Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Mikroenjeksiyon ile 3Boyutlu Doku Kaynaklı İnsan Organoid Kültür Sistemlerinde Cryptosporidium Enfeksiyonunun İncelanması

9.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/59610

⸱

14 Eylül 2019

 ,  , 
1Hubrecht Institute, Oncode Institute, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW), UMC Utrecht, 2Veterinary Microbiology and Pathology, College of Veterinary Medicine, Washington State University, 3Janssen Pharmaceutica

Bu makalede

Özet

Biz cryptosporidium parvum tarafından insan bağırsak ve hava yolu organoidleri enfeksiyonu incelemek için ookistler hazırlamak ve sporozoitler arındırmak için protokoller açıklar. Parazitlerin bağırsak organoid lümenine mikroenjeksiyon ve organoidlerin immünboyamı ile ilgili prosedürleri gösteriyoruz. Son olarak, organoidlerden üretilen ookistlerin izolasyonu tarif.

Özet

Cryptosporidium parvum insan ishal hastalığının başlıca nedenlerinden biridir. Parazitin patolojisini anlamak ve etkili ilaçlar geliştirmek için konaktaki koşulları özetleyen bir in vitro kültür sistemine ihtiyaç vardır. Kökenleri dokulara yakından benzeyen organoidler, konak-parazit etkileşimlerini incelemek için idealdir. Organoidler, erişkin kök hücrelerden elde edilen ve herhangi bir genetik sapma veya dönüşüme maruz kalmadan uzun süre kültürde yetişen üç boyutlu (3D) doku kaynaklı yapılardır. Hem apikal hem de bazolateral yüzeylerde polariteyi iyi tanımlamıştır. Organoidler ilaç testi, biyo bankacılık ve hastalık modelleme ve konak-mikrop etkileşim çalışmalarında çeşitli uygulamalara sahiptir. Burada insan bağırsak ve hava yolu organoidleri enfekte cryptosporidium oocysts ve sporozoitler hazırlamak için nasıl bir adım-adım protokol sıyoruz. Daha sonra mikroenjeksiyon un mikropların organoid lümene enjekte edilmesinde nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Organoidlerin konak-mikrop etkileşimi çalışmaları için kullanılabilen üç ana yöntem vardır: mikroenjeksiyon, mekanik kesme ve kaplama, ve monolayers yaparak. Mikroenjeksiyon, 3B yapının bakımını sağlar ve parazit hacimlerinin hassas kontrolünü ve mikroplar için doğrudan apikal yan kontak sağlar. Biz görüntüleme veya ookist üretimi için organoidlerin optimal büyüme için ayrıntıları sağlar. Son olarak, biz de nasıl yeni oluşturulan ookistler daha aşağı işleme ve analiz için organoid izole edilebilir göstermek.

Giriş

Cryptosporidium enfeksiyonunun tedavisi ve önlenmesi için ilaç veya aşıların geliştirilmesi, insanlardaki in vivo durumunu tam olarak taklit eden in vitro sistemlerin eksikliği nedeniyle engellenmiştir1,2. Şu anda mevcut sistemlerin çoğu ya sadece kısa süreli enfeksiyon (<5 gün) izin veya parazit 3 tam yaşam döngüsünü desteklemiyor3,4. Parazitin tam gelişimini sağlayan diğer sistemler, insanlardaki fizyolojik durumu sadakatle özetlemeyen ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarına veya kanser hücresi hatlarına dayanır5,6,7 . Organoidler veya 'mini organlar' çeşitli doku spesifik büyüme faktörleri ile desteklenen bir ekstrasellüler matris yetiştirilen 3D doku türetilmiş yapılardır. Organoidler çeşitli organ ve dokulardan geliştirilmiştir. Genetik olarak stabildirler ve kökenlerindeki organların işlevlerinin çoğunu yeniden özetlerler ve kültürde uzun süre korunabilirler. Biz cryptosporidium ile insan bağırsak ve akciğer organoidleri enfekte etmek için bir yöntem geliştirdik bağırsak ve solunum cryptosporidiosis ile ilgili konak-parazit etkileşimleri çalışması için doğru bir in vitro modeli sağlar8 ,9,10,11,12,13. Diğer yayınlanan kültür modellerinin aksine, organoid sistem gerçek hayattaki ev sahibi parazit etkileşimlerini temsil eder, yaşam döngüsünün tamamlanmasına izin verir, böylece parazit yaşam döngüsünün tüm aşamaları incelenebilir ve parazit yayılımını sürdürür 28 güne kadar10.

Cryptosporidium parvum, solunum ve bağırsak hastalıklarının epitelyumuna bulaştıran ve uzun süreli ishal hastalığına neden olan apikompleks bir parazittir. Dirençli çevre aşaması, kontamine gıda ve su14bulunan ookist, olduğunu. Bir kez yutulan veya solunan, ookist ekstistler ve epitel hücrelerine eklemek dört sporozoitler bültenleri. Sporozoitler konak hücreleri üzerinde süzülür ve konak hücre reseptörlerini meşgul, ama parazit tam hücre işgal etmez, ve onu yutmak için konak hücre ikna etmek için görünür15. Hücre içi ama ekstrasitoplazmik bir bölmede içselleştirilen parazit, hücrenin apikal yüzeyinde kalır ve parasitoforik vakuol içinde çoğalır. Bu eşeysiz üreme iki tur uğrar- merogony denilen bir süreç. Merogony sırasında, tip I merontlar yeni hücreleri istila etmek için yayımlanan sekiz merozoitler içeren geliştirmek. Bu merozoitler dört merozoit içeren tip II merontlar geliştirmek için yeni hücreler işgal. Bu merozoitler, serbest bırakıldığında, hücreleri enfekte ve macrogamonts ve microgamonts gelişir. Mikrogametler serbest bırakılır ve ookistlere dönüşen zigotlar üreten makrogametleri döllerler. Olgun ookistler daha sonra lümen içine serbest bırakılır. Oocysts ya ince duvarlı olan hemen epitel reinfect için ekstst, ya da bir sonraki konak14enfekte etmek için çevreye salınan kalın duvarlı . Cryptosporidium yaşam döngüsünün tüm aşamaları daha önce grup10tarafından geliştirilen organoid kültür sisteminde tanımlanmıştır.

İnsan organoidler sadakatle insan dokularıçoğaltmakberi 9,11,13, ve Cryptosporidiumtüm çoğaltıcı aşamaları desteklemek10, onlar çalışmak için ideal doku kültür sistemi Cryptosporidium biyolojisi ve ev sahibi parazit etkileşimleri. Burada hem Cryptosporidium ookistler hem de ekstisli sporozoitlerle organoidlere bulaşmaya ve bu doku kültür sisteminde üretilen yeni ookistlerin izole edilmesine yönelik prosedürleri açıklıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm doku işleme ve rezeksiyon, Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) onaylı protokoller altında hasta onayı ile gerçekleştirildi.

1. Enjeksiyon için C. parvum Oocysts hazırlanması

NOT: Cryptosporidium oocysts ticari bir kaynaktan satın alınmıştır (Malzemeler Tablosubakınız). Bu ookistler buzağılarda üretilir ve fosfat tamponlu salinde (PBS) antibiyotiklerle depolanır. 4 °C'de yaklaşık 3 ay saklanabilir ler ve asla dondurulmaması gerekir. Biz normalde bir ay içinde oocysts kullanın. Organoidler ya bozulmamış ookistler ile enfekte olabilir, ya da sporozoitler ekstisli ookistlerden izole edilebilir ve orijinal inokülden ookistlerin taşınması önemliyse organoidleri enfekte etmek için kullanılabilir.

  1. Cryptosporidium ookistleri hücrelere bulaştırmak için hazırlayın (Şekil 1A).
    1. Onlar organoidler eklenene kadar tüm manipülasyonlar boyunca buz üzerinde oocysts tutun.
    2. Organoidlerin tam altı iyi plaka (genellikle plaka için yaklaşık 5 x 105-2,5 x 105) için gerekli ookist sayısını hesaplayın. Miktarı doğrulamak ve bir santrifüj tüpüne aktarmak için bir hemositometreookist lerin sayısını sayın.
      NOT: Görüntülemeye yardımcı olmak için ookistler hemositometreye yüklenmeden önce ookist spesifik floresan antikorla (Malzeme Tablosunabakınız) 1:1 karıştırılabilir. Florofor etiketli ookistler daha sonra floresan mikroskobu kullanılarak kolayca görüntülenebilir ve numaralandırılabilir. Yaklaşık 100-1.000 ookist/organoid enjekte etmenizi öneririz. Genel olarak, 1.000-2.000 organoidler altı kuyulu bir tabakta yetiştirilebilir.
    3. Ookistsüspansiyonun hacmini PBS ile 900 μL'ye kadar getirin. 100 μL sodyum hipoklorit (örneğin, Clorox) çamaşır suyu (4 °C'de) ekleyin. Buz üzerinde 10 dakika kuluçka.
    4. 4 °C'de 8.000 x g'de mikrosantrifüjde 3 dk santrifüj. Kapağı niçin içe bakacak şekilde açılan santrifüjdeki tüpleri yönlendirin. Pelet parazitlerin tüpiçinde peletlenmiş nerede olduğunu bilerek görmek zor olabilir.
    5. Pelet önlemek için dikkatli olan bir pipet ile supernatant çıkarın. Karıştırmak için Dulbecco modifiye Eagle's orta (DMEM) ve girdap 1 mL ekleyin.
    6. 4 °C'de 8.000 x g'de mikrosantrifüjde 3 dk santrifüj.
    7. DMEM ile iki kez daha yıkın.
    8. Taurokolat %0,5 (w/v) (Bkz. Malzeme Tablosuna)eklenen genleşme ortamını (OME) veya farklılaşma organoid ortamını (OMD) hazırlayın. Taurokolat her zaman hazırolmalı ve taze eklenmelidir.
      NOT: İnokülün bozulmamış ookistler olduğu enfeksiyon tahlillerimizde %0.5 taurokolat başarıyla kullandık ve konak hücreler üzerinde zararlı etkileri olmadan enfeksiyon oranlarının arttığını gördük. Ancak, taurokolat hücreler üzerinde beklenmedik etkileri olabilir, ve düşük konsantrasyonlarda enfeksiyon tahlilleri başarıyla kullanılmıştır16.
    9. 100 μL organoid kültür ortamında %0.5 (w/v) sodyum taurokolat ile takviye edilen ookistleri resuspend. 1.1.2 adımda açıklandığı gibi ookistleri tekrar sayın.
    10. Enjeksiyonu görselleştirmek için süspansiyona Hızlı Yeşil boya ekleyin.
    11. Mikro yükleyici uçlarını (Malzeme Tablosu'nabakın) ookist süspansiyonuyla doldurun ve çekilen kılcal damarları doldurmak için kullanın.
      DİkKAT: Tüm işlem seviye-2 güvenlik protokolleri ile bir doku kültürü başlık yapılmalıdır. Cryptosporidium oocysts de havayoluyla bulaşıcı olabilir gibi maskekullanımı tavsiye edilir.

2. C. parvum Oocysts gelen Sporozoitlerin Vitro Arıtma

  1. Yukarıda açıklandığı gibi ağartma ve çamaşır suyu yıkama sonra C. parvum oocysts gelen sporozoitler arındırın.
    1. Ookistleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Oda sıcaklığında eksistosortalarda ookistlerin resuspend ihyası (DMEM'de %0.75 w/v sodyum taurokolate) 1 x 107 oocysts/mL elde etmek. Taurokolat eklenmesi ookistlerin eksistosit oranını artırır, sporozoit verimi artırmak.
    2. 37 °C'de 1-1,5 saat kuluçka ookist süspansiyonu.
    3. Excystation ölçüde örnek mikroskobik kontrol edin; Sporozoitlerin iyi iyileşmesi için %60-80 eksisestasyon makuldür. Ekscystation düzeyi düşükse, daha uzun kuluçka (başka bir 30 dk için 1 saat).
    4. Başlangıç ookistsayısına göre yüzde ekscystation belirleyin. Excystation olarak hesaplanır:
      % ekscystation = [1 – (başlangıçta bozulmamış ookist sayısı/ookist sayısı)] x 100
    5. 14 mL PBS veya orta, karıştırma ve kurtarma hücreleri (bozulmamış oocysts, oocyst kabukları ve sporozoitler) eksisit reaktifleri kaldırmak için hücreleri yıkamak 3,400 x g 20 dk sporozoitler kurtarmak için santrifüj tarafından. Hücreleri kaybetmemek için dikkatlice aspire edin.
    6. DMEM'in 1-2 mL'sinde sporozoit peletini yeniden askıya alınve 3 x 107 oocysts/mL elde edin (başlangıç ookist sayısına göre).
    7. Kalan ookistleri ve kabukları temizlemek için süspansiyonu 3 μm'lik bir filtreden geçirin(Şekil 1B). 10 mL'lik şırınga namlusuna bağlı polikarbonat filtre (3 μm gözenek boyutu) ile donatılmış 47 mm filtre tutucu cihazı kullanın. Filtre tutucu cihazı 15 mL'lik bir tüpün üzerine yerleştirin. Bir buz kovası veya soğuk odada montaj yerleştirin.
    8. Filtre tertibatına sporozoit süspansiyonunun 7,5 mL'sini ekleyin ve yerçekimine göre filtrelemenize izin verin. 7,5 mL'lik başka bir DMEM ile yıkayın.
      NOT: Sporozoit izolasyontaze ookistler ve iyi excystation başarı sağlamak için önemlidir. Çok fazla ekskistsiz ookist varsa, süspansiyon yerçekimi ile akmaz. Şırınga üzerinde basınç uygulanması ekskissiz ookistler ile zorlayabilir. Sporozoitlerin mikroenjeksiyonu ookistlerden daha zordur çünkü sporozoitler kümelenebilir ve kılcal damarı bloke edebilir. Bunu önlemek için, biz sporozoitler ile organoidler enjekte ederken daha geniş bir kılcal uç yapmanızı öneririz. Yeterli enfeksiyon düzeyine ulaşmak için, ookist lerle enfekte organoidlere kıyasla her organoide sporozoit sayısının 2-4 kat daha fazla enjekte edilmesi gerekir.
    9. Filtrelenmiş sporozoit süspansiyonun3.400 x g'de, 20 dk'lık sallanan kova rotoru ile pelet sporozoitleri santrifüj edin.
    10. 50-100 μL OME veya OMD organoid kültür ortamında (Bkz. Malzeme Tablosu)%0,05 (w/v) Hızlı Yeşil boya ve L-glutatyon, betain, L-sistein, linoleik asit ve taurin içeren azaltıcı tampon5 (bkz. Malzeme Tablosu).
      NOT: Ookistlerin çok uzun süre kuluçkaya yatması sporozoitlerin lysis ve kötü iyileşmeye neden olabilir ve bu nedenle kaçınılmalıdır.

3. Mikroenjeksiyon için İnsan Bağırsak ve Akciğer Organoidleri In Vitro Kültür

  1. Genişleme ve farklılaşma ortam koşulları altında kültür bağırsak organoidler.
    Not:    Bağırsak ve akciğer organoid yayılımının ayrıntıları daha önce diğer makalelerde açıklanmıştır.8,13(bkz.Malzeme Tablosumedya tarifleri için). Burada organoid kültür yöntemini kısacaCryptosporidiumenjeksiyon ve büyüme. Organoidlerde parazitlerin görüntülenmesi için genişleme ortamında yetişen organoidlerin, farklılaşma ortamında yetişen organoidlerde görülenden daha az enkaz birikimi olduğu için, büyüme farklılaşma ortamlarında yetiştirilen organoidlerin tercih edildiğini bulduk. Ancak amaç ookistleri izole etmekse, farklılaşma ortamlarında yetişen organoidler çok daha fazla sayıda ookist üretirler.
    1. 37 °C'de hücre dışı matrislerde 3B kültürlerde organoidleri muhafaza edin (Bkz. Malzemeler Tablosu). Üstüne OME (genişletme ortamı) ekleyin ve her gün yenileyin.
      NOT: Akciğer organoidleri için ayrı genişleme ve farklılaşma ortamımız yoktur.
    2. Mikroenjeksiyon için organoidleri bölmek ve plakalamak için, insan organoidleri içeren 6 kuyulu plakadan ortam çıkarın ve kuyuya F12+++ (Malzeme TablosunaBakın) ekleyin ve 1 mL pipet ucu yla boru lama ile matrisi birkaç kez parçalayın. Hücreleri 15 mL'lik bir tüpe toplayın (tüp başına 2 mL F12+++ daha fazla işlem için yeterlidir).
    3. Başka bir 15 mL tüp içine F12 +++ 10-12 mL ekleyin ve insan bağırsak ve akciğer organoidleri kırmak için orta, pipet yukarı ve aşağı 3 kez içine bir ateş cilalı cam pipet yerleştirin.
      NOT: Uzun bir cam pipet (20-30 cm) kullanın ve kısa bir süre ateş cila. Organoidler zarar görebildiği için açıklığı (1 mm çapında) çok küçük yapmayın. Kısa bir süre ateş parlatarak pipetin ucunu pürüzsüz hale getirin. Organoidleri ~50 μm'lik daha küçük parçalara ayırın. Akciğer organoidleri daha kalın bir dış zara sahiptir ve bu nedenle bağırsak organoidlerine göre cam pipetle daha güçlü kesme gerektirir. Ayrıca, bağırsak organoidler (her passaging arasında 14 güne kadar) daha yavaş bir büyüme hızı var.
    4. 5-7 mL'ye kadar F12+++ ve 5 dk boyunca 350 x g'de santrifüj ekleyin.
      NOT: Bu adımda santrifüj hızı, hücre dışı matristen iyi ayrılmış iyi bir hücre peleti yapmak için normalden daha yüksektir (Bkz. Malzemeler Tablosu). Fare ince bağırsak organoidlerine göre insan ince bağırsak organoidlerinin bozulmasının daha zor olduğunu gözlemledik.
    5. Hücreleri rahatsız etmeden mümkün olduğunca çok orta çıkarın, sonra 4 °C'de tutulan matris ile pelet yeniden askıya; Altı kuyulu bir plakanın kuyu başına 200-300 μL matrisi gereklidir. Organoidler oldukça yüksek hücre yoğunluğunu korumak için üçte bir bölünmelidir.
    6. Organoidleri her biri yaklaşık 5-10 μL'lik matris damlacıklarında altı kuyulu bir plakanın kuyusu içinde plakalayın. 37 °C'de 20-30 dk kuluçkaya yatırın ve üzerine genleşme ortamı (OME) ekleyin.
    7. Her 2-3 günde bir ortamı değiştirin.
      NOT: Yaklaşık 5-7 gün içinde, EM'de büyüyen organoidler 100-200 μm'lik bir boyuta ulaşır lar ve enjeksiyona hazırdırlar.
    8. EM'de 5-6 gün sonra organoidleri ayırt etmek için ortamı farklılaşma ortamı (DM) koşullarına göre değiştirin ve parazitleri enjekte etmeden önce 5-6 gün daha tutun.
      NOT: Organoidlerin genişlemesi için organoidlerin yoğun olarak plakakullanılması tavsiye edilir. Mikroenjeksiyon için, altı kuyulu bir plaka kullanımı daha az yoğunlukta kaplanmış organoidler ile tavsiye edilir. Örneğin, altı kuyuluk bir plakanın üç kuyudan mikroenjeksiyonlar için tam altı kuyuluk plakasına plaka organoidleri. Matris uzun süreli depolama için -20 °C'de muhafaza edilmeli ve kullanılmadan önce 4 °C'de veya buz üzerinde çözülmelidir. Akciğer organoidlerinin genişlemesi benzer bir şekilde yapılır ancak akciğer organoidine özgü media bileşenleri(Tablo 1)8 .

4. Organoid Lümen içine Ookistler / Sporozoitler Mikroenjeksiyon

  1. 3D organoidin apikal tarafına mikroenjekte parazitler (Şekil 2).
    1. Mikro pipet çekmece sikullanarak 1 mm çapındaki cam kılcal damarlar hazırlayın.
      NOT: Mikropipet çekmecede kullanılan ayarlar (Bkz. Malzeme Tablosu)şunlardır: Isı = 663, Pull = 100, Hız = 200, Zaman = 40 ms. Ayarlar belirli bir makineiçin kullanıcı talimatlarına göre ayarlanmalıdır.
    2. Kılcal damarın ucunu forceps ile kesin. Kılcal uç boyutu/çapı 9-12 μm; bu ookistlerin kolay akışını sağlar (4-5 μm boyutu).
    3. Mikro-loader ipuçları nı kullanarak kılcal damarları ookist veya sporozoit süspansiyonile doldurun.
    4. Ookist dolu kılcal damarı bir mikroenjektöre yükleyin.
    5. Mikroenjekte 100-200 nL süspansiyon her organoid içine ters bir mikroskop altında 5x büyütme, basınç sabit tutmak. Mikroenjeksiyondan sonra, her gün OME veya OMD ile ortam yenileyin ve plakayı 37 °C'de koruyun.
      NOT: Mikroenjeksiyon için mikromanipülatör kullanmayız. Her numunede eşit enjeksiyon sağlamak için tüm deney için aynı kılcal damar kullanımı önerilir.

5. Organoidlerin İmmünofluoresans Boyama

  1. P1000 pipetli organoidleri (1-2 x 24 kuyu) soğuk F12+++içeren 15 mL'lik bir tüpe toplayın.
  2. Pelet organoidler 300 x g için 2 dakika, pelet bozmadan supernatant kaldırmak ve yavaşça kalan hacim içine gevşek pelet pipet.
  3. PBS'de %2 paraformaldehit 5 mL ekleyin. Organoidlerin duvara yapışmasını önlemek için tüpü ters çevirmeyin. Organoidlerin tüpün dibine yerleşmelerine ve gece boyunca 4 °C'de veya oda sıcaklığında 1 saat eve yerleşmelerine izin verin.
  4. Fiksatif kaldırın ve permeabilizasyon tamponu 10 mL ekleyin (%0.2 PBS Triton).
  5. Tüpü oda sıcaklığında 20 dakika döndürün (bu tüm organoidlerin süspansiyonda kalmasını sağlar).
  6. 2 dk için 300 x g organoidler pelet, ve sonra supernatant atın.
  7. 500 μL'lik bloklama çözeltisinde (Malzeme Tablosunabakınız) organoidleri nazikçe yeniden askıya alın ve 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  8. Bir shaker oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka. Organoidlerin yer çekimi ile tüpün dibine yerleşmelerine izin verin. Bloke çözeltisini birincil antikor solüsyonuyla değiştirin (Bkz. Malzeme Tablosu)ve oda sıcaklığında veya gecelemede 4 °C'de 1-2 saat kuluçkaya yatırın.
  9. % 0.1 Tween içeren PBS ile 3x yıkayın. Organoidler her zaman yerleşmek ve supernatant kaldıralım.
  10. İkincil antikor solüsyonu ekleyin (Malzemeler Tablosunabakın) ve oda sıcaklığında 2 saat kuluçkaya yatırın.
  11. % 0.1 Tween içeren PBS ile 3x yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra 50 μL PBS bırakın.
  12. Slaytta 50 μL PBS'de asılı olan organoidleri pipetleyerek kaydıra monte edin. Fazla PBS'yi çıkarın, bir damla montaj maddesi ekleyin (Malzemeler Tablosunabakın) ve coverslip'i en üste ekleyin. Oje ile kenarları mühür ve kurumasına izin.

6. Ookistlerin Organoidlerden İzolasyonları

  1. Organoid lümenden yeni oluşan ookistleri izole edin.
    Not:    Ookistler, immünomanyetik ayırma ile organoidlerden izole edilir (bkz.Malzeme Tablosu) aşağıda açıklanan değişiklikler ile. İzole ookistler daha sonra immünoresans ve elektron mikroskobu ile analiz edilebilir.
    1. OMD'de 5-7 gün süreyle tutulan ve enfekte olmamış, 1 gün enfekte olmuş ve 5 gün enfekte olmuş farklılaştırılmış organoidlerle başlayın. İlk ikisini negatif denetim olarak kullanın.
      NOT: Biz diferansiye organoidler akciğer veya genişleyen bağırsak organoidler10daha fazla ookist üretmek bulduk.
    2. Organoidleri 15 mL santrifüj tüpünde toplayın. 3.000 x g ve 10 °C'de 20 dk için organoidleri santrifüj edin.
      NOT: Bu yüksek hız hiçbir ookistkırık olabilir herhangi bir organoidler dışında kayıp olduğundan emin olmak için gereklidir.
    3. Organoid ortamı çıkarın ve 5 mL su ile değiştirin.
    4. Bir yangın cilalı cam Pasteur pipet ile tekrarlanan güçlü pipetleme organoidler bozun.
    5. Kümeler görünürse, organoid süspansiyonu bir cam danhomogenizer'e aktarın ve organoidler iyice bozulana kadar homojenize edin. Dounce homogenizer ookistleri etkilemez.
    6. Görünür kümeler olmadığında, ookist izolasyon kitinden 5 mL arabellek A ekleyin. Karıştırın ve sonra anti-oocyst IgM ile kaplanmış manyetik boncuk120 μL ekleyin.
    7. Hücre süspansiyonu ve manyetik boncukları oda sıcaklığında 2 saat boyunca, rocker platformunda sürekli karıştırma ile kuluçkaya yatırın.
    8. Kuluçka sonunda, hücre ve boncuk içeren tüpleri 15 mL tüpler için tasarlanmış manyetik ayırma rafına yerleştirin.
    9. Tüpleri manyetik ayırma rafındaki 3 dk boyunca manuel olarak döndürün. Boncuklar mıknatısın yanındaki tüpün yan tarafına yapışır.
    10. Dikkatle, 10 mL pipet ile, boncuksupernatant kaldırın. 450 μL Tampon B'deki boncukları yeniden askıya alın ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın.
      NOT: Ookistlerin izolasyonu onaylanana kadar supernatant tutun.
    11. Kalan boncuk ve ookistleri toplamak için 15 mL'lik tüpü 450 μL Tampon B ile yıkayın ve bu yıkamayı mikrosantrifüj tüpündeki manyetik boncuklara ekleyin.
    12. Adım 6.1.11'i bir kez daha tekrarlayın. Tüm boncuklar ve yakalanan ookistler artık mikrosantrifüj tüpüne aktarılmalıdır.
    13. Mikrocentrifuge tüplerini tutmak için tasarlanmış manyetik ayırma rafına mikrosantrifüj tüpünü yerleştirin.
    14. 3 dakika boyunca elle manyetik ayırma rafındaki tüpü döndürün.
    15. Yeni bir tüp içine bir pipet ile supernatant dikkatle çıkarın.
      NOT: Ookistlerin izolasyonu onaylanana kadar supernatant tutun.
    16. Manyetik ayırma rafından manyetik boncuk lar ve ookistler içeren mikrosantrifüj tüpünü çıkarın.
    17. Boncuklardan ookistleri çıkarmak için manyetik boncuklara 0,1 N HCl'lik 100 μL ekleyin. 30 s.'lik girdap.
      NOT: Girdap maksimum hızdan biraz daha az olacak şekilde ayarlanmalıdır.
    18. Oda sıcaklığında 10 dakika için 0,1 N HCl boncuk kuluçka.
    19. Yine girdap. Daha sonra tüpü manyetik ayırma rafına geri yerleştirin. Boncuklar için tüp tarafına uymak için bekleyin ve sonra yeni bir mikrosantrifüj tüp için supernatant aktarın.
    20. 6.1.17 ile 6.1.19 adımlarını tekrarlayın ve ikinci eluate ile ilk eluat'ı birleştirin.
    21. Eluate'yi 20 μL 1 N NaOH veya 1 M Tris, pH 8 gibi başka bir nötralize tamponu ile nötralize edin.
    22. Ookistleri saymak için, eluatın 10 μL'sini alın, 10 μL ookist spesifik antikorla birleştirin (Bkz. Malzemeler Tablosu)ve hemositometrede floresan ookistleri sayın.
      NOT: İzole ookistler 4 °C'de depolanabilir veya hemen immünoresans veya elektron mikroskobu görüntülemesi için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Burada sunulan protokoller, mikroenjeksiyon için hazır ookistve sporozoitlerin(Şekil 1A)etkin bir şekilde saflaştırılmasıile sonuçlanır. Ekssestasyon protokolü, ookistlerin yaklaşık p-80'inden sporozoitlerin salınımına neden olur, bu nedenle kalan ookistlerin ve kabukların 3 μm'lik bir filtreden filtrelesiniz. Filtrasyon neredeyse 0 sporozoit arınma ile sonuçlanır(Şekil 1B). Ayrıca, yeşil boya eklenmesi tüm organoidlerin enjeksiyonunu sağlamaya yardımcı olur ve ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bağırsak ve hava yolu organoidlerinde Cryptosporidium parazitkültürü, konak-parazit etkileşimlerini incelemek için doğru bir model sağlar10 ama aynı zamanda birçok uygulama vardır. Örneğin, genetik olarak modifiye Cryptosporidium parazitlerinin seçilmesi ve yayılması için mevcut yöntemler, in vivo enfeksiyon için gerekli modifikasyonlara sahip parazitlerin izolasyonuna izin vermeyen fareler19'da geçiş gerektirir. Cryptosporidium organoid kültür bu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Biz Deborah A. Schaefer Hayvan ve Karşılaştırmalı Biyomedikal Bilimler Okulu, University of Agriculture and Life Sciences, University of Arizona, Tucson, AZ, ABD ookist üretim ve analiz ile bize yardımcı olduğu için müteşekkiriz. Ayrıca Franceschi Mikroskobu ve Görüntüleme Merkezi ve Washington State Üniversitesi'nde D.L. Mullendore'ye TEM hazırlığı ve izole organoid ookistlerin görüntülenmesi için teşekkür ederiz.

D.D. Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü'nden (NWO-ALW, 016.Veni.171.015) VENI bursu almaktadır. I.H. Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü'nden (NWO-ALW, 863.14.002) ve Avrupa Komisyonu'ndan Marie Curie bursları tarafından desteklenmiştir (Öneri 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF). Bu sonuçlara yol açan araştırma, 67013 sayılı ERC İleri Hibe Anlaşması uyarınca Avrupa Araştırma Konseyi'nden ve R21 AT009174 kapsamında NIH NIAIH'den RMO'ya kaynak almıştır. Bu çalışma, kısmen Hollanda Kanser Derneği tarafından finanse edilen ve Hollanda Kanser Derneği'nin bir bağışı ile finanse edilen Oncode Enstitüsü'nün bir parçasıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Bodrum membran ekstresi (hücre dışı matris)amsbio3533-010-02  < / güçlü >
Crypt-a-Glo antikoru (Ookist spesifik antikor)Waterborne, IncA400FLR-1XSon Konsantrasyon = 2-3 damla / slayt
kullanın Crypto-Grab IgM kaplı Manyetik boncuklarWaterborne, IncIMS400-20ve nbsp;
Dynamag 15 rafThermofisher Scientific12301D 
Dynamag 2 raflıThermofisher Scientific12321D 
EMD Millipore  İzopor Polikarbonat Membran Filtreler- 3 & mEMD-MilliporeTSTP02500 
Hızlı yeşil boyaSIGMAF7252-5G    
Femtojet 4i MikroenjektörEppendorf5252000013 
1 mm çapında cam kılcal damarlarWPITW100F-4 
Matrigel (hücre dışı matriks)Corning356237 
Mikrofüj tüpü 1.5 mLEppendorfT9661-1000EA&nbsp;
Mikro yükleyici uçlarıEppendorf612-7933 
Mikropipet çektirme P-97Deklanşör aletiP-97 
Normal eşek SerumuBio-RadC06SB&nbsp;
PenstrepGibco15140-122 
Sodyum hipoklorit (% 5 kullanın)Clorox50371478 
Süper sopa slaytlarWaterborne, IncS100-3&nbsp;
Swinnex-25 47 mm Polikarbonat filtre tutucuEMD-MilliporeSX0002500 
Taurokolik asit sodyum tuzu hidratSIGMAT4009-5G 
Tween-20Merck8221840500 
Vectashield montaj maddesiVector LabsH-1000 
Vortex Genie 2Bilimsel endüstriler, IncSI0236ve nbsp;
Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes)    Nihai miktar
DMEMInvitrogen12634-010500 mL
PenstrepGibco15140-122500 mL'de 5 mL stok DMEM
GlutamaxGibco35050038500 mL DMEM'de 5 mL stok
HepesGibco15630056500 mL DMEM'de
5 mL stokta BAĞIRSAK ORGANOID MEDIA-OME (Genişleme ortamı)    < / güçlü >< güçlü > nihai konsantrasyon< / güçlü
> A83-01Tocris2939-50mg0.5 ve mikro; M
Adv+++&nbsp; 100 mL'ye kadar yapmak
B27Invitrogen175040441x
EGFPeprotechAF-100-1550 ng/mL
GastrinTocris3006-1mg10 nM
NACSigmaA9125-25G1.25 mM
NICSigmaN0636-100G10 mM
Noggin CMEvde * %10
P38 inhibitörü (SB202190)SigmaS7076-25 mg10 ve mikro; M
PGE2Tocris2296/1010 nM
PrimocinInvivoGenant-pm-11 mL/500 mL ortam
RSpoI CMKurum içi* %20
Wnt3a CMEvde * %50
Kurum içi* - hücre hatları istek üzerine sağlanacaktır   
BAĞIRSAK ORGANOID MEDIA-OMD (Farklılaşma ortamı)  Organoidleri ayırt etmek için, genişleyen ince bağırsak organoidleri, ayrıldıktan sonra altı ila yedi gün boyunca Wnt açısından zengin bir ortamda büyütüldü ve daha sonra bir farklılaşma ortamında büyütüldü (Wnt, nikotinamid, SB202190'nin çekilmesi, bir farklılaşma ortamında (Wnt, nikotinamid, SB202190, prostaglandin E2'nin Wnt açısından zengin bir ortamdan çekilmesi veya OME)
AKCİĞER ORGANOID ORTAM- (Farklılaşma ortamı)    Son konsantrasyon
Adv+++&nbsp; 100 mL'ye kadar yapmak
ALK-I A83-01Tocris2939-50mg500 nM
B27İnvitrojen175040440.0763888889
FGF-10Peprotech100-26100 ng/mL
FGF-7Peprotech100-1925 ng/mL
N-AsetilsisteinSigmaA9125-25G1.25 mM
NikotinamidSigmaN0636-100G5 mM
Noggin UPEU-Protein ExpressDoğrudan şirketle iletişime geçin%10
p38 MAPK-ISigmaS7076-25 mg1 & M
PrimocinInvivoGenant-pm-11:500
RhoKI Y-27632Abmole BioscienceM1817_100 mg2.5 & mikro; m
Rspo UPEU-Protein ExpressŞirketi Doğrudan iletişime geçin% 10
< güçlü > İndirgeyici tampon (enjeksiyon için ookistlerin ve sporozoitlerin yeniden süspansiyonu için) < / güçlü >< güçlü > & nbsp;   < / güçlü >< güçlü > nihai konsantrasyon< / güçlü >
L-Glutatyon azaltılmışSigmaG4251-10MG0.5 & mu; g/μ L OME / OMD / LOM
BetainSigma619620.5 & mu; g/μ L OME / OMD / LOM
L-SisteinSigma168149-2.5G0.5 & mu; g/μ L OME / OMD / LOM
Linoleik asitSigmaL1376-10MG6.8 & mu; G / ML OME / OMD / LOM
TaurinSigmaT0625-10MG0.5 μ g/μ L OME / OMD / LOM
güçlü > Bloke edici tampon (immünofloresan boyama için) < / güçlü >< güçlü> nbsp;   Nihai konsantrasyon
Eşek/Keçi serumuBio-RadC06SB%2
PBSThermo-Fisher70011044100 mL'ye kadar makyaj
Tween 20MerckP1379%0.1
Kullanılan Antikorların Listesi      
Alexa 568 keçi anti-tavşanInvitrogenA-11011Seyreltme-1:500; RRID: AB_143157
Crypt-a-Glo Kapsamlı Kit- Floresein etiketli antikor Crypto-GloWaterborne, IncA400FLKSeyreltme- 1:200
Crypta-Grab IMS Boncukları- Monoklonal antikor reaktifWaterborne, IncIMS400-20Seyreltme-1:500
DAPIThermo Fisher ScientificD1306Seyreltme-1:1.000; RRID : AB_2629482
Phalloidin-Alexa 674InvitrogenA22287Seyreltme-1: 1.000; RRID:
R. M. O' tarafından üretilen AB_2620155 Tavşan anti-gp15 antikoru Connor (ortak yazar).Talep üzerineTalep üzerineSeyreltme-1:500
Sporo-GloWaterborne, IncA600FLR-1XSeyreltme- 1:200
< ile kaplanmış manyetik boncuklar

Kaynaklar

  1. Checkley, W., et al. A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium. The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).
  2. Bones, A. J., et al. Past and future trends of Cryptosporidium in vitro research. Experimental Parasitology. 196, 28-37 (2018).
  3. Muller, J., Hemphill, A. In vitro culture systems for the study of apicomplexan parasites in farm animals. International Journal for Parasitology. 43 (2), 115-124 (2013).
  4. Karanis, P., Aldeyarbi, H. M. Evolution of Cryptosporidium in vitro culture. International Journal for Parasitology. 41 (12), 1231-1242 (2011).
  5. Morada, M., et al. Continuous culture of Cryptosporidium parvum using hollow fiber technology. International Journal for Parasitology. 46 (1), 21-29 (2016).
  6. DeCicco RePass, M. A., et al. Novel Bioengineered Three-Dimensional Human Intestinal Model for Long-Term Infection of Cryptosporidium parvum. Infection and Immunity. 85 (3), (2017).
  7. Miller, C. N., et al. A cell culture platform for Cryptosporidium that enables long-term cultivation and new tools for the systematic investigation of its biology. International Journal for Parasitology. 48 (3-4), 197-201 (2018).
  8. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modelling. bioRxiv. , https://www.biorxiv.org/content/early/2018/05/09/318444 (2018).
  9. Dutta, D., Clevers, H. Organoid culture systems to study host-pathogen interactions. Current Opinion in Immunology. 48, 15-22 (2017).
  10. Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
  11. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  12. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  13. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  14. O'Hara, S. P., Chen, X. M. The cell biology of Cryptosporidium infection. Microbes and Infection. 13 (8-9), 721-730 (2011).
  15. Lendner, M., Daugschies, A. Cryptosporidium infections: molecular advances. Parasitology. 141 (11), 1511-1532 (2014).
  16. Feng, H., Nie, W., Sheoran, A., Zhang, Q., Tzipori, S. Bile acids enhance invasiveness of Cryptosporidium spp. into cultured cells. Infection and Immunity. 74 (6), 3342-3346 (2006).
  17. O'Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens. Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).
  18. Wilke, G., et al. Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro. mSphere. 3 (3), (2018).
  19. Vinayak, S., et al. Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum. Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).
  20. Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Mikroenjeksiyon Tekni iSporozoit Safla t rmaEksistasyon Protokol3D Organoid SistemiKonak Mikrop Etkile imimm nofloresan AnalizFiltrasyon Y ntemiApikal Enjeksiyon
Mikroenjeksiyon ile 3Boyutlu Doku Kaynaklı İnsan Organoid Kültür Sistemlerinde Cryptosporidium Enfeksiyonunun İncelanması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.