyasını kaydedin ve Excel 'de açık bırakın.
  15. Excel 'de, Eklentiler menüsünü seçin. LıMSA yazılımını başlatmak için Limsa 'yı seçin. Ana menüden bileşik kitaplık... düğmesini tıklatın. Görüntülenen yeni pencerede, bileşikler al'ı tıklatın. Bu, bileşik veritabanını LıMSA yazılımı tarafından kullanılmak üzere yükleyecektir.
  16. 35tedarikçinin talimatlarına göre Excel için LıMSA yazılım eklentisini kullanarak tüm MS Spectra 'da doğru kütle bazlı lipid tanımlayıcısı gerçekleştirin. LıMSA ana menüsünden spektrum türü menüsünün altındaki tepe listesi 'ni seçin. MS verilerinin alındığını gösteren polarite ile karşılık vermek için pozitif mod veya negatif mod 'u seçin.
  17. Peak fwhm (m/z) penceresinde, en yüksek bulgu için istenen kütle arama penceresini girin. 0.003-0.005 m/z kütle tolerans arama penceresi yüksek çözünürlüklü/doğru kütle MS verileri için önerilir.
  18. Duyarlılık penceresinde, istenen taban çizgisi kesmenizi (örneğin,% 0,01 bağıl bolluk) girin. IZotope düzeltme menüsünde, en yüksek liste verileriyle kullanılabilecek Doğrusal sığdırma veya çıkarma algoritmaları 'nı seçin.
  19. Kullanılabilir bileşikler penceresi içinde istenilen lipid türlerini tıklayarak veritabanı arama dahil etmek için lipid bileşikleri vurgulayın. Vurgulanan lipid türlerini arama grubuna eklemek için Ekle düğmesini tıklayın.
  20. Eklenen bileşiklere tıklayarak iç standartları tanımlayın, sonra da seçilen iç standardın ilgili konsantrasyonuna konsantrasyon penceresini değiştirerek.
  21. Her bir katma lipid türünü ve iç standardı seçerek ve sınıf alanında bir sınıf adı (PG veya lipid gibi) yazarak aynı sınıf adına ait olan iç standart ve seçilmiş lipid türlerinin niceklendirilecek olduğundan emin olun.
  22. Gelecekteki kullanım için aranabilir lipid bileşikleri grubunu kaydetmek için gruplar menüsünün yanındaki Kaydet düğmesini tıklatın.
  23. Tüm dışa aktarılan MS tepe listelerini içeren Excel dosyasının ilk S. aureus MS çalışmasına karşılık gelen sayfaya açık olduğundan emin olun ve ardından LıMSA ana menüsünden arama düğmesini tıklatın.
    Not: LıMSA veritabanı aramasının çıktısı, 8.12-8.13 adımlarında oluşturulan veritabanında bulunan lipidlere eşleşen kitlesel spektral özelliklerin bir listesini, hem de bir veya daha fazla seçilen normalleştirme aşağıdaki her eşleşen özellik için konsantrasyonları içerir iç standartlar.
  24. Kullanmak Xcalibur yazılım için doğru kütle MS/MS spektrumları incelemek için m/z her tanımlanan lipid moleküler türler mevcut yağ asit bileşenlerini onaylamak için ilgi lipid iyonlarını karşılık gelen. Qual tarayıcı simgesini seçin. Dosya açılır menüsünü seçip açık... SEÇENEĞINI belirleyerek ılgı alanı MS/MS dosyasını açın.
  25. Kütle spektrumlu görüntüleme penceresindeki raptiye simgesine sağ farenin tıklanması ve menüden aralıkları seçmek suretiyle bir lipid m/z 'nin MS/MS analizine karşılık gelen tarama filtresini seçin. Görüntülenen yeni pencerede, taramayı seçmek için filtre menüsünü seçin.
  26. 8,2 adımda açıklandığı gibi toplam iyon kromatogram boyunca sinyal ortalama. Uygun istatistiksel testler gerçekleştirmek için MetaboAnalyst (www.metaboanalyst.ca) yazılımını kullanın. Tedavi edilmemiş ve LDL tedavi edilen koşullarda normalleştirilmiş lipid abundaları karşılaştırarak S. aureus lipid bileşiminde istatistiksel olarak anlamlı fark değerlendir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Tavuk yumurtası sarısı tarafından LDL zenginleştirme Protokolü Şekil 1' de gösterilmiştir. Bu işlem, tüm yumurta sarısı ile tuz seyreltilerek başlar ve yumurta sarısı katıları ayrıştırmadan veya plazma kesir Ldıs içeren granül olarak adlandırılan ayıran (Şekil 1)33. Plazma fraksiyonu LDL içeriği daha fazla yağış ile zenginleştirilmiştir ~ 30-40 kDa β-livetins (Şekil 2)

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

S. aureus membran fosfolipidlerin içine eksojen yağ asitleri birleştirir27,32,43. Eksojen yağ asitleri kullanarak fosfolipid sentezi fasii inhibisyonu atlar ama aynı zamanda membranın Biyofizik özelliklerini değiştirir27,32,44. Gram-pozitif patojenlerin fosfolipidlerine eksojen yağ asitleri eklenmesi iyi belgelenmiş olmakla ber...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklamaları yok.

Teşekkürler

Biz bu işin el yazması ve destek kritik değerlendirme için Hammer laboratuar üyelerine teşekkür ederiz. Dr Alex Horswill üniversite Colorado Okulu tıp nazik AH1263 sağladı. Dr. Chris Waters laboratuar Michigan State Üniversitesi reaktifler sağladı. Bu çalışma Amerikan Kalp Derneği Grant 16, 30170026 ve başlangıç fonları Michigan State Üniversitesi tarafından sağlanan tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Amonyum sülfatFisherBP212R-1& ge; % 99,5 saf
Hücre kültürü inkübatörüThermoMaxQ 6000
CentrafugeThermo75-217-420Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE
Costar test plakasıCorning378896 kuyu
Filtre kağıdıSchleicher & Schuell597
Büyük tavuk yumurtasıN/AN/AOrtak mağaza satın alınan yumurta
Mikroplaka spektrofotometreBioTekEpoch 2
NaClSigmaS9625
S. aureus suşu AH1263N/AN/A ColoradoÜniversitesi'nden Alex Horswill tarafından sağlanmıştır
Diyaliz tüpüPierce687007,000 MWCO
TriponBecton, Dickison and Company211705
0,5 mm zirkonyum oksit boncuklarSonraki İlerlemeZROB05
Mermi BlenderSonraki İlerlemeBBX24B
Metanol (LC-MS sınıfı)FisherA4561
Kloroform (reaktif sınıfı)FisherMCX10559
İzopropanol (LC-MS sınıfı)FisherA4611
Dimyristoyl fosfatidilkolinAvanti Polar Lipidler850345C-25mg
Amonyum bikarbonatSigma9830≥ % 99,5 saf
Amonyum formatSigma70221-25G-F
Xcalibur yazılımıThermo ScientificOPTON-30801
LTQ-Orbitrap Velos kütle spektrometresiThermo Scientificyüksek çözünürlüklü/doğru kütle MS
Agilent 1260 kılcal HPLCAgilent
SpeedVac Vakum KonsantratörleriThermo Scientific

Kaynaklar

  1. Noskin, G. A., et al. National trends in Staphylococcus aureus infection rates: impact on economic burden and mortality over a 6-year period (1998-2003). Clinical Infectious Diseases. 45 (9), 1132-1140 (2007).
  2. Noskin, G. A., et al. The burden of Staphylococcus aureus infections on hospitals in the United States: an analysis of the 2000 and 2001 Nationwide Inpatient Sample Database. Archives of Internal Medicine. 165 (15), 1756-1761 (2005).
  3. Laible, B. R. Antimicrobial resistance: CDC releases report prioritizing current threats. South Dakota medicine. 67 (1), 30-31 (2014).
  4. Zhang, Y. M., Rock, C. O. Membrane lipid homeostasis in bacteria. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 222-233 (2008).
  5. Zhang, Y. M., White, S. W., Rock, C. O. Inhibiting bacterial fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 281 (26), 17541-17544 (2006).
  6. Sohlenkamp, C., Geiger, O. Bacterial membrane lipids: diversity in structures and pathways. FEMS Microbiology Reviews. 40 (1), 133-159 (2016).
  7. Schiebel, J., et al. Staphylococcus aureus FabI: inhibition, substrate recognition, and potential implications for in vivo essentiality. Structure. 20 (5), 802-813 (2012).
  8. Heath, R. J., Li, J., Roland, G. E., Rock, C. O. Inhibition of the Staphylococcus aureus NADPH-dependent enoyl-acyl carrier protein reductase by triclosan and hexachlorophene. Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4654-4659 (2000).
  9. Heath, R. J., Yu, Y. T., Shapiro, M. A., Olson, E., Rock, C. O. Broad spectrum antimicrobial biocides target the FabI component of fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30316-30320 (1998).
  10. Park, H. S., et al. Antistaphylococcal activities of CG400549, a new bacterial enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI) inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (3), 568-574 (2007).
  11. Schiebel, J., et al. Rational design of broad spectrum antibacterial activity based on a clinically relevant enoyl-acyl carrier protein (ACP) reductase inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 289 (23), 15987-16005 (2014).
  12. Yum, J. H., et al. In vitro activities of CG400549, a novel FabI inhibitor, against recently isolated clinical staphylococcal strains in Korea. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (7), 2591-2593 (2007).
  13. Kaplan, N., et al. Mode of action, in vitro activity, and in vivo efficacy of AFN-1252, a selective antistaphylococcal FabI inhibitor. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (11), 5865-5874 (2012).
  14. Karlowsky, J. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Hoban, D. J., Zhanel, G. G. AFN-1252, a FabI inhibitor, demonstrates a Staphylococcus-specific spectrum of activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (8), 3544-3548 (2009).
  15. Ross, J. E., Flamm, R. K., Jones, R. N. Initial broth microdilution quality control guidelines for Debio 1452, a FabI inhibitor antimicrobial agent. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (11), 7151-7152 (2015).
  16. Hunt, T., Kaplan, N., Hafkin, B. Safety, tolerability and pharmacokinetics of multiple oral doses of AFN-1252 administered as immediate release (IR) tablets in healthy subjects. Journal of Chemotherapy. 28 (3), 164-171 (2016).
  17. Hafkin, B., Kaplan, N., Hunt, T. L. Safety, tolerability and pharmacokinetics of AFN-1252 administered as immediate release tablets in healthy subjects. Future Microbiology. 10 (11), 1805-1813 (2015).
  18. Flamm, R. K., Rhomberg, P. R., Kaplan, N., Jones, R. N., Farrell, D. J. Activity of Debio1452, a FabI inhibitor with potent activity against Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus spp., including multidrug-resistant strains. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (5), 2583-2587 (2015).
  19. Yao, J., Maxwell, J. B., Rock, C. O. Resistance to AFN-1252 arises from missense mutations in Staphylococcus aureus enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI). Journal of Biological Chemistry. 288 (51), 36261-36271 (2013).
  20. Tsuji, B. T., Harigaya, Y., Lesse, A. J., Forrest, A., Ngo, D. Activity of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, against Staphylococcus aureus in an in vitro pharmacodynamic model simulating human pharmacokinetics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 32-35 (2013).
  21. Parsons, J. B., et al. Perturbation of Staphylococcus aureus gene expression by the enoyl-acyl carrier protein reductase inhibitor AFN-1252. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (5), 2182-2190 (2013).
  22. Kaplan, N., et al. In vitro activity (MICs and rate of kill) of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, in the presence of serum and in combination with other antibiotics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 18-25 (2013).
  23. Kaplan, N., Garner, C., Hafkin, B. AFN-1252 in vitro absorption studies and pharmacokinetics following microdosing in healthy subjects. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (3-4), 440-446 (2013).
  24. Banevicius, M. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Nicolau, D. P. Pharmacokinetics, pharmacodynamics and efficacy of novel FabI inhibitor AFN-1252 against MSSA and MRSA in the murine thigh infection model. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 26-31 (2013).
  25. Karlowsky, J. A., et al. In vitro activity of API-1252, a novel FabI inhibitor, against clinical isolates of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (4), 1580-1581 (2007).
  26. Yao, J., et al. A Pathogen-Selective Antibiotic Minimizes Disturbance to the Microbiome. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (7), 4264-4273 (2016).
  27. Brinster, S., et al. Type II fatty acid synthesis is not a suitable antibiotic target for Gram-positive pathogens. Nature. 458 (7234), 83-86 (2009).
  28. Balemans, W., et al. Essentiality of FASII pathway for Staphylococcus aureus. Nature. 463 (7279), E3-E4 (2010).
  29. Parsons, J. B., Frank, M. W., Subramanian, C., Saenkham, P., Rock, C. O. Metabolic basis for the differential susceptibility of Gram-positive pathogens to fatty acid synthesis inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15378-15383 (2011).
  30. Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), e0116195(2015).
  31. Feingold, K. R., Grunfeld, C. Introduction to Lipids and Lipoproteins. Endotext. , (2000).
  32. Delekta, P. C., Shook, J. C., Lydic, T. A., Mulks, M. H., Hammer, N. D. Staphylococcus aureus utilizes host-derived lipoprotein particles as sources of exogenous fatty acids. Journal of Bacteriology. 200 (11), (2018).
  33. Moussa, M., Marinet, V., Trimeche, A., Tainturier, D., Anton, M. Low density lipoproteins extracted from hen egg yolk by an easy method: cryoprotective effect on frozen-thawed bull semen. Theriogenology. 57 (6), 1695-1706 (2002).
  34. Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. Bligh and Dyer and Folch Methods for Solid-Liquid-Liquid Extraction of Lipids from Microorganisms. Comprehension of Solvatation Mechanisms and towards Substitution with Alternative Solvents. International journal of molecular sciences. 18 (4), (2017).
  35. Lydic, T. A., Busik, J. V., Reid, G. E. A monophasic extraction strategy for the simultaneous lipidome analysis of polar and nonpolar retina lipids. Journal of Lipid Research. 55 (8), 1797-1809 (2014).
  36. Bowden, J. A., Bangma, J. T., Kucklick, J. R. Development of an automated multi-injection shotgun lipidomics approach using a triple quadrupole mass spectrometer. Lipids. 49 (6), 609-619 (2014).
  37. Haimi, P., Uphoff, A., Hermansson, M., Somerharju, P. Software tools for analysis of mass spectrometric lipidome data. Analytical Chemistry. 78 (24), 8324-8331 (2006).
  38. Hewelt-Belka, W., et al. Comprehensive methodology for Staphylococcus aureus lipidomics by liquid chromatography and quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1362, 62-74 (2014).
  39. Jolivet, P., Boulard, C., Beaumal, V., Chardot, T., Anton, M. Protein components of low-density lipoproteins purified from hen egg yolk. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (12), 4424-4429 (2006).
  40. Bylesjö, M., et al. OPLS discriminant analysis: combining the strengths of PLS-DA and SIMCA classification. Journal of Chemometrics. 20 (8-10), 341-351 (2006).
  41. Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Progress in Lipid Research. 29 (2), 107-140 (1990).
  42. Cherian, G., Holsonbake, T. B., Goeger, M. P. Fatty acid composition and egg components of specialty eggs. Poultry Science. 81 (1), 30-33 (2002).
  43. Parsons, J. B., Frank, M. W., Rosch, J. W., Rock, C. O. Staphylococcus aureus Fatty Acid Auxotrophs Do Not Proliferate in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (11), 5729-5732 (2013).
  44. Sen, S., et al. Growth-Environment Dependent Modulation of Staphylococcus aureus Branched-Chain to Straight-Chain Fatty Acid Ratio and Incorporation of Unsaturated Fatty Acids. PLoS One. 11 (10), e0165300(2016).
  45. Wang, M., Huang, Y., Han, X. Accurate mass searching of individual lipid species candidates from high-resolution mass spectra for shotgun lipidomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 28 (20), 2201-2210 (2014).
  46. Peti, A. P. F., Locachevic, G. A., Prado, M. K. B., de Moraes, L. A. B., Faccioli, L. H. High-resolution multiple reaction monitoring method for quantification of steroidal hormones in plasma. Journal of Mass Spectrometry. 53 (5), 423-431 (2018).
  47. Neves, M. M., Heneine, L. G. D., Henry, M. Cryoprotection effectiveness of low concentrations of natural and lyophilized LDL (low density lipoproteins) on canine spermatozoa. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaria e Zootecnia. 66 (3), 769-777 (2014).
  48. Liu, P. V., Hsieh, H. C. Inhibition of Protease Production of Various Bacteria by Ammonium Salts - Its Effect on Toxin Production and Virulence. Journal of Bacteriology. 99 (2), 406(1969).
  49. Suller, M. T., Russell, A. D. Triclosan and antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 46 (1), 11-18 (2000).
  50. Yao, C. H., Liu, G. Y., Yang, K., Gross, R. W., Patti, G. J. Inaccurate quantitation of palmitate in metabolomics and isotope tracer studies due to plastics. Metabolomics. 12, (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

LDL İzolasyonuStaphylococcus aureusKütle SpektrometrisiLipidomik AnalizAmonyum Sülfat PresipitasyonuDiyaliz MembranıAkış Enjeksiyonu
Membran fosfolipidler içine bakteriyel patojen yağ asidi kuruluş çalışması için tavuk yumurtası sarısı lipoprotein parçacıklarının yalıtım
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.