Yöntem makalesi

Nükleazsız Oksijen Çöpçü Protocatechuate 3,4-Dioksijenaz İfadesi ve Saflaştırma

5.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/59599

⸱

8 Kasım 2019

 ,  ,  , 
1Cancer Biology and Genetics, College of Medicine, The Ohio State University

Bu makalede

Özet

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) enzimatik substrat protokatechuic asit kullanarak sulu bir sistemden serbest diatomik oksijen kaldırabilirsiniz (PCA). Bu protokol, bu oksijen atma enziminin ekspresyonu, saflaştırılması ve aktivite analizini açıklar.

Özet

Tek moleküllü (SM) mikroskopi florofor etiketli biyomoleküllerin dinamik moleküler etkileşimlerinin gerçek zamanlı olarak incelenmesinde kullanılır. Ancak, floroforlar çözünmüş oksijen (O2)ile fotobeyazrlama yoluyla sinyal kaybına yatkındır. Fotobeyaztma önlemek ve florofor ömrünü uzatmak için, oksijen atma sistemleri (OSS) O2azaltmak için istihdam edilmektedir. Ticari olarak kullanılabilen OSS, nükleik asitlere zarar veren veya bozan nükleazlar tarafından kontamine olabilir, deneysel sonuçların şaşırtıcı yorumu. Burada, saptanabilir nükleaz kontaminasyonu olmayan son derece aktif Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioksijenaz (PCD) ifadesi ve saflaştırılması için bir protokol ayrıntılı. PCD verimli substrat protocatechuic asit dönüşüm tarafından reaktif O2 türler kaldırabilirsiniz (PCA) 3-karboksi-cis, cis-muconic asit. Bu yöntem, O2'nin veri toplamada zararlı bir rol oynadığı herhangi bir sulu sistemde kullanılabilir. Bu yöntem, ticari olarak mevcut PCD ile karşılaştırıldığında son derece aktif, çekirdeksiz PCD üretiminde etkilidir.

Giriş

Tek moleküllü (SM) biyofizik, biyolojik fenomenlere bakış ını değiştiren hızla büyüyen bir alandır. Bu alan, fiziğin ve kimyanın temel kanunlarını biyolojiye bağlama yeteneğine sahiptir. Floresan mikroskopi SM duyarlılığı elde edebilirsiniz bir biyofiziksel yöntemdir. Floresan küçük organik floropores veya kuantum nokta 1 onları bağlayarak biyomolekülleri tespit etmek içinkullanılır. Bu moleküller geri dönüşümsüz2fotobeyazlatma önce lazerler tarafından heyecanlı fotonlar yontabilir. Fotobeyazrlama floresan etiketler istenilen dalga boyu2,3de heyecanlandırmak için yeteneklerini yok kimyasal hasar geçmesi oluşur. Sulu tampon reaktif oksijen türlerinin varlığı (ROS) fotobeyazrlama birincilnedeni 2,4. Ayrıca, ROS biyomoleküllere zarar verebilir ve SM deneylerinde hatalı gözlemlere yol açabilir5,6. Oksidatif hasarı önlemek için oksijen atma sistemleri (OSS)3,7,8kullanılabilir. Glikoz oksidaz/ katalaz (GODCAT) sistemi oksijen kaldırma da etkilidir8, ama ara olarak potansiyel olarak zararlı peroksitler üretir. Bunlar SM çalışmalarında ilgi biyomoleküllere zarar verebilir.

Alternatif olarak, protocatechuate 3,4 dioksijenaz (PCD) verimli bir substrat protocatechuic asit kullanarak sulu bir çözelti O2 kaldıracak (PCA)7,9. PCD, PCA'yı koordine etmek ve çözünmüş O210kullanarak kateşol halka açma reaksiyonunu katalize etmek için hemesiz demir kullanan bir metalloenzimdir. Bu bir adım reaksiyonS deneyleri florofor stabilitesini artırmak için genel olarak daha iyi bir OSS olduğu gösterilmiştir7. Ne yazık ki, PCD de dahil olmak üzere birçok ticari OSS enzimleri, kontamine nükleaz lar içerir11. Bu kirleticiler, SM deneylerinde kullanılan nükleik asit bazlı yüzeylerin zarar görmesine yol açabilir. Bu çalışma, SM sistemlerinde rekombinant PCD kullanımı için kromatografi tabanlı bir arıtma protokolü açıklayacaktır. PCD, ROS'un veri toplama için gereken yüzeylere zarar kaynağı olduğu tüm denemelere genel olarak uygulanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. E. coli PCD ifade neden

  1. Bir tüpte 1 μL pVP91A-pcaHG PCD ekspresyonu plazmid (20 ng/μL, Şekil 1A)ve 20 μL E.coli BL21 (20 μL ticari olarak kullanılabilen hücreler, > 2 x 106 cfu/μg plazmid) birleştirin. Karıştırmak için tüpü hafifçe çırpın. Tüpü buza 5 dk yerleştirin.
  2. Dönüşümü 30 s için 42 °C'ye yerleştirin. Sonra buz 2 dk.
  3. 80 μL SOC media ekleyin (katabolit baskılı süper optimal et suyu: 2,5 mM KCl, 10 mM NaCl, %2 tripton, %0.5 maya ekstresi, 10 mM MgSO4, 10 mM MgCl2, 20 mM glukoz). 1 saat için min (rpm) 37 °C başına 225 devirde çalkalayın.
  4. PLAKA LB Amp Agar üzerinde dönüşüm reaksiyonu (1L Luria Broth agar: 10 g NaCl, 10 g bacto-tripto, 5 g maya ekstresi, 15 g agar, 50 μg/mL ampillin; 25 mL 10 cm çapında petri çanak başına).
  5. Plakayı kuluçkaya yatırın, kapağı aşağı bakacak şekilde, 37 °C'de 16-18 saat boyunca.
  6. İnokül 50 mL LB Amp (1L LB: 10 g bacto-tripto, 10 g NaCl, 5 g maya ekstresi, 50 g/mL ampisilin) 250 mL Erlenmeyer şişesinde bir koloni ile. 37 °C'de 16-18 saat boyunca 225 rpm'de titreyerek kuluçkaya yat.
  7. 20 mL kültürünü 1 L LB Amp'li 4 L şişeye aktarın. 37 °C'de 225 rpm'de çalkalayın.
  8. Her h kültür OD600 (600 nm optik yoğunluğu) ölçmek. Kültür OD600 0,5'e yaklaştıkça, ölçüm lerin sıklığını her 15 dakikaya kadar artırın. Kültürün istenilen yoğunluğu 0.5 OD600'dür.
  9. 4L şişeyi bir buz kutusuna aktarın. Kültür sıcaklığını azaltmak için şişeyi buz banyosunda döndürün.
    Not: Hücrelerin metabolik olarak aktif kalması için buzdaki zaman minimumda tutulmalıdır. İdeal olarak hücreler 10 dakikadan daha az buz üzerinde olacaktır.
  10. Başarılı PCD indüksiyonu sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) analizi ile görülebilir. Bir tüp içinde uninduced kültür Hasat 1 mL. Numuneyi 1 dk 14.000 x g'de ortam sıcaklığında bir mikrofuge döndürün. Süpernatant'ı decant.
    1. 150 μL PBS (fosfat tamponlu salin) peletli hücreleri solubilize.
    2. Eşit hacimli 2X yükleme boyası (%1.2 SDS, %30 gliserol, 150 mM Tris-HCl, pH 6.8, %0.0018 bromofenol mavisi, %15 β-mercaptoetanol) ekleyin. Girdap örnek iyice karıştırmak için.
    3. 3 dk için kaynatın ve buz aktarın. Numune ileride analiz için -20 °C'lik bir dondurucuda saklanabilir.
      Not: PBS, CaCl2 ve MgCl2ile veya Olmadan ticari olarak kullanılabilir. Birçok laboratuvarda hücre kültürü yöntemleri için CaCl2 ve MgCl2 olmadan PBS olacaktır. Biz veya CaCl 2 ve MgCl2 olmadanPBS ile hiçbir fark bulduk.
  11. 4 L şişeyi 17 °C'de 180 rpm sallayarak bir kuvöze aktarın. Her 20 dakikada bir OD600'ü izlemeye devam edin.
  12. At 0.7 OD600 izopropil-beta-D-tiogalactopyranoside ekleyin (IPTG) 0.5 mM son konsantrasyon (0.25 M stok çözeltisi) ve 10 mg / L amonyum demir (II) sülfat heksahidrat (Fe(NH4)2(SO4)2, 10 mg /mL stok çözeltisi). PCD genleri pcaH ve pcaG IPTG eklenmesi ile T5 organizatörü indüklenir (Şekil 1A). Demir sülfat PCD ile bağlanır ve kateşol açılması sırasında oksijen koordine ederek katalitik aktivite için gereklidir.
  13. 180 rpm 17 °C'de 18 saat boyunca kültürü salla.
  14. 1.2 gibi buz içinde kültür şişesi yerleştirin. SDS-PAGE için indüklenen hücrelerin 1 mL'sini 1.3'te olduğu gibi hasat edin.
  15. Santrifüj için uygun şişelere bakteri kültürünü dökün. A 1 L kültür 4 250 mL konik alt şişesantrik olabilir. Pellet kültür 4 °C'de 20 dk için 3000 x g. Decant supernatants. Bakteriyel sıvı atıkları uygun şekilde atın.
  16. 1 L kültür başına 25 mL soğuk PBS (CaCl2 ve MgCl2 isteğe bağlıdır) peletleri askıya almak için pipet.
  17. Resuspension'ı 50 mL konik tüplere (1 L kültürde 1 50 mL tüp) aktarın. 4 °C'de 20 dk için 3000 x g'daki hücreleri peletleyin. Supernatant decant ve uygun şekilde atın.
  18. 10 mL lysis tampon (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 20 mM imidazol, %10 gliserol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptin ve 87.1 μg/mL feniltilülfoniloride (Pt) borusu ile hücreleri yeniden askıya alın. Bir Dewar şişesinde sıvı nitrojen ile süspansiyon dondurun. Örnek tüpleri -80 °C'lik bir dondurucuda saklayın. -80 °C'de saklanan peletlerden pcd'yi bir yıl boyunca arındık ve belirgin bir aktivite kaybı olmadı.
  19. SDS-PAGE tarafından indüklenmemiş ve indüklenen hücreleri karşılaştırın.
    Not: Biz PCD heterodimer indüksiyon ile herhangi bir zorluk vardı. Ancak, herhangi bir reaktifin beklenmedik bir şekilde süresidolduğunda saflaştırmaya devam etmeden önce tümevarımı test etmenizi öneririz.
    1. SDS-PAGE (boyutlar: 7,3 cm x 8,3 cm x 0,75 mm kalınlığında) için plakaları monte edin. İstifleme jeli 1.5 mL %6 poliakrilamid (%6 akrilamid, 125 mM Tris-HCl, pH 6.8, %0.1 SDS, %0.1 amonyum persülfat, %0.001 TEMED) dir. Çözücü jel 3.5 mL %12 poliakrilamid (%12 akrilamid, 375 mM Tris-HCl, pH 8.8, 0.1% SDS, %0.1 amonyum persülfat, %0.001 TEMED) İstifleme katmanına 10 kuyu tarak takın.
    2. 10 μL'lik indüklenmemiş ve indüklenen bakteri örnekleri yükleyin. Proteinler için 4 μL prestained moleküler ağırlık belirteçleri yükleyin (Şekil 1B).
    3. Jeli 16,5 V/cm'de yaklaşık 1 saat elektrofore edin. Bromofenol mavisi jelin dibine ulaşmalıdır.
    4. Jeli Plastik bir küvete Coomassie Blue lekeye (%10 asetik asit, %40 metanol, %0.1 Coomassie Blue boya) yerleştirin. Leke tamamen jel batırmak gerekir. 20 dk. Boyama sırasında hafif rotasyon için ortam sıcaklığında leke isteğe bağlıdır.
    5. Çözeltiyi destain (%10 asetik asit, %40 metanol) ile değiştirin. Protein bantları kolayca görünene kadar isteğe bağlı hafif rotasyon ile ortam sıcaklığında kuluçka.
    6. Destain'i deiyonize su ile değiştirin. Bakteriyel proteinler arasında indüklenen PCD alt birimleri indüklenen hücrelerde görülmelidir. Heksahistidin etiketli PCD alt birimi pcaH 28.3 kDa moleküler ağırlığa sahiptir ve pcaG alt birimi 22.4 kDa'dır. PCD alt birimleri belirgin değilse, yeni bir koloniden türetilen yeni bir indüksiyon yapılmalıdır.

2. PCD nikel afinite kromatografi saflaştırma

  1. Buz üzerinde çözülme bir 50 mL indüklenen hücrelerin tüp. Numunenin tamamen çözülmesi 2-3 saat sürebilir.
  2. Tüpü buzda tutmak, numuneyi 1 dk boyunca %30 genlikte sonicate, 1'leri açık ve kapalı bir şekilde bisiklete bindirin. Konik mikro uç (çapı 0,125 inç) sonicator kullanın. Maksimum güç 400 W ve frekans 20 kHz ve 1 L kültür pelet başına.
  3. Sonication sonra, 0.2 mg / mL son konsantrasyon (10 mg / ml stok çözeltisi) ve 4 ° C'de 30 dakika buz üzerinde tutmak için lysozyme ekleyin.
  4. Önceden soğutulmuş polikarbonat şişesine (boyutlar: 25 mm x 89 mm) bakteriyel lizatı dökün. Şişe sabit açılı ultracentrifuge rotor ile uyumlu olmalıdır. Diğer tüpler ve/veya rotorlar değiştirilebilir, ancak son yerçekimi kuvveti korunmalıdır.
  5. 4 °C'de 120.000 x g'de 60 dk santrifüj. Hücresel enkaz bir pelet oluşturacak. Süpernatant sarı görünebilir.
    1. Pelet, PCD'nin çözünürlüğünü belirlemek için sonraki SDS-PAGE analizine dahil edilebilir (Şekil 1B). 10 mL PBS girdap tarafından pelet solubilize. 150 μL'yi 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Örneği 1.3'te olduğu gibi SDS-PAGE için hazırlayın.
  6. Soğuk bir 50 mL konik tüp için supernatant dökün. Ses düzeyine dikkat edin. Süpernatantın bakteriyel DNA ile kontaminasyonu viskoz bir örnek verebilir. Bakteriyel genomik DNA kolon akışını engelleyebilir. Ultracentrifugation adım 2.2 bakteri DNA pelet için tekrarlanmalıdır. Bu ikinci dönüşten bir pelet kolayca görülemeyebilir veya saydam olabilir.
  7. 500 mL Ni Tampon A (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 ve %10 gliserol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptin, ve 87.1 μg/mL PMSF) ve 500 mL Ni Tampon B (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, %10 gliserol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptin ve 87.1 μg/mL PMSF, 250 mM imidazol, p.8H). Her iki Ni Tamponu da 0,2 m'lik gözenek filtrelerinden geçirin.
  8. Numune, tamponlar ve FPLC (hızlı protein sıvı kromatografisi) sistemi 4 °C'de buzdolabında bulunan bir odadadır. Yıkama pompası A Ni Tampon A ve Ni Tampon B ile B pompası. Uv ve iletkenlik stabilize kadar 20 mM imidazol (%8 Ni Tampon B, % 92 Ni Tampon A) ile sistemi yıkayın. 1,0 MPa basınç limiti ile düzenli olarak 5 mL/dk'da akış tamponları yapıyoruz. Akış hızı ve basınç limiti kullanılan FPLC cihazının özelliklerine göre belirlenmelidir.
  9. 1,5 mL nikel yüklü reçine (boyutlar: 110 mm uzunluğunda x 5 mm) içeren bir kolon hazırlayın. Reçine bağlama kapasitesi 50 mg/mL olup 1 MPa basıncı tolere edebilir. Arınmadan önce bir sütun 4 °C'de dökülebilir ve saklanabilir.
    Not: Daha fazla protein gerekirse, sütunun boyutu orantılı olarak indüklenen hücrelerin birden fazla 50 mL tüp karşılamak için artırılabilir. Biz artık proteinler in istenilen protein kontamine sağlamak için her hazırlık için taze bir sütun tercih ediyoruz. Ancak, nikel reçineler üreticinin talimatlarına göre geri dönüştürülebilir.
  10. Nikel yüklü reçine sütununu FPLC'ye takın. 20 mL%92 Ni Tampon A ve %8 Ni Tampon B (20 mM imidazol) 0,5 mL/dk'da 0,5 MPa basınç limiti ile kolon üzerinden dengeleyin. Gerçek zamanlı olarak FPLC A280 (280 nm UV absorbans) yanı sıra iletkenlik ölçmek gerekir. Bu değerler sütundan 20 mL'lik hacim geçtikten sonra sabitlenmediyse, arabellekleri stabilize olana kadar akar.
  11. Numuneyi 0,15 mL/dk.'da kolona (~10 mL) yükleyin. Basınç limitini 0,5 MPa olarak ayarlayın. Akışı toplayın.
  12. 20 mM imidazol (%92 Ni Tampon A ve %8 Ni Tampon B) kolonu 20 mL Ni Tampon ile yıkayın. Analiz için yıkamayı 50 mL'lik bir tüpte saklayın. Kolon %50 Ni Tampon A ve %50 Ni Tampon B (125 mM imidazol) ile 15 mL yıkayın. 0,8 mL hacminin 19 fraksiyonu halinde elüsasyon toplayın. Kolon %15 mL %100 Ni Tampon B ile yıkayın. Bazı PCD heterodimer% 50 Ni Tampon B yıkama da elute olacak, ama heterodimer çoğunluğu% 100 Ni Tampon B yıkama da elute olacaktır.
  13. PCD varlığını doğrulamak için% 12 SDS-PAGE jelleri üzerinde toplanan kesirler analiz. A280 kesirler üzerinden akış, yıkama ve tepe eşit hacimlerde 2X yükleme boya ekleyin. 3 dk. Buza aktarın. Pour iki% 12 SDS-PAGE jelleri (adım 1.7 gibi). 1.7'de açıklandığı gibi jel yöntemini tekrarlayın.

3. Nükleaz aktivitesi tsede

  1. SDS-PAGE analizine dayanarak, neredeyse saf PCD içeren nikel afinite fraksiyonlarını tanımlayın. Reaksiyon tamponunda (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.1 mM DTT) 50 μL son hacmi ile 500 ng 3 kb süpercoilli plazmid pXba+ birleştirin.
    1. 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
    2. Negatif kontrol (ilave protein yok) ve pozitif kontrol (ticari olarak kullanılabilen PCD) ekleyin. 10 μL stop çözeltisi (150 mM EDTA, pH 8.0, %0.6 SDS, %18 gliserol, %0.15 Portakal G) ile reaksiyonu durdurun.
    3. Numuneler daha sonra analiz edilsince -20 °C'lik bir dondurucuda saklanabilir. Supercoiled ve rahat daire reaksiyon ürünleri agarose jel elektroforez ile çözülebilir sürece herhangi bir supercoiled plazmid bir nükleaz tsay kullanılabilir.
  2. 1X TAE ethidium tamponuna (40 mM Tris-asetat, 1 mM EDTA, 0.5 μg/mL ethidium bromür) 120 mL %1 agarose jel dökün ( boyutlar: 15 x 10 cm). 15 iyi tarak kullanın (iyi boyutlar: 5mm x 1,5 mm). Jel ayarlandığında, 1X TAE ethidium tampon batırın.
  3. Agarose jel ile reaksiyonların 30 μL analiz. Yaklaşık 1 saat ortam sıcaklığında 10 V/cm'de elektrofore. Turuncu G boya ön jel sonunda olmalıdır.
  4. Jelin ethidyum bromür sinyalini hemen görüntülemek için bir floresan tarayıcı kullanın. 3 kb plazmid kullanılırsa, en yavaş bant ~3,5 kb'de rahat daireler, lineer DNA 3 kb'de çalışacak ve supercoiled plazmid ~2 kb'de en hızlı hareketliliğe sahip olacaktır.
    1. Görüntü analizi yazılımı ile her şeridin toplam piksel hacmini hesaplayın.
    2. Süper kıvrılmış, doğrusal ve çentikli daireler gibi çeşitli DNA türlerinin piksel hacmini belirleyin. Her DNA türünün yüzdesini belirlemek için bu değerleri kullanın. Örneğin, negatif kontrolile karşılaştırıldığında bir kesir ile ilişkili çentikli dairelerin artan varlığı nükleaz varlığını gösterir. Bir şeritteki çentikli dairelerin piksel hacmi toplam DNA piksel değerine bölünür. Bu sayıyı 100 ile çarparak bir yüzde belirleyin.
  5. SDS-PAGE analizine dayalı olarak neredeyse saf PCD heterodimer içeren ve tespit edilemeyen nükleaz aktivitesine en az sahip olan ikinci elution zirvesinden kesirleri birleştirin. Bizim tipik havuzlu hacmi ~ 2 mL olduğunu.
  6. Numuneyi 10 kDa moleküler ağırlık kesme ile bir santrifüj filtre ünitesine yükleyin. 4 °C'de 40 dk için 4000 x g'de sallanan kova santrifüjde santrifüj. Alternatif olarak 4 °C'de 20 dk için 7500 x g'de 35° sabit açılı rotor kullanılabilir.
    1. Son retentat hacmi 100-200 μL olana kadar santrifüjtekrarlayın.
    2. Filtre ünitesini ters çevirin ve 4 °C'de 2 dk için 1000 x g'de santrifüj ile retentat'ı geri getirin.

4. PCD'nin boyut dışlama kromatografisi saflaştırması

  1. 250 mL boyutunda dışlama kromatografisi (SEC) çalışan tampon (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10% gliserol, 0,1 mM EDTA, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptin ve 87.1 μg/mL PMSF) yapın. Tamponu 0,2 m'lik gözenek filtresinden geçirin ve 4 °C'de saklayın.
    Not: Tüm adımları 4 °C'de buzdolabında bir odada gerçekleştirin. SEC arınması isteğe bağlıdır, ancak protein sec çalışan tampon depolanmalıdır. SEC arınma atlanırsa, retentate 3.6.2 toplanır. 10 kDa MWCO (molekül ağırlığı kesilmiş) diyaliz tüpünde bir gecede 1 L'lik SEC tamponuna karşı diyalize sayılmalı.
  2. Çapraz bağlı agarose SEC (boyut dışlama kromatografisi) sütunu (dimesions: 10 mm x 300 mm; 24 mL yatak hacmi; 25 - 500 μL numune hacmi; 1,5 MPa basınç sınırı; 2 x 106 Da dışlama sınırı; 1 ila 300 kDa ayırma) SEC Çalışan Tamponile 0,5 mL/dk.'da dengeleyin.
    Not: İstenirse alternatif boyutlu SEC sütunları kullanılabilir.
  3. Konsantre kesirleri 200 μL hacim enjeksiyon döngüsüne yükleyin. Numuneyi 0,5 mL/dk'da kolona yükleyin. SEC çözünürlüğü daha küçük yük hacmiyle artar. 23 mL SEC çalışan tampon ile elute ve 250 μL 94 fraksiyonları toplamak. SEC kromatogram pcd heterodimer tek bir A280 tepe çözmelidir. PCD'nin 8.9 mL'yi elediğini görüyoruz. Elüsasyon zamanlaması alternatif SEC sütunları ile değişecektir.

5. PCA oksidasyon ve nükleaz aktivitesi tahlilleri

  1. PCA'nın hem oksidasyonu hem de nükleaz aktivitesinin tetkiklerine verilen reaksiyonlar 96 kuyulu düz alt plakada gerçekleştirilir. Erken katalizi önlemek için 4 °C soğuk bir odada buz üzerinde 96 kuyu plaka reaksiyonları monte. 50 μL son hacmi nde birleştirin: 130 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl2, 0.1 mM DTT, 5 mM PCA, 10 ng/mL supercoiled plasmid pXba+, ve 10 μL bireysel PCD SEC fraksiyonları.
    Not: PCD SEC fraksiyonları son ve hemen analiz den önce protein eklenme sırasında kataliz başlayacak olarak eklenmelidir.
  2. PCA PCD oksidasyonu 290 nm (A290)PCA azaltılmış absorbasyon sonuçları. 96 kuyu plakasını, 37 °C'lik bir iç sıcaklığa ayarlı bir plaka okuyucunun plaka tutucusuna aktarın. Plaka tutucuyu aletin içine geri alın ve A290'ı 20 s aralıklarla 1 saat ölçün. Aletin her okumadan önce plakayı 5 s sallatsın.
  3. 1 saat sonra 10 μL stop çözeltisi (150 mM EDTA, pH 8.0, %0.6 SDS, %18 gliserol, %0.15 Portakal G) ekleyerek reaksiyonları sonlandırın.
  4. Hazırlamak, yüklemek ve adım 3.2 gibi bir agarose jel çalıştırın.
  5. Görüntü ve adım 3.3 gibi agarose jel analiz.
  6. -80 °C'de uzun süreli depolama için en fazla PCA oksidasyon aktivitesine ve gözlenen nükleaz kontaminasyonuna sahip fraksiyonları seçin. A280'iölçün.
  7. 734.700 M -1 cm-1'likyok olma katsayısı (ε280)a280 ve yok olma katsayısını kullanarak toplam PCD konsantrasyonu hesaplayın.
  8. Sıvı nitrojen de bireysel fraksiyonları tutturmak. -80 °C'lik bir dondurucuda saklayın. Alternatif olarak, aktif, nükleaz içermeyen kesirleri birleştirin, aliquot, ve aynı şekilde dondurma. Bizim tipik verim L kültür başına 1-2 mg PCD olduğunu. Bir SM deneyinde tipik kullanım 3 μg PCD'dir. -80 °C'de depolanan PCD'yi 1 yıla kadar kullandık ve aktivitede azalma yok.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Ticari olarak mevcut oksijen çöpçü PCD sık sık bir DNA nükleaz ile kontamine olduğunu. Nükleaz aktivitesinin kontamine floresan çalışmalarda sahte sonuçlara yol açabilir, özellikle DNA veya DNA etkileşimproteinleri analiz çalışmalar. Biz rekombinant PCD bulduk, heksahistid etiketli pcaH ve pcaG heterodimer, E. coli ifade edilebilir (Şekil 1). Heterodimer ilk olarak nikel afinite kromatografisi ile saflaştırılır (Şekil 2). PCD imi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Oksijen atma sistemleri genellikle tek moleküllü floresan mikroskobu nda fotobeyaztma azaltmak için3,7,8dahildir. Bu mikroskopteknikleri genellikle nükleik asitler veya nükleik asitler 1 ,13,14ile protein etkileşimleri gözlemlemek için kullanılır. OSS'lerin nükleazlarla kirlenmesi sahte sonuçlara yol açabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma NIH GM121284 ve AI126742 tarafından KEY'e desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2-MerkaptoetanolSigma-AldrichM3148ve beta; ME
%30 akrilamid ve bis-akrilamid çözeltisi, 29:1Bio-Rad161-0156
Asetik asit, Buzul Sertifikalı ACSFisherl ChemicalA38C-212
Agar, GranülBD BiosciencesDF0145-17-0
AKTA FPLC SistemiGE Sağlık Yaşam BilimleriAKTA Arıtıcı: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900 ve Frac-920
Amicon Ultra-2 Santrifüj Filtre ÜnitesiEMD MilliporeUFC201024 10 kDa MWCO
Amonyum demir (II) sülfat hekzahidratSigmaF-2262
Amonyum Persülfat (APS) TabletleriAmrescoK833-100TABS
AmpisilinAmresco0339-25G
Bacto TriptonBD BiosciencesDF0123173
BD Bacto Susuz Kültür Ortamı Katkı Maddesi: Şişe Maya ÖzüVWR90004-092
BIS-TRIS propan, >=%99,0 (titrasyon)Sigma-AldrichB6755-500G
Bromofenol MavisiSigma-AldrichB0126-25G
Coomassie Parlak MaviAmresco0472-50G
Costar 96– Peki Düz– Alt ÇED PlakasıBio-Rad2240096EDU
DTTP212121SV-DTT
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu 500MLSigma-AldrichD8537-500ML
PBS Etidyum bromürThermo Fisher ScientificBP1302
GliserolFisher ScientificG37-20
Granül LB Suyu MillerEMD Biosciences1.10285.0500
Yüksek Çözünürlüklü Standart AgarozluAGTC BiyoürünlerAG500D1
İmidazolSigma-AldrichI0250-250G
IPTGGoldbioI2481C25
LeupeptinRoche11017128001
Lizozim Tavuk Yumurtası BeyazıSigma-AldrichL6876-1G
Magnezyum Klorür HeksahidratAmresco0288-1KG
Mikrohacimli Spektrofotometre, küvet özellikliThermo FisherND-2000C
NaClP212121RP-S23020
Ni-NTA Süper Akış (100 ml)Qiagen30430
Novagen BL21 Yetkin HücrelerEMD Millipore69-449-3SOC ortamı dahildir
Turuncu GFisher Scientific0-267
PepstatinAltın BiyoteknolojiP-020-25
PMSFAmresco0754-25G
Protokatekuik asitFisher ScientificICN15642110PCA
Sodyum dodesil sülfatP212121CI-00270-1KG
SpectraMax M2 MikroplakaOkuyucu Moleküler Cihazlar
PES Membranlı Steril Tek Kullanımlık Filtre Üniteleri > 250mLThermo Fisher Scientific09-741-04
PES Membranlı Steril Tek Kullanımlık Filtre Üniteleri > 500mLThermo Fisher Scientific09-741-02
Superose 12 10/300 GLGE Sağlık Yaşam Bilimleri17517301
TEMEDAmresco0761-25ML
Tris Ultra SafGojira İnce KimyasallarUTS1003
Typhoon 9410 değişken modlu floresan görüntüleyiciGE Healthcare Yaşam Bilimleri
UltraPure EDTAInvitrogen/Gibco15575
ZnCl2Sigma-Aldrich208086

Kaynaklar

  1. Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. Detection of single fluorescent molecules. Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).
  2. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  3. Ha, T., Tinnefeld, P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).
  4. Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).
  5. Davies, M. J. Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen. Photochemical & Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).
  6. Sies, H., Menck, C. F. Singlet oxygen induced DNA damage. Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).
  7. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  8. Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay. Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).
  9. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
  10. Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1. Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).
  11. Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).
  12. Senavirathne, G., Lopez, M. A. Jr, Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging. Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).
  13. Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nature Communications. 7, 11409(2016).
  14. Liu, J., et al. Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair. Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

PCD Ekspresyon Safla t rmasNikel Afinite KromatografisiBoyut D lama KromatografisiTek Molek l MikroskopisiOksijen S p rme SistemiPlazmit Transformasyon ProtokolBakteriyel K lt r nd ksiyonuN kleaz Aktivite Analizi

İlgili makaleler