Yöntem makalesi

Bir In Vivo fagositoz tahlil kullanarak Drosophila melanogaster, meyve sineği hücresel bağışıklık yanıtı değerlendirirken

7.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/59543

⸱

10 Nisan 2019

 , 
1Department of Biology, University of Maryland, 2Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland, 3Institute for Bioscience and Biotechnology Research, University of Maryland

Bu makalede

Özet

Bu iletişim kuralı bir hücre tanıma ve mikrobiyal enfeksiyonlar Gümrükleme ölçmek için yetişkin Drosophila melanogaster içinde vivo fagositoz tahlil açıklar.

Özet

Bütün hayvanlarda doğuştan gelen bağışıklık patojenler geniş bir yelpazede karşı acil ve sağlam bir savunma sağlar. Humoral ve hücresel immün yanıt-e doğru doğuştan gelen bağışıklık ana dallar ve birçok bu yanıtları düzenleyen etkenler örümceklerle omurgasızlar ve memeliler arasında korunmuş. Fagositoz, Merkezi bileşeni hücresel doğuştan gelen bağışıklık, bağışıklık sisteminin özel kan hücreleri tarafından yapılır. Meyve sineği Drosophila melanogaster, moleküler mekanizmaları ve fagositoz bütün hayvanlarda fizyolojik etkilerini araştırmak için güçlü bir genetik model olarak ortaya çıkmıştır. Burada parçacık alımı ve imha Drosophila kan hücreleri, hemocytes tarafından ölçmek için bir enjeksiyon tabanlı içinde vivo fagositoz tahlil göstermektedir. Yordamı araştırmacılar tam parçacık konsantrasyonu ve doz, son derece tekrarlanabilir sonuçlar kısa bir miktarda elde etmek mümkün hale kontrolü sağlar. Deneme nicel, gerçekleştirmek, kolay ve ana faktörler için ekran o etkisi patojen tanıma, alımı ve izni için uygulanabilir.

Giriş

Doğuştan gelen bağışıklık savunma patojenik mikroplar karşı savunma ilk satırı oluşturur. Bu yanıtları ikisi de moleküler desenleri (PAMPs) patojen ilişkili1anlamda germline kodlanmış desen tanıma reseptörleri tarafından (PRRs) aracılı humoral ve hücresel doğuştan gelen bağışıklık işlevsel olarak ayrılabilir. Memeliler ve omurgasızlar, Yuvarlak solucanlar, Caenorhabditis elegans ve meyve sineği Drosophila melanogaster2gibi birçok sinyal yollar ve doğuştan gelen bağışıklık efektör mekanizmaları korunmuş. Meyve sineği bulaşıcı mikroorganizmaların3karşı ana savunma eğitim için güçlü bir sistem olarak ortaya çıkmıştır. Drosophila kolay ve ucuz laboratuvarlarda, yetiştirilen genetik olarak uysal ve kısa oluşturma süresi vardır. Ayrıca, meyve sineği mikroplar, ana bilgisayar dokunulmazlık viral, bakteriyel, mantar veya parazit patojenlere karşı incelenmesi etkinleştirme bir dizi karşı son derece etkili savunma sergiler.

Drosophila immunologists tarihsel olarak ileri genetik ekranlar, böcek hücre satırları filtreleme ve doğuştan gelen bağışıklık-önde gelen incelemek için sinek mutant suşları önceden varolan genom çapında RNA-aracılı girişim (RNAi) kullanılan kimlik ve karakterizasyonu birkaç örümceklerle korunmuş humoral bağışıklık yolları4,5,6,7,8. Humoral doğuştan gelen bağışıklık yanıtı, tartışmalı, en iyi meyve sinekleri bağışıklık savunma ile karakterizedir. Enfeksiyon, humoral yanıt üretim ve antimikrobiyal peptid sistemik sürümü (AMP) molekülleri içine hemolymph, kan içinde böcekler eşdeğer yol açar. Amper son derece korunmuş otoyol ve yolları sinyal IMD tarafından üretilmektedir. Toll yolu, sinyal memeli için homolog TLR/IL-1R reseptör ve IMD yolu memeli tümör nekrozis faktör-Alfa sinyal için homolog. Drosophila, otoyol sinyal gram-pozitif bakteriler, mantarlar ve Drosophila X virus6,9,10 tarafından indüklenen olduğu ve IMD sinyal Ayagin Gram-negatif bakteriler11 tarafından indüklenen ,12.

Hücresel bağışıklık, kapsülleme, melanization ve fagositoz invaziv patojenlerin oluşan özel kan hemocytes13denilen hücreler tarafından yürütülmektedir. Hemocytes meyve sineği içinde üç sınıf vardır: Kristal hücreleri, lamellocytes ve plasmatocytes13. Larva dolaşımdaki hemocytes % 5 makyaj, kristal hücrelerin patojenler ve ana bilgisayar doku yara sitelerdeki melanization önde gelen proPhenoloxidase (proPO) enzimler serbest bırakın. Normalde sağlıklı embriyo veya larva bulunmayan, Lamellocytes yabancı nesneler kapsülleyen yapisan hücrelerdir. Bu hücreler üzerine pupariation veya parasitizing arı yumurta larva yatırılan zaman indüklenir. Larva hemocytes ve tüm kalan hemocytes erişkinlerde dolaşan % 95 makyaj, fagositik plasmatocytes geliştirme sırasında remodeling doku bir rol oynamaktadır ve özellikle, Drosophila hücresel bağışıklık ana efektör hücresi olarak hizmet vermektedir.

Fagositoz bir acil ve çok önemli savunma hattı, doğuştan gelen bağışıklık; ana bilgisayar epitel bariyeri mikroplar hızlı bir şekilde sardı ve fagositik kan hücreleri tarafından elimine (hücre biyolojisi fagositoz, kapsamlı bir inceleme için bkz: başvuru 14). Germline kodlanmış örüntü tanıma reseptörleri (PRRs) hemocytes tarihinde patojen tanıması mikroplar moleküler desenleri (PAMPs) ilişkili zaman bu işlemi başlatılır. Bir kez hedeflerine bağlı, PRRs aktin sitoiskeleti remodeling aracılığıyla pseudopods oluşumu neden sinyal cascades başlatın. Pseudopods hangi daha sonra sardı ve doğmakta olan organel, phagosome içselleştirilmiş mikrop, surround. Phagosome hemocyte iç doğru insan ticareti ve etkileşimleri organellerin ile bir dizi acidifies phagosome phagosome olgunlaşma süreci uğrar gibi mikropların yok edilir. Vitro ve hücre memeli Primer hücre biyolojisi çalışmalarında ve fagositoz, memeli Fc-gama reseptör ve C3b reseptörleri15,16gibi düzenleyen faktörler karakterize vesile olmuştur. Yine de, büyük ölçekli ekranları veya içinde vivo çalışmalar yürütme yeteneğini memeli sistemlerinde sınırlıdır.

Burada içinde vivo bir tahlil için ilk David Schneider laboratuvarda 200017tarafından tanıtılan bir yordam temel fagositoz yetişkin meyve sinekleri içinde mevcut. Schneider laboratuvar sesil hemocytes karın sırt gemi kolayca kümelenmiş polistren boncuk ve bakteri phagocytose gösterdi. Fagositoz görselleştirmek için sinekler (örneğin floresein isothiocyanate ile (E. coli -FITC) etiketli E. coli ), fluorescently etiketli parçacıkları ile enjekte edilir parçacıkları, yutmak için hemocytes zaman izin vermek 30 dakika boyunca inkübe ve sonra Kuluçka döneminde değil fagosite parçacıklar Floresans quenches trypan mavi, enjekte. Sinek dorsal damarları sonra ters bir floresan mikroskop kullanarak yansıma. Seminal bu kağıt hemocytes bakteri phagocytose ve lateks boncuklar, bu bakteri fagositoz önceden enjekte edilerek inhibe olabilir gösterdi nispeten basit bir deney kullanarak lateks boncuk ile gider ve bu hem hücresel ve humoral olmadan uçar bağışıklık yanıtı bile E. coliiçin açıktır. Bu raporda sunulan tahlil içinde vivo fagositoz dorsal gemi ilişkili hemocytes tarafından yuttu parçacıklar floresan yoğunluğu ölçme ölçmek için Schneider laboratuvar çalışmalarını kurar.

Benzer şekilde yaklaşım memeli sistemlerinde alınan, Drosophila genetikçileri başlangıçta genom genelinde kullanılan tüp bebek RNAi ekranlar hücresel immün yanıt18,19için,20 gerekli genlerin tanımlamak için ,21,22,23. Ancak, Yetişkin içinde vivo fagositoz tahlil gelişimi izleme denemeleri kolayca böylece biyolojik doğrulamak için araştırmacılar içinde vitro çalışmalarda tespit faktörler rol izin tüm hayvanlarda gerçekleştirilebilmesi etkin. Böyle transmembran reseptör yiyen, ilk24 S2 kullanarak bir RNAi ekranında bakteriyel bir reseptör hücreleri olarak tanımlanan ve Escherichia coli (e.coli), enterokok arabuluculuk için daha sonra gösterilen olduğu faecalistir, ve Staphylococcus aureus (S. aureus) fagositoz yetişkin25.

Laboratuarımızın içinde vivo fagositoz tahlil ileri genetik ekranlar ve genom çapında dernek çalışmaları ( Drosophila genetik başvuru Masası (DGRP) kullanarak) Yetişkin hemocytes fagositoz düzenleyen yeni genlerin tanımlamak için istihdam. Bu çalışmalar için karakterizasyonu reseptörleri PGRP-SC1A ve PGRP-SA26, protein Rab1427, Glutamat ışınlama Polyphemus28ve RNA-bağlayıcı protein Fox-129kaçakçılığı hücre içi vezikül yol açtı.

Biz gelecekte ekranlar içinde vivo fagositoz birleşmeyle Drosophilahücresel bağışıklık yanıtında için önemli ek genler tanımlaması yol açabileceğini tahmin. DGRP veya Drosophila sentetik nüfus kaynak (DSPR), gibi tam olarak sıralı doğuştan hatlarını kullanarak ekranlar fagositoz ya da hemocyte geliştirme etkileyen doğal türevleri tanımlayabilirsiniz. Ayrıca, teknik Drosophila diğer türler içinde kabul veya olabilir ekran yeni topluluk kaynaklarına, ulusal Drosophila tür stok Merkezi (NDSSC tarafından tutulan 250 Drosophila türler topluluğu gibi kullanılan ) Cornell'de. Bu deneyler ticari olarak kullanılabilir fluorescently etiketli bakteri veya duvar mantar bioparticles kullanarak yürütülen olabilir veya bakteriyel veya mantar türleri-mikrop floresan işaretleri ifade sağlanan herhangi bir sayıda kullanarak yapılamaz .

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. floresein parçacıklar enjeksiyon için hazırlayın

  1. Piyasada bulunan, ısı-öldürüldü bakterilerin 10 mg sulandırmak floresein ile etiketli parçacıklar ( Tablo malzemelerigörmek) 990 µL steril 1 x PBS ve 10 µL 50 mM sodyum azid ekleyerek 10 mg/mL stok bir konsantrasyon için. Girdap karıştırmak için.
    1. Tek kullanımlık 8 µL aliquots 0.2 mL tüpler içine bölmek ve 4 ° C'de ışık ilişkili hassasiyeti en aza indirmek için karanlık bir kutu içinde saklayın.
      Not: Sodyum azid koruyucu isteğe bağlıdır ve 10 mg/mL hisse senetleri 1 mL steril 1 x PBS ile yapılırsa atlanabilir bölünmemeli ve saklı-20 ° C'de
  2. 10 mL solüsyon 500 µL filtre şırınga yeşil gıda renklendirme ve 9.5 mL steril 1 x PBS karıştırarak 1 x PBS boyama %5 yiyeceklerin olun.
  3. Parçacıklar enjeksiyon sodyum azid kaldırmak için önce yıkayın. Mix 42 µL steril 1 x PBS ve 10 mg/ml 1.7 mL tüp içinde 8 µL. Oda sıcaklığında 2.5 min için maksimum hızda santrifüj kapasitesi.
    1. Süpernatant kaldırmak, oda sıcaklığında 2.5 min için maksimum hızda 50 µL 1 x PBS ve santrifüj ekleyin.
    2. 1.3 1.3.1 aygıtlarından 3 yıkama olmak üzere toplam 2 x.
    3. Son yıkama sonra süpernatant atın ve parçacıklar 1.6 mg/ml 1 x PBS boyama % 5 yiyecek 50 µL yeniden askıya.
    4. Tüp ışıktan korumak için alüminyum folyo şal. 4 ° C'de depolayın, 1 hafta sonra atın.

2. istasyonu ve sinekler hazırlamak

  1. Enjeksiyon pad hazırlayın. Aynı zamanda, bir dikdörtgen CO2 sinek bölmek için kullanım laboratuvar bant Sineklerin Tanrısı 4 genotip 4 bölüme yastık kadar enjekte için. Mikroskop yakındaki bankta bir kez sinekler panelindeki (bir yastık her köşesinde) dizilmiş şişeleri yer alanları belirleyin.
  2. Şişeleri yaş eşlemeli, 4-7 gün hazırlamak-enjeksiyon için eski, sinekler. Test edilecek her zorlanma için 5 ve 5 erkek hazır sinek gıda taze, etiketli şişe aktarmak ve 25 ° C'de tutmak
  3. Pnömatik enjektör hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) araç 100 ms (kısa patlamaları sınırdışı sub-nanoliter birimleri teslimini sağlayan sıvı-gaz basıncı) zamanlı moduna ayarlayarak.
  4. Mikroskop slaytlar hazırlayın. Elektrik bandı 1.5-inç şeritler kesip, yapışkanlı yüzü bir döngü içine katlayın ve etiketli mikroskop slayt yerleştirin.

3. cam kapiller iğneler hazırlayın

  1. Bir iğne çektirmenin kullanarak cam iğneler (ince duvar cam kılcal) çek.
    1. İğneyi mikroskop altında bir mikrometre ile tutun ve İpucu #5 para cezası nokta paslanmaz çelik cımbız kullanma kesin. 100 µm ipuçları sinek 's kütikül yaralama en aza indirerek delmek yeterlidir.
    2. Her sinek enjekte sıvı hacmi ölçmek. İğne steril % 5 Gıda 1 x PBS boyama yükleyin ve sıvı mineral yağ 0,01 mm sahne mikrometre üzerinde bir damla üstüne çıkarmak.
      Not: sıvı damlacık küresel ise, picoliters birimindeki (boyut)3/1910 hesaplanır. 30 -ecek dışarı atmak bir iğne ile 100 µm çapı ~ 2 nL 100 ms.

4. enjekte sinekler

  1. Parafilm küçük bir kare üzerine 1.6 mg/mL parçacıkların 10 µL pipet.
    1. Sıvı iğne çekin ve mount enjektör meme ( Tablo malzemelerigörmek).
    2. CO2 sinekli anestezi ve ventral tarafı yukarı ve belgili tanımlık yastık önüne doğru odaklı başkanları ile flypad üzerinde onların belirli alanda sıraya girin. Şişeleri tezgah üzerinde karşılık gelen alanlar yerleştirin.
    3. Karın üst köşesinde sinekler sıvı (~ 10 nL toplam) 5, 100 ms pompaları ile enjekte.
    4. Enjekte sinekler için uygun şişeleri aktarmak, şişe üzerinde zaman unutmayın. 25 ° C'de tutmak
  2. Yeni bir iğne % 0,4 ile yük Trypan mavi çözüm.
  3. Pnömatik enjektör hava sıvı iğne dışarı itmek için sürekli bir akış sağlayan geçişli, ayarlayın.
  4. Onlar için 30 dk dinlenmiş sonra sinekler anestezi ve karın tam ve şişmiş olana Trypan mavi ile enjekte.
    Not: phagosome olgunlaşma ile pH duyarlı boya etiketli parçacıkları ile incelerken, sinekler için 1 h dinlenmek izin ve trypan montaj sinekler daha önce mavi ile enjekte değil.
  5. Mount mikroskop kaymak ile elektrik bandı, ventral taraftan uçar. Kanatları anında tarafındaki bastırın ve onları teybe güvenli. Ayrıca, anında hareket emin olmak için teyp baş yavaşça itin.
  6. Hemen adım 5'e taşıyın.

5. görüntüleme uçar

  1. Görüntü uçar, tek bir seferde, 25 x veya 32 x büyütme ( Tablo malzemelerigörmek) bir dijital fotoğraf makinesi ve bilgisayar bağlı bir ters floresan mikroskop kullanarak. Dijital fotoğraf makinesi için bilgisayar yazılımı kullanarak anında dorsal gemi odaklanmak.
  2. Çekim hızı ve büyütme deneyler arasında kaydedin.
    Not: genotip mefhumunu kaybetme bir potansiyel hata birden fazla suşları tek bir oturuşta çekerken kaynağıdır. Sinekler mislabeling önlemek için ilk ve son uç fotoğraf her genotip için görüntü sayısını not edin.

6. miktarının ve floresan normalleştirme

  1. Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı açın ve bir anda bir resim açın.
    1. Dorsal gemi Floresans yoğunluğunu ölçmek. Dorsal geminin bir çokgen çizer. Ölçü birimi seçin ve floresan yoğunluğu çokgen içinde kaydedin.
    2. Arka plan floresan yoğunluğu belirlemek. İlk çokgen kopyalama ve taşıma bir alana anında dorsal gemiye bitişik. Ölçü ve kayıt floresan yoğunluğu arka plan alanını seçin.
    3. Dorsal gemi floresan arka plan Floresans tarafından normalize:
      Dorsal gemi ÷ arka plan.
    4. Ortalama bir yük tüm sinekli dorsal gemi floresan yoğunluğu normalleştirilmiş hesaplayın.
    5. 2 kez daha denemeyi tekrarlamak.
    6. Kullanım bir öğrenci unpaired t-test ortalama göreli Floresans yoğunluklarda kontrol uçar karşılaştırın ve test için üç deneylerden uçar. Formülü kullanarak etkisi boyutu Hesapla: Cohen'in d nerede M1 genotip 1 ortalaması ve M2 genotip 2 ortalaması (M1- M2) ÷ SDhavuza alınan, = &
      SD havuza alınan =figure-protocol-1
      Burada SD1 genotip 1 standart sapmasıdır ve SD2 genotip 2 standart sapmasıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Fluoresein etiketli parçacıkları kullanma içinde vivo fagositoz testin bir şematik şekil 1Aile gösterilir. Sinekler takılı ventral yan aşağı Elektrik bandı bir parçası üzerinde ve dorsal gemi konumlandırıldığı, karın, ilk iki kesimi açıkça görülebilir (şekil 1B). Anahtar kaynakları deneysel hata enjeksiyon ve yordamın (şekil 1 c) adımını Imaging ortaya. Birden çok sinekler enjekte etmek için aynı iğn...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Piyasada bulunan, fluorescently etiketli parçacıklar fagositoz genel (0.2 µm karboksilat-modified mikroküreler) veya fagositoz mikroplar (fluorescently etiketli ısı - veya kimyasal olarak öldürdü bakteri veya Maya) değerlendirmek için kullanılır. Phagosome olgunlaşma değerlendirmek için araştırmacılar pH nötr asidik olduğu gibi phagolysosome inerse fluoresces pH duyarlı boya ile etiketli parçacıklar seçebilirsiniz. Alternatif olarak, fagositoz, patojen tanıma ve alımı ilk adımları incelemek için araştırmacıl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Yazarlar Dr Beth Gonzalez ve Dr Aprajita Garg içinde vivo fagositoz deneyleri yürüten destek için teşekkür ederiz. Bir UBV UMD önceden tohum Grant ve UMD NIH T32 eğitim hibeler, hücre ve moleküler biyoloji (SPK) ve ana bilgisayar-patojen etkileşimleri (HPI), bu eser finanse edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.2μ m Kırmızı Floresan Karboksilat Modifiye FluoSpheresInvitrogenF8810Fagositlerin genel fagositik kapasitesini test etmek için floresan etiketli lateks boncuklar. (~580/~605 nm) PBS'de% 5 boya ile 1:20 oranında seyreltme enjekte edin.
5430-10 PicoNozzle KitiDünya Hassas Aletler5430-101.0mm pipet
E. coli (K-12 Suşu) için Tutucu Biyopartiküller, Alexa Fluor 488 konjugeInvitrogenE13231Öldürüldü E. coli Alexa Fluor 488 ile etiketlenmiştir. Gram negatif bakterilerin fagosit tanımayı ve alımını test etmek için kullanın. (~495/~519 nm)
E. coli (K-12 Suşu) Biyopartiküller, Alexa Fluor 594 konjugeInvitrogenE23370Öldürüldü E. coli Alexa Fluor 594 ile etiketlenmiştir. Gram negatif bakterilerin fagosit tanımayı ve alımını test etmek için kullanın. (~590/~617 nm)
E. coli (K-12 Suşu) Biyopartiküller, Floresein konjugeInvitrogenE2861Öldürülmüş E. coli< / em> FITC (Floresein) ile etiketlenmiştir. Gram negatif bakterilerin fagosit tanımayı ve alımını test etmek için kullanın. (~494/~518 nm)
E. coli (K-12 Suşu) Biyopartiküller, Teksas Kırmızısı konjugeInvitrogenE2863Öldürüldü E. coli Texas Red ile etiketlendi. Gram negatif bakterilerin fagosit tanımayı ve alımını test etmek için kullanın. (~595/~615 nm)
E. coli (K-12 Suşu) Biyopartiküller, Teksas Kırmızısı konjugeInvitrogenE2863Öldürüldü E. coli Texas Red ile etiketlendi. Gram negatif bakterilerin fagosit tanımayı ve alımını test etmek için kullanın. (~595/~615 nm)
İğne Pipet ÇektirmeDavid Kopf AletleriModel 725
pHrodo Red Fagositoz için E. coli BioParticles KonjugatıInvitrogenP35361Öldürüldü E. coli pHrodo Red ile etiketlenmiştir. Gram negatif bakterilerin fagosit reconition'ını, alımını ve fagozom olgunlaşmasını test etmek için kullanın. (~560/~585 nm). Trypan Blue ile söndürmeye gerek yok.
pHrodo Red S. aureus Fagositoz için Biyopartiküller KonjugatıInvitrogenA10010Öldürüldü S. aureus pHrodo Red ile etiketlenmiştir. Gram pozitif bakterilerin fagosit reconition'ını, alımını ve fagozom olgunlaşmasını test etmek için kullanın. (~560/~585 nm). Trypan Blue ile söndürmeye gerek yok.
Pnömatik PicoPump PV820Dünya Hassas AletlerSYS-PV820Dünya Hassas Aletler Pnömatik PicoPump PV820, enjeksiyonlar arasında cam iğnede sıvıyı tutmak için diferansiyel basınçlar kullanır. Kullanıcı, sıvıyı dışarı atmak için kısa gaz basıncı patlamalarını manuel olarak kontrol eder – nanolitre altı hacimlerin verilmesine izin verir. Verilen sıvı miktarı iki ana değişkene bağlıdır – Cam iğne açıklığının büyüklüğü ve enjeksiyon basıncının uygulanma süresi ne kadardır. cihazı 100 ms'ye ayarlayın " ZAMANLANMIŞ" mod.
S. aureus (Protein A'sız Ahşap Suşu) Biyopartiküller, Alexa Fluor 488 konjugeInvitrogenS23371Öldürüldü S. aureus Alexa Fluor 488 ile etiketlenmiştir. Gram pozitif bakterilerin fagosit tanımayı ve alımını test etmek için kullanın. (~495/~519 nm)
S. aureus (Protein A içermeyen Ahşap Suşu) Biyopartiküller, Alexa Fluor 594 konjugeInvitrogenS23372Öldürüldü S. aureus Alexa Fluor 594 ile etiketlenmiştir. Gram pozitif bakterilerin fagosit tanımayı ve alımını test etmek için kullanın. (~590/~617 nm)
S. aureus (Protein A'sız Ahşap Suşu) Biyopartiküller, Floresein konjugatıInvitrogenE2851Öldürüldü S. aureus FITC (Floresein) ile etiketlenmiştir. Gram pozitif bakterilerin fagosit tanımayı ve alımını test etmek için kullanın. (~494/~518 nm)
İnce Duvar Cam Kılcal DamarlarDünya Hassas AletlerTW100F-3Enjeksiyon için İğneler. OD = 1.0 mm
Tripan Mavisi Çözeltisi (% 0.4)SigmaT8154Floresein, Alexa Fluor veya Texas Red etiketli parçacıkların hücre dışı floresansını söndürmek için kullanılır.
ZEISS SteREO Mikroskop (Discovery.V8)ZeissSteREO Discovery.V8Sinekleri görüntülemek için ters floresan mikroskobu. Fotoğraf çekmek için bir dijital kamera (örn.ample: AxioCam HC kamera) ve beraberindeki yazılımı (örn.ample: AxioVision 4.7 yazılımı) kullanın.
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioPartiküller, Alexa Fluor 488 konjugeInvitrogenZ23373Alexa Fluor 488 ile etiketlenmiş öldürüldü. Fagosit tanıma ve maya alımını test etmek için kullanın. (~495/~519 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioPartiküller, Alexa Fluor 594 konjugeInvitrogenZ23374Alexa Fluor 594 ile etiketlenmiş öldürüldü. Fagosit tanıma ve maya alımını test etmek için kullanın. (~590/~617 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) Biyopartiküller, Floresein konjugeInvitrogenZ2841FITC (Fluorescein) ile etiketlenmiş olarak öldürüldü. Fagosit tanıma ve maya alımını test etmek için kullanın. (~494/~518 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioPartiküller, Texas RedInvitrogenZ2843Texas Red ile etiketlenmiş olarak öldürüldü. Fagosit tanıma ve maya alımını test etmek için kullanın. (~595/~615 nm)

Kaynaklar

  1. Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124 (4), 783-801 (2006).
  2. Kim, D. Studying host-pathogen interactions and innate immunity in Caenorhabditis elegans. Disease Models & Mechanisms. 1 (4-5), 205-208 (2008).
  3. Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annual Review Immunology. 25, 697-743 (2007).
  4. Wu, L. P., Choe, K. M., Lu, Y., Anderson, K. V. Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection. Genetics. 159 (1), 189-199 (2001).
  5. De Gregorio, E., Spellman, P. T., Tzou, P., Rubin, G. M., Lemaitre, B. The Toll and Imd pathways are the major regulators of the immune response in Drosophila. EMBO Journal. 21 (11), 2568-2579 (2002).
  6. Michel, T., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A., Royet, J. Drosophila Toll is activated by Gram-positive bacteria through a circulating peptidoglycan recognition protein. Nature. 414 (6865), 756-759 (2001).
  7. Choe, K. M., Werner, T., Stoven, S., Hultmark, D., Anderson, K. V. Requirement for a peptidoglycan recognition protein (PGRP) in Relish activation and antibacterial immune responses in Drosophila. Science. 296 (5566), 359-362 (2002).
  8. Wu, J., Randle, K. E., Wu, L. P. ird1 is a Vps15 homologue important for antibacterial immune responses in Drosophila. Cellular Microbiology. 9 (4), 1073-1085 (2007).
  9. Lemaitre, B., Nicolas, E., Michaut, L., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A. The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults. Cell. 86 (6), 973-983 (1996).
  10. Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (20), 7257-7262 (2005).
  11. Lemaitre, B., et al. A recessive mutation, immune deficiency (imd), defines two distinct control pathways in the Drosophila host defense. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 92 (21), 9465-9469 (1995).
  12. Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection. EMBO Reports. 1 (4), 353-358 (2000).
  13. Meister, M., Lagueux, M. Drosophilablood cells. Cellular Microbiology. 5 (9), 573-580 (2003).
  14. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annual Review Pathology. 7, 61-98 (2012).
  15. Anderson, R. A., Sando, G. N. Cloning and expression of cDNA encoding human lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase. Similarities to gastric and lingual lipases. Journal of Biological Chemistry. 266 (33), 22479-22484 (1991).
  16. Ross, G. D., Reed, W., Dalzell, J. G., Becker, S. E., Hogg, N. Macrophage cytoskeleton association with CR3 and CR4 regulates receptor mobility and phagocytosis of iC3b-opsonized erythrocytes. Journal of Leukocyte Biology. 51 (2), 109-117 (1992).
  17. Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. S. Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila. Current Biology. 10, 781-784 (2000).
  18. Ramet, M., Pearson, A. M., Manfruelli, P., Li, X., Koziel, H., Gobel, V. Drosophila Scavenger Receptor CI Is a Pattern Recognition Receptor for Bacteria. Immunity. 15 (6), 1027-1038 (2001).
  19. Ramet, M., Manfruelli, P., Pearson, A. M., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).
  20. Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection. Science. 309, 1251-1253 (2005).
  21. Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309 (5738), 1248-1251 (2005).
  22. Stuart, L. M., et al. Response to Staphylococcus aureus requires CD36-mediated phagocytosis triggered by the COOH-terminal cytoplasmic domain. Journal of Cell Biology. 170 (3), 477-485 (2005).
  23. Stroschein-Stevenson, S. L., Foley, E., O’Farrell, P. H., Johnson, A. D. Identification of Drosophila gene products required for phagocytosis of Candida albicans. PLoS Biology. 4 (1), e4(2006).
  24. Kocks, C., et al. Eater, a transmembrane protein mediating phagocytosis of bacterial pathogens in Drosophila. Cell. 123 (2), 335-346 (2005).
  25. Nehme, N. T., et al. Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections. PLoS One. 6 (3), e14743(2011).
  26. Garver, L. S., Wu, J., Wu, L. P. The peptidoglycan recognition protein PGRP-SC1a is essential for Toll signaling and phagocytosis of Staphylococcus aureus in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (3), 660-665 (2006).
  27. Garg, A., Wu, L. P. Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus. Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).
  28. Gonzalez, E. A., Garg, A., Tang, J., Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. A glutamate-dependent redox system in blood cells is integral for phagocytosis in Drosophila melanogaster. Current Biology. 23 (22), 2319-2324 (2013).
  29. Nazario-Toole, A. E., Robalino, J., Okrah, K., Corrada-Bravo, H., Mount, S. M., Wu, L. P. The Splicing Factor RNA-Binding Fox Protein 1 Mediates the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster. Journal of Immunology (Baltimore, Md: 1950). 201 (4), 1154-1164 (2018).
  30. Guille, M. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus and Zebrafish. , Springer Science & Business Media. (1999).
  31. Koundakjian, E. J., Cowan, D. M., Hardy, R. W., Becker, A. H. The Zuker collection: a resource for the analysis of autosomal gene function in Drosophila melanogaster. Genetics. 167 (1), 203-206 (2004).
  32. Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes. Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).
  33. Brennan, C. A., Delaney, J. R., Schneider, D. S., Anderson, K. V. Psidin is required in Drosophila blood cells for both phagocytic degradation and immune activation of the fat body. Current Biology. 17 (1), 67-72 (2007).
  34. Akbar, M. A., Tracy, C., Kahr, W. H., Kramer, H. The full-of-bacteria gene is required for phagosome maturation during immune defense in Drosophila. Journal of Cell Biology. 192 (3), 383-390 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Drosophila Fagositozun Vivo DeneyiHemosit zolasyonuFloresan MikroskopiTripan Mavisi BoyamaGenetik TaramaPartik l Al mKonfokal MikroskopiAk Sitometrisi

İlgili makaleler