Biz poxvirus enfekte hücreler içinde vitro transkripsiyonu RNA tabanlı Lusiferaz muhabir assay kullanarak mRNA çeviri Yönetmeliği çalışmak için bir protokol sunuyoruz. Tahlil, 5 '-untranslated bölgesi (UTR) ve 3 '-UTR dahil olmak üzere bir mRNA BDTelemanları tarafından çeviri Yönetmeliği eğitim için kullanılabilir. Bu yöntem kullanılarak farklı çeviri başlatma modları da incelenebilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
In vitro transkripsiyonu RNA tabanlı luciferase Reporter assay Poxvirus-virüslü hücrelerde çeviri Yönetmeliği çalışma
Bu makalede
Özet
Özet
Viral DNA replikasyonu sonrasında yapılan her poksvirüs mRNA, 5 '-UTR ' a evrimsel olarak koruma altına alınan, templated olmayan 5 '-Poly (A) lideridir. Poksvirüs enfeksiyonu sırasında mRNA tercüme 5 '-Poly (A) lideri rolünü incelemek için biz bir in vitro transkripsiyonu RNA tabanlı Lusiferaz muhabir tahlil geliştirdi. Bu muhabir tahlil dört temel adımlardan oluşur: (1) PCR in vitro transkripsiyon için DNA şablonunu yükseltmek için; (2) T7 RNA polimeraz kullanarak mRNA oluşturmak için in vitro transkripsiyon; (3) hücrelerde in vitro transkripsiyonu mRNA 'yı tanıtmak için transfeksiyon; (4) tercüme göstergesi olarak Lusiferaz aktivitesinin tespiti. RNA tabanlı Lusiferaz muhabir tahlil burada açıklanan poxvirus enfekte hücreler ve plazmid gelen şifreli transkripsiyon plazmid çoğaltma sorunları circumvents. Bu protokol, poxvirus enfekte hücreler dışındaki sistemlerde 5 '-UTR ve 3 '-UTR dahil olmak üzere bir mRNA BDTelemanları tarafından çeviri düzenleme belirlemek için kullanılabilir. Dahası, bu yöntem kullanılarak Cap-bağımlı, Cap-bağımsız, yeniden başlatma ve iç başlatma gibi farklı çeviri başlatma modları incelenebilir.
Giriş
Orta dogma 'ya göre, genetik bilgiler DNA 'dan RNA 'ya ve sonunda protein1,2' ye akar. Genetik bilgi bu akışı yüksek mRNA çeviri3,4dahil olmak üzere birçok düzeyde düzenlenir. Bu süreçte yer alan düzenleyici mekanizmaların anlaşılması, Gen ifadesinin düzenlenmesini ölçmek için gazetecinin geliştirilmesi konusunda yardımcı olmaktadır. Burada poxvirus enfekte hücrelerde bir in vitro transkripsiyonu RNA tabanlı Lusiferaz muhabir tahlil kullanarak mRNA çeviri çalışması için bir protokol açıklanmaktadır.
Poxvirüsler birçok son de....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. In vitro transkripsiyon için PCR tarafından DNA şablonunun hazırlanması
- DNA şablonunu PCR tarafından hazırlamak için, tasarım astar. Astarları tasarlarken, astar uzunluğu, tavlama sıcaklığı (Tm), GC Içeriği, G veya C ile 3 ' End vb. gibi önemli özellikleri dikkate alın.
Not: Bu literatürde ayrıntılı olarak25,26,27. - 5 '-3 ' yönünde aşağıdaki unsurları içeren PCR amplikon oluşturmak için tasarım astar: T7-Promoter, Poly (a) lideri, Firefly Lusiferaz ORF ve Poly (a) kuyruk T7_12A-Fluc olarak atıfta. Şablon DN....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
İn vitro transkripsiyon RNA tabanlı Lusiferaz Reporter tahlil dört adım: PCR In vitro transkripsiyonu için DNA şablonu oluşturmak için, mRNA üretmek için in vitro transkripsiyon, mRNA transfeksiyon, ve Lusiferaz ölçümü, şematik diyagramda görülebilir ( Şekil 1). Hem DNA şablonları (Fluc ve rluc) hem de çıkıntı uzantısı PCR genel şeması için astar tasarımı şematik olarak gösterilmiştir (Şekil 2a). PCR 'den sonra, doğru boyutlu PCR.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Tüm dört çekirdekli adımlar in vitro transkripsiyonu RNA tabanlı Lusiferaz muhabir tahlil başarısı için önemlidir. Özellikle T7 Organizatör dizisi için primer tasarıma özel dikkat verilmelidir. T7 RNA polimeraz, 5 '-UTR dizisinden önce eklenen T7 promotör 'de ilk altı çizili G (ggg-5'-UTR-Aug-) den transkripsiyon başlar. Transkripsiyon başlangıç sitesi (TSS) 5 ' ucunda ilk g 'den başlaysa da, T7 Organizatör bölgesinde 3 ' ten az olan g sayısının azaltılması RNA verim/çıkışını in vitro transkripsiyondan düşürmüştür.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rakip mali faiz bildirmek istiyorum.
Teşekkürler
Proje, Ulusal Sağlık Enstitüleri (AI128406 www.nih.gov) tarafından ZY 'ye ve kısmen Johnson Cancer Research Center (http://cancer.k-state.edu) tarafından PD 'ye Lisansüstü öğrenci yaz maaşları şeklinde finanse edildi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 2X-Q5 Master karışımı | New England Biolabs | M0492 | PCR |
| 3&akut;-O-Me-m7G(5 ')ppp (5') G RNA Kapak Yapısı Analog | New England Biolabs | S1411L | Anti ters Kapak analog veya ARCA |
| Corning 96 Kuyu Yarım Alan beyaz düz tabanlı polistiren mikroplaka | Corning | 3693 | Opak duvarlı 96 kuyulu beyaz plaka, sağlam tabanlı |
| Çift Lusiferaz Raportör Test Sistemi | Promega | E1960 | Çift Lusiferaz Test Kiti (DLAK) |
| E.Z.N.A. Döngü Saf Kiti | OMEGA BIO-TEK | D6492 | PCR saflaştırma kiti |
| GloMax Navigator Mikroplaka Luminometre | Promega | GM2010 | Çok modlu plaka okuyucu luminometre olarak anılır |
| HiScribe T7 Hızlı Yüksek Verimli RNA sentez Kiti | New England Biolabs | E2050S | In Vitro transkripsiyon kiti |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Katyonik lipid transfeksiyon reaktifi |
| NanoDrop2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | DNA ve RNA konsantrasyonunu ölçmek için kullanılır |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Azaltılmış serum ortamı |
| Purelink RNA Mini Kiti | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | RNA arıtma kiti |
| Vaccinia Kapatma Sistemi | New England Biolabs | M2080 | Kapatma sistemi |
Kaynaklar
- Crick, F. H. On protein synthesis. Symposia of the Society for Experimental Biology. 12, 138-163 (1958).
- Crick, F. Central Dogma of Molecular Biology. Nature. 227, 561-563 (1970).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
