Burada açıklanan çeşitli ev yapımı araçların transferi, Chill, ve yetişkin Drosophilaöldürmek, yanı sıra cam kültür şişeleri temizlemek ve yumurta toplamak için kullanılır. Bu araçların yapmak kolaydır ve Drosophila işleme oldukça etkilidir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Meyve sinekleri Işlemek için basit ev yapımı Araçlar-Drosophila melanogaster
Bu makalede
Özet
Özet
Meyve sinek, Drosophila melanogaster, yaygın biyolojik araştırma ve biyoloji eğitimi hem de kullanılır. Yetişkin sinekler işleme yetişkin sinek olarak, yaygın ama pratikte zordur. Burada gösterilmiştir nasıl bazı basit ve maliyet-etkili araçlar Drosophilaişleme zor sorunları gidermek için yapmak. Köpük tıpalar delikler yapılır ve Pipet uçları veya huniler delikler yerleştirilir. Sinekler sonra sadece bir yönde pipet ucu/huni montaj içine hareket, Yetişkin Drosophila bir şişe içine veya dışına transfer etkili kontrol sağlar. Mevcut protokoller, ezilmiş buzun içinde serinleyerek ve onları soğuk, sert bir IcePack yüzeyine aktararak serin anestezi yapan sinekler için değiştirildi. IcePack bir stereomikoskop altında incelendiğinde yoğunlaştırılmış sudan sinekler immobilize tutar tıbbi gazlı bez bir parçası ile kaplıdır. Sinekler sonunda sayma ve sıralama veya mikrosallama tarafından atılan için ötenize vardır. Bir şişe şeklinde kafes de yumurta toplamak için geliştirilmiştir, yanı sıra bir işgücü tasarrufu cihazı ve cam kültür şişeleri temizlemek için eşlik eden protokol.
Giriş
Meyve sinek, Drosophila melanogaster, yaygın olarak kullanılan bir model organizmadır biyolojik araştırma ve biyoloji eğitimi konular çeşitli çalışma1,2. Drosophila işleme temel sorunları, tüm yetişkinler (bazı mutantlar dışında3,4) uçabilir, böylece işlemek için daha kolay, böylece şişeye şişe ve sineklerin immobilizasyonu için yetişkin transferi vardır.
Geleneksel olarak, bir araştırmacı transferler iki şişe ağız-ağız tutarak bir şişeden diğerine uçar, aşağı uçar ya da başka bir şişeye kadar uçmak için sinek izin, sonra ayıran ve her iki şişe replugging4. Açıkçası, bu aynı çaplı iki şişe açılması gerektirir, ve transfer uçar miktarını kontrol etmek zordur. Bu arada, bu işi yapmak için hızlı eller gerektirir, ve başıboş sinekler kaçmak laboratuar veya sınıf için sorunlara neden olabilir. İlave bakire sinekler veya erkek zaten hazırlanmış bir haç sinek ekleyerek Drosophila deneyler başka rutin bir iştir. Geleneksel olarak, sinek ekstra sinekler eklenmeden önce çapraz şişede immobilize olmalıdır.
Yetişkin Drosophila , eter, Co2veya soğuk5ile rutin olarak anestezize edilir. Eter ve Co2 pozlama ile karşılaştırıldığında, soğutmak yetişkin Drosophila immobilizing için en uygun maliyetli Ajan ve en az sinekler ve araştırmacılar (özellikle genç öğrenciler)6,7için zararlı. Ancak, soğuk yüzey veya oda sürekli yoğunluk su sinekleri ıslatır. Islak sineklerin fenotiplerini belirlemek zordur ve manipülasyon sırasında kolayca zarar görebilir8,9. Bu, daha yaygın kabul edilmekte olan tüyler ürpertici yöntemi tuttu.
Fly temliki için araçlar ve sinek soğutma için bir yöntem daha önce10açıklanmıştır. Burada, Drosophila deneyler için güvenli, güvenilir ve uygulanabilir bir modifiye tüyler ürpertici anestezi tekniği bildirilmiştir. Ayrıca bu yazıda açıklanan 1), sayma, sıralama veya atma, 2) işgücü tasarrufu cihazları ve cam kültür şişeleri temizlemek için protokoller ve 3) yumurta toplamak için basit bir kafes için yetişkinler öldürmek için yöntemler. Burada açıklanan kolay tasarlanmış ve uygun maliyetli araçlar, sinek elleçleme zor sorunları gidermek için kullanılabilir ve bu yöntemler test edilmiş ve deneyimli ve acemi araştırmacılar için sağlam, güvenilir ve kolay ele olması kanıtlanmıştır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. hazırlama araçları ve aksesuarları
- İpucu/huni tıpalar
- İki sünger fişleri elde (fişler çapı biraz sinek aktarmak için kullanılan şişeleri iç çapı daha büyük olmalıdır). Isıtmalı elektrikli lehimleme demir ile sünger fişleri merkezlerinde bir delik olun.
- İki adet 1 mL pipet uçları alın, keskin bir bıçağla yarı yarıya kesebilir ve sivri ucunu atabilirsiniz. Daha sonra, ikinci pipet ucun sivri ucunu 1,5 cm kes. İki pipet uçları, uzun bir pipet ucu (Şekil 1a) yapmak için bir çok amaçlı yapıştırıcı ile birlikte tutkal kalıntıları.
- Bir uç ve huni stoper (bundan sonra T-ve F-Stoppers olarak anılacaktır) yapmak ve 100 μL mikrosantrifüjli tüp (Şekil 1a) ile Pipet ucunu kapmak için sünger fişleri içine bir huni ve uzatılmış pipet ucu takın.
Not: Huni gövdeden uzunluğu, fiş yüksekliğinden daha büyük olmalıdır. Eğer fiş yüksekliğine eşit veya daha kısa ise, sonra sinekler kök açılışından kaçmak olacaktır. Huni kökü sonunda kültür orta veya boş bir şişenin alt yüzeyinin en az 2 cm üzerinde yer olmalıdır. Küçük huniler (örn., disk çapı < 60 mm), düşük dahili kök açma çapları (< 5 mm) tercih edilebilir. Bir F-Stopper yapmak için bir cam veya plastik huni kullanılabilir. Ancak, plastik huniler biyoloji sınıfları için tercih edilir, onlar cam hunileri daha az kolayca kırmak gibi.
- Mikrodiseksiyon iğneler
- Kurşun dolgularının çaplarına (örn. 0,5 mm, 0,7 mm) uyan el ve böcek pimlerini rahat hisseden Mekanik kalemler alın.
- Bir çift penye ile böcek pimlerini geniş uçları kes ve kesme düz dosya. Müşteri adayını pimler ile değiştirin (Şekil 1B). Tıklama düğmesine basın ve bir diseksiyon yapmak için 0,5 – 1 cm 'lik bir pin dışarı besleme. Pimi temizleyin ve herhangi bir kişinin işleyeceğini güvenli hale getirmek için bir diseksiyon aktivitesinden sonra kalem şaftına tamamen geri itin.
Not: Mikrodiseksiyon iğneler sadece larva tükürük bezleri gibi organların diseksiyon değil, aynı zamanda sayma ve ölü yetişkin sinekler sıralama yararlıdır.
- Sert icepacks
- Birkaç refreezable sert icepacks elde (büyük ölçekli icepacks tercih edilir). Şekil 1C iyi çalıştı bir icepacks gösterir, hangi önlemler 26,5 cm x 14,5 cm x 2,5 cm ve tamamen düz üst ve alt kenarları vardır.
- Tıbbi gazlı bezi (steril olmayan), örtülerin soğuk yüzeylerinden biraz daha küçük olan parçalara kesebilir. Örneğin, 26,5 cm x 14,5 cm 'den biraz daha küçük bir tıbbi gazlı bez parçası Şekil 1C'de gösterilen bir IcePack 'i kapsayacak şekilde tercih edilir.
Not: Bu soğutma araçları için gerekli aksesuarlar şunlardır: bir buz kutusu (Biz bir kişi için 25 cm x 15 cm x 15 cm köpük kutu ve 37 cm x 28 cm x 20 cm kutu birden fazla kişi için), hangi ezilmiş buz depolamak için kullanılan kullanılır; onların kanatları tarafından soğutulmuş uçar kapmak ve bir şişeye onları aktarmak için kullanılan ince nokta cımbız, bir çift; -20 °C dondurucudan soğutulmuş icepacks almak için kullanılan bir çift koruyucu çalışma eldivenleri; ve plastik film, bir stereomicroscope sahne kapsayacak şekilde kullanılır.
- Drosophila yumurta toplama kafesi
Not: Hazır Drosophila yumurta toplama kafesleri birçok biyoteknoloji şirketlerinden mevcuttur11. Burada açıklanan 60 mm Petri yemekleri için küçük bir akrilik şişe şeklinde yumurta toplama kafesi (Şekil 1D sol; kafes tasarımı ortasında gösterilir). Diğer Petri tabak boyutları için uyarlanabilir (örn. 100 mm, 35 mm). Bu da kolayca kafesin içine veya dışına uçar aktarımı sağlar. Basit bir kafes aşağıdaki gibi hazırlanabilir.- Yumuşak bir plastik içecek şişesi (500 mL, iç çap CA. 65 mm) yaklaşık bir 2:1 (sivri uç: künt uç) oranı içine kesmek için bir snap kesici kullanın ve künt ucunu atın.
- Bir elma suyu plakası (iç çapı 60 mm) yapışkan teyp [elma suyu plaka yumurta toplamak için kullanılır (Şekil 1E, sağ)] etrafında kart kağıdı bir şerit sarın.
- Akülü tüp fırça sürücüsü
- Bir kablosuz matkap sürücüsü elde (maksimum hız = 500 rpm).
- Kenarlarının yanı sıra önü kılları olan bir tüp fırçası alın. İdeal olarak, fırçanın çapı temizlenmesi gereken kültür şişeleri çapından biraz daha büyük olmalıdır. Matkap aynası içine takılabilmesi için kolu ucunu kesin (Şekil 1D).
Not: Bu temizleme aletleri için gerekli aksesuarlar arasında Paslanmaz çelik Süngerler ve uzun manşet Kauçuk eldivenler bulunmaktadır.
2. yetişkin sinekleri şişe A 'dan şişe B 'ye aktarma
Not: Yetişkinlerin bir şişelerinden diğerine aktarılması, Drosophila deneylerinde yapılan en yaygın uygulamadır [Örneğin, eski kültürden (a) taze kültüre (b) veya bir çapraz şişeye (a), anestezi için boş şişe (b)] kadar uçar. Burada açıklanan protokol, herhangi bir yetişkin sinek transferi faaliyetleri için kullanılabilir. Aksi belirtilmediği sürece, bu protokol, bu kağıt boyunca şişe A 'dan B 'ye sinekler aktarmak için kullanılır.
- F-stoper hunisinin kökünü ve T-Stopper ' ı k i Pipet ucunu dikkatli bir şekilde kontrol edin, ardından kauçuk hava üfleyici ile duraklar içinde kalan herhangi bir sineği temizleyin. Bu adım çok önemlidir, özellikle bir set T-ve F-Stoppers farklı Drosophila hatları sürekli aktarımı için kullanılır.
- Şişe A sinekleri aşağı dokunun ve bir T-Stopper ile fişini yerine, sonra F-Stopper ile B şişe takın.
- Şişenin üzerine B, T-Stopper ' ı k i pipet ucu ucunu F-Stopper ' ı l i huni açılışına takın, ters şişe A 'nın kenarını vurmak için sineklerin Pipet ucunu dışarı kaymasına ve hunin kökü ile B şişesine düşmesine izin verir. Eğer herhangi bir eski gıda şişe A daha az kompakt hale gelirse, o zaman şişe A ters ve çaldı düşebilir. Böyle bir durumda, şişe A üzerinden B şişesini ters çevirin ve sineklerin B şişesine kadar gezinmesine izin verin.
- T-Stopper ' ı F-Stopper ' a ayırın. T-Stopper ' ı k i pipet ucu ucunu bir 200 μL mikrosantrifüjle tüp ile kapla Aksi takdirde, T-Stopper ve replug şişesini çıkarın A. F-Stopper ve replug şişe B çıkarın.
3. immobilizing sinekler tarafından soğutmak
- Kullanmadan önce en az 24 saat boyunca bir-20 °C dondurucu içinde sert refreezable icepacks tutun.
- 20 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) soğutulmuş, sert bir IcePack yerleştirin. biraz su ile aseptik olmayan tıbbi gazlı bez bir parça hafifçe nemlendirin ve yakından IcePack yüzeyine sarılmak için izin. Tıbbi gazlı bez bir sonraki sinek ürpertici yeniden kullanılabilir. Aynı zamanda, ezilmiş buz boş bir şişe Chill.
- Transfer yetişkin sinek Soğutulmuş boş şişe (CEV) içine immobilize gerekir. Ne zaman iki transfer şişeler ayrılır, bir petri çanak veya bir fiş ile CEV kapak ve CEV aşağı aşağı tüm sinekler dokunun ezilmiş buz karşı çev vurmak. Tüm sinekler immobilized kadar bu işlemi birkaç kez yineleyin. Sinekler 30 sn içinde immobilize edilecektir. Sonra, CEV 'i 1 dakika boyunca buzun içine yerleştirin. Bu anestezizasyon için bir kerede çok fazla sinek aktarmak için tavsiye edilmez.
- Soğutulmuş buz paketi kapsayan tıbbi gazlı bez üzerine uçar dökün. Bir boya fırçası ile çakışan sinekler dışarı yaymak ve her sinek icepack soğuk yüzeyi tarafından soğutulmuş olabilir emin olun. Eğer bir soğutulmuş sert IcePack hafifçe şişiyor, bir havlu üzerine yerleştirin ve düz tarafında çalışır.
- Stereomicroscope sahne kliplerini çıkarın, bir parça plastik film ile sahne kapağı ve sahne üzerine IcePack koymak. Üst ışığı açın (soğuk ışık kaynağı arzu edilir), mikroskoptan odaklanın ve soğutulmuş sinekler açıkça görülebilir kadar IcePack taşıyın.
4. öldürmek yetişkin sinekler için sayma, sıralama veya atma
- Transfer yetişkin boş bir şişe içine uçar ve bir petri tabak ile kapak.
- Şişenin tersine çevirin, 1 dakika + 20 s mikrodalga fırında ısıtın ve ölü sineklerin Petri tabağına düşmesine izin verin.
- Koruyucu iş eldivenlerini giy ve şişenin mikrodalgayı dışarı çıkar. Beyaz bir kağıt kartı üzerine ölü uçar dökün, saymak veya stereomicroscope altında bir mikrodissecting iğne ile sinekler incelemek ve gözlem sonrası bir çöp içinde sinek organları bertaraf.
- İstenmeyen sinekler öldürmek için, bir mikrodalga fırında 2-3 dakika için sinekler ısı, sonra bir çöp içine karkas dokunun olabilir.
Not: Bazı kanat mutant suşları öldürmek için tavsiye edilmez (örneğin, Kanat uzunluğu mutantlar) muayene için, kanatların vahşi tip uçar görülen karın ucu ötesine uzatırsanız karkas Yargıç zor olduğu gibi.
5. şişe şeklinde yumurta toplama kafesi Içinde/dışına uçar aktarma
Not: Yukarıda belirtildiği gibi, T-ve F-Stoppers yumurta toplama kafesi içine ve dışına sinek aktarmak için kullanılır. Sineklerin bu süreçte anestezize edilmesi gerekmez. Elma suyu orta, yumurta toplama ve dechorionization hazırlama gibi diğer detaylar, literatürde bulunabilir12.
- Yumurta toplama kafesini elma suyu plakasına takın veya elma suyu plakasını yumuşak bir içki şişesinden yapılmış kafeye bağlayın. Parafin filmi bir şerit ile iki bileşen etrafında eklem mühür.
- Kafesin içine mümkün olduğunca çok sayıda sinek yerleştirin ve sinekleri aktardıktan sonra bir köpük stoper ile kafes yeniden takın.
- Kafeste sinekler için yiyecek değiştirmek için, boş bir şişeye kafeste sinekler aktarın.
- Elma suyu plakasını değiştirin ve yeniden mühürleyin, ardından sinekleri şişenin geri kafesine aktarın.
- Yumurta koleksiyonu bittiğinde, uçlarını boş bir şişeye aktarın ve onları kültür şişesine aktarın.
6. cam kültür şişeleri Temizleme
Not: Genellikle, eski bir kültür şişe canlı sinekler içerir. Burada açıklanan protokolde, bu sinekler transgenik sinekler sürece temizlik önce öldürülmelidir yok.
- Islak, paslanmaz çelik süngerleri ile cam kültürü şişeleri herhangi bir kalıcı marker mürekkep çıkarın.
-
Akan suda kültür şişeleri emmek.
- Bir laboratuar Lavaboyu suyla doldurun, suya sıvı bulaşık sabununu ekleyin ve karıştırın.
- Su içine kültür şişeleri batırın, daha sonra su şişe içine çalıştırmak için izin, sonra fişi çıkarın. Suyun içindeki çanak deterjan, kalan yetişkinlerin dibe batmasını ve suda boğulmasını sağlayacak.
- En az 30 dakika su eski kültür şişeleri emmek.
- Matkap deliğini gevşetin, test tüpü fırçasını takın ve aynası yeniden sıkın. Döndürme seçicinin yönünü kontrol edin ve matkap saat yönünde döner emin olun. Hız tetiği ayarlayın ve maksimum hız 500 rpm 'den daha az olduğundan emin olun.
-
Kültür şişeleri temizleyin.
- Kültür şişeleri kabaca temizleyin.
- Baskın olmayan el üzerinde uzun bir manşet kauçuk eldiven koyun ve suda şişe tutun.
- Akülü tüp fırça sürücüsünü çıplak dominant el ile tutun, fırça kültür şişesinin içine sıkın ve tetiği sıkın.
Not: Pili suya daldırmayın. Dönen fırça eski gıda, pupa, vb kırmak ve atık% 95 daha fazla kaldırmak olacaktır. - Ayrı bir çöp tenekesi içine atık dökümü. Her şişedeki atıkların çoğu temizlenene kadar bu işlemi tekrarlayın.
- Kültür şişeleri iyice temizleyin.
- Tüp fırça temizleyin, drenaj ve lavabo temizlemek ve temiz su ile doldurun.
- 6.4.1 bölümünde açıklandığı gibi her kültür şişesinin kalan atıkları çıkarın.
- Kültür şişeleri kabaca temizleyin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
T ve F-Stoppers, herhangi bir sinek aktarımı faaliyetinde adapte edilebilir ve kullanılabilecek basit araçlar kümesi olarak geliştirilmiştir. Eski bir kültürden birkaç taze kültürden uçar transfer taze şişeleri fişleri kaldırma, F-Stoppers ile yerine, sonra eski şişede sinekler aşağı dokunarak, hızlı bir şekilde fiş kaldırarak ve bir T-Stopper ile yerine içerir. Eski gıda kompakt ise, o zaman eski şişe çevirmek ve T-Stopper ucu bir F-Stopper açılışı içine eklemek önemlidir, sonra taze şiş...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu yazıda Drosophila yetiştirme ve deneylerinde yer alan temel faaliyetlerin işlenmesi için bazı ev yapımı araçlar açıklanmıştır. Bu araçlar basit ama oldukça etkilidir. Neredeyse, herhangi bir laboratuar kolaylıkla bu araçları yapabilirsiniz, ve bir araştırma veya bir öğretim Laboratuvarı belki yerel olarak mevcut değildir hazır bir alternatif bulmak gerekmez.
Sinek aktarımı en yaygın uygulamadır ve Drosophila deneylerinde zor bir iştir. Ne yazık ki, bugüne kadar, hiçbir açı...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarın ifşa etmesi gereken bir şey yok.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Bir çift pense | |||
| Akülü matkap sürücüsü | maksimum hız: 500 rpm | ||
| Elektrikli havya | |||
| Dosya | |||
| Hunisi | disk çapı< 60mm | ||
| Buz kutusu | |||
| Böcek pimleri | |||
| Kızılötesi termometre | HCIYET HT-830 | ||
| Uzun manşet lastik eldivenler | |||
| Mekanik kalemler | |||
| Tıbbi gazlı bez | |||
| Mikrosantrifüj tüpü | 100 ul | ||
| Mikrodalga fırın | |||
| Parafilm | |||
| Peri kabı | iç çapı 60 mm | ||
| Pipet uçları | 1 ml | ||
| Plastik film | |||
| Plastik Peri kabı | ve Phi; Boş şişeyi kapatmak için kullanılan 36 mm | ||
| Nokta cımbız | |||
| Koruyucu iş eldivenleri | |||
| Yeniden dondurulabilir sert buz paketleri | 26.5 kez; 14.5 kez; 2,5 cm veya daha büyük | ||
| Kauçuk hava üfleyici | |||
| Çıtçıtlı kesici | |||
| Meşrubat şişesi | 500 ml, iç çap c.a. 65 mm | ||
| Sünger tıpa | |||
| Paslanmaz çelik süngerler | |||
| Tüp fırça | |||
| Flakon | ve Phi; 34 mm ve süreler; 90 Milimetre |
Kaynaklar
- Jennings, B. H. Drosophila – a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
- JoVE Science Education Database. Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. An Introduction to Drosophila melanogaster. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
- Ashburner, M., Roote, J. Laboratory Culture of Drosophila. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 585-599 (2000).
- Greenspan, R. J. Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (2004).
- Ashburner, M., Thompson, J. The laboratory culture of Drosophila. The genetics and biology of Drosophila. Ashburner, M., Wright, T. R. F. 2a, Academic Press. 1-109 (1978).
- Ratterman, D. M. Eliminating ether by using ice for Drosophila labs. Tested Studies For Laboratory Teaching. O'Donnell, M. A. , 259-265 (2003).
- Culturing techniques for Drosophila . , Available from: https://www.ptbeach.com/cms/lib/NJ01000839/Centricity/Domain/113/ap%20biology%20Labs/Culturing%20techniques%20for%20Drosophila.pdf (2019).
- Markow, T. A., O'Grady, P. M. Drosophila: A Guide to Species Identification and Use. , Academic Press. (2006).
- Artiss, T., Hughes, B. Taking the Headaches Out of Anesthetizing Drosophila: A Cheap & Easy Method of Constructing Carbon Dioxide Staging. The American Biology Teacher. 69 (8), e77-e80 (2007).
- Qu, W. -H., Zhu, T. -B., Yang, D. -X. A Modified Cooling Method and its Application in Drosophila Experiments. Journal Of Biological Education. 49 (3), 302-308 (2015).
- Egg-laying cages for drosophila. , Available from: https://www.kisker-biotech.com/frontoffice/product?produitId=0H-19-17 (2018).
- Roberts, D. B. Drosophila: a practical approach. , 2nd edn, Oxford University Press. (1998).
- Tang, M., Peng, Q. -F., Yang, D. Two devices for Drosophila experiments (in Chinese). Bulletin of Biology. 45 (11), 49-50 (2010).
- Zhou, T. -y, Gan, J., Yang, D. Preparation of sponge plug and sponge plug based fly transferring device for Drosophila experiments (in Chinese). Bulletin of Biology. 46 (6), 49-50 (2011).
- Yang, D. Genetics laboratory investigation. , 3rd edn, Science Press. (2016).
- Yang, D. Carnivory in the larvae of Drosophila melanogaster and other Drosophila species. Scientific Reports. 8, (2018).
- Stocker, H., Gallant, P. Getting Started: An Overview on Raising and Handling Drosophila. Drosophila: Methods and Protocols. Dahmann, C. , Humana Press. (2008).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
