Method Article

Stimululated Raman saçılma dayalı doğrusal olmayan mikroskop uygulanması

DOI:

10.3791/59614

⸱

July 6th, 2019

 ,  ,  , 
1National Research Council, Institute for Microelectronics and Microsystems, Naples Unit, Italy

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda, SRS deneysel kurma işleminin lazer tarama mikroskobu ile entegrasyonu ile elde edilen, stimüle edilen Raman saçılma (SRS) mikroskobu uygulaması açıklanmıştır. SRS mikroskobu iki femtosaniye (FS) lazer kaynakları, bir TI-safir (TI: sa) ve senkronize optik parametrik osilör (OPO) dayanmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stimüle Raman saçılma (SRS) mikroskopisi yakın kızılötesi uyarma ışığı kullanır; Bu nedenle, birçok multi-foton mikroskobik görüntüleme özelliklerini paylaşır. SRS görüntüleme modalitesi, uygun bant geçiren filtreleri ve kilitleme amplifikatörü (LIA) algılama düzenine sahip, Taramasız bir İleri dedektör ile donatılarak ticari lazer tarama mikroskopları kullanılarak elde edilebilir. Tipik bir SRS mikroskobu Şematik düzeni aşağıdakileri içerir: iki darbeli Lazer kiriş, (yani, pompa ve prob bir tarama mikroskop yönlendirilmiş), hangi görüntü düzleminde hem boşluk ve zaman içinde çakışan olmalıdır, daha sonra içine bir mikroskop amaç odaklı iki tarama aynalar (SMs) ile örnek, hangi raster bir x-y düzlem arasında odak nokta. Numune ile etkileşimden sonra, iletilen çıkış darbeleri üst objektif tarafından toplanır ve ters mikroskopla takılan ileri algılama sistemiyle ölçülür. Pompa darbeleri bir optik filtre yığınıyla kaldırılır, ancak numunenin odak hacminde oluşan SRS sürecinin sonucu olan prob darbeleri bir fotodiyot (PD) ile ölçülür. PD 'nin okuması modülasyon derinliği ayıklamak için LIA tarafından kipi çözülmüş. İki boyutlu (2D) görüntü, ileri algılama birimini mikroskop tarama ünitesi ile senkronize ederek elde edilir. Bu yazıda, SRS mikroskobu uygulanması, 3 μm çapları ile polistiren boncukların etiket içermeyen görüntülerinin raporlanması ve başarıyla gösterilmiştir. Bu SRS mikroskoplar ticari olarak mevcut değildir, bu nedenle bu özelliklerin yararlanmak için, ev yapımı inşaat tek seçenektir dikkati çekiyor. SRS mikroskopisi birçok alanda popüler hale geldiğinden, SRS mikroskop uygulamasının bu dikkatli açıklamasını bilimsel topluluk için çok yararlı olabilir inanılmaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaşam bilimi uygulamalarında SRS mikroskobu, etiket içermeyen görüntüleme için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. SRS mikroskobu temel fikri vibrasyonel kontrast gücünü ve birkaç saniye içinde görüntü edinme yeteneğini birleştirmek için.

SRS, iki lazer ışınları frekansları arasındaki frekans farkının (farklı frekanslarda pompa sinyali ve Stokes sinyali) incelendiği bir numunenin moleküler titreşimi ile eşleştiğini, uyarılmış Raman saçılma ve önemli bir Stokes sinyalinde artış. Doğrusal Raman spektroskopisinin aksine SRS, gelen ışık alanlarına doğrusal olmayan bir bağımlılığı sergiler ve tutarlı radyasyon üretir. SRS 'nin iki temel avan....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Lazer sistemini başlatma

  1. Soğutucular sıcaklığının 20 °C ' de veya altında muhafaza edildiğini kontrol edin.
  2. Nem kontrol biriminin düzgün çalışıp çalışmadığını kontrol edin ve nem% 40 civarında bir değere tutulur.
  3. Kılavuzundaki talimatları kesinlikle izleyerek Ti: sa lazerini açın.
  4. 810 nm için dalga boyu ayarlayın.
  5. OPO ve bağlı mini bilgisayarı açın. OPO lazer denetleyen uygulamayı çalıştırın.
  6. Seçin bypass if 100% TI: sa lazer çıktısı OPO kutusunun çıkışında gereklidir.
  7. TI: sa lazer çıkışının% 20 ' si ve OPO lazer çıkışı OPO kutusunun çıkışında gerektiğinde bypass....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 7' de SRS ölçümü (örneğin tek BIR noktada SRS ölçümü) örneği bildirilir. Kirişler zaman veya uzayda örtüşmez olduğunda, elde edilen sonuç Şekil 8A'da bildirilir. Off-rezonansta, LıA tarafından ölçülen sinyalin genliği sıfırdır, ancak LıA tarafından ölçülen sinyal faz negatif ve pozitif değerler arasında atlar. Ancak, kirişler uzayda örtüşürken, gecikme çizgisini uygun bir aralıkta hareket ettirirken, elde edilen sonuçlar Şekil 8B'de.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SRS mikroskopisi, özellikle hücreler ve hücresel mimari için temel olan lipidler gibi kompleks biyolojik yapıların çalışmalarda, yeni yüksekliklere etiket içermeyen görüntüleme aldı. Lipidler biyolojik membranların üretimi gibi birden fazla fizyolojik yol içinde yer alan ve biyosentetik öncüleri ve sinyal Dönüştürücüsü olarak hizmet10. Lipidler, lipid damlacıkları (LDs) olarak da adlandırılan özel hücre içi organellere paketlenmiştir. Çapları birkaç onlarca nanometreden onlarca mikrometre

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiç bir ilgi çatışması bildirmiyor.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Değerli teknik yardımları için ıMM CNR 'dan V. Tufano 'Yu ve kullanışlı tartışmalar ve sürekli destek için Nikon Instruments 'ın ürün uzmanı Giacomo Cozzi 'i takdir ediyoruz. Bu çalışmanın kısmen Italyan Ulusal operatif programlar PONa3 00025 (BIOforIU) ve Euro-Bioımaging büyük ölçekli panEuropean araştırma altyapı projesi tarafından desteklenmektedir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Edinme aracıNikonNikon C2ToolEdinme desteklenen araç
APE Darbe bağlantı kontrol yazılımıAPE-APEDarbe bağlantı kontrol yazılımıyazılım kontrolü
OtokorelatörAPEAPE PulseCheck USB 50Otokorelatör
DedektörüThorlabsThorlabs DET10AFotodiyot
Dedektör kartıThorlabsThorlabs VRCIR dedektör Kartı
Dikroik aynaSemrockSemrock FF875-Di01-25X36Dikroik ayna
Dikroik aynaSemrockFF875-Di01-25x36Dikroik ayna
EOMConopticsEOM CONOPTICS 3350-160 KD*P).Pockels hücresi
Hızlı dedektörThorlabsThorlabs DET025AL/MFotodiyot
Hızlı ayna tarama ünitesiNikonC2Microscpe tarama kafası
Femtosaniye lazer Ti:SATutarlıTutarlı Bukalemun Ultra IIBukalemun Ultra II
Fonksiyon üreteciTTiTG5011 AIM – TTiFonksiyon üreteci
Ters optik mikroskopNikonEclipse TE-2000-E, NikonEclipse TE-2000-E, Nikon
Kilitli AmplifikatörStandford Araştırma SistemiSR844-200 MHz çift fazlıStanford Research Systems'den kilitli bir amplifikatör
Çentik filtresi,SemrockNF03-808E-25Çentik filtresi
Optik gecikme hattıNewport Newport M-ILS200CCAyarlanabilir optik gecikme hattı
Optik Parametrik Osilatör TutarlıTutarlı Kompakt OPOTutarlı Kompakt OPO
OsiloskopWaveRunner640Zi 4GHz OSC/LeCroyDijital Osiloskop
PCI KartıUlusal enstrümanNI PCIe 6363Veri edinme kartı
Konum Sensörleri DedektörlerNewportNewport Conex PSD9Konum dedektörü sensörü
Güç ölçer kafasıTutarlıPowerMax PM10,Lazer güç dedektörü
Çeviri AşamalarıThorlabsThorlabs PT1 / MStandart Mikrometre ile Mekanik Çeviri Aşaması
(

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Saar, B. G., et al. Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  2. Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissu....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Stimulated Raman ScatteringNonlinear MicroscopyLaser AlignmentLock in AmplifierForward DetectionBeam OverlapLabel free ImagingPolystyrene BeadsVibrational ContrastMicroscope Implementation

Related Articles