Bu protokol bir prob tabanlı gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), bir sülforhodamin içinde B (SRB) tahlil, 3 ' tercüme edilmemiş bölgeler (3 ' UTR) klonlama ve bir Lusiferaz tahlil ilgi bir Mirna hedef genler doğrulamak ve mirnas işlevlerini anlamak için kullanır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Tümör hücrelerinde MicroRNA seviyeleri, fonksiyonları ve Ilişkili hedef genler değerlendirmek için bir In vitro protokol
Bu makalede
Özet
Özet
MicroRNAs (miRNAs), kanserler de dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda çok sayıda hücre içi sinyalizasyon yollarını modülasyon olarak tanınan küçük düzenleyici RNAs 'lardır. Bu küçük düzenleyici RNAs ağırlıklı olarak 3 ' tercüme edilmemiş bölgeler (3 ' UTR) hedef haberci RNAs (mRNAs) ile etkileşim sonuçta mRNAs çözme süreçlerinin inhibisyonu ve hedef mRNA degradations büyütme sonuçlanan. MiRNAs, ifade düzeylerine ve hücre içi işlevlere bağlı olarak Onkojenik ve tümör bastırıcı MRI 'nin düzenleyici faktörler olarak hizmet verebilir. Yüzlerce ve hatta binlerce hesaplamalarıyla öngörülen hedefler arasında bir miRNA 'nın iyi niyetli hedef genlerinin tanımlanması, bir miRNA 'nın rol ve temel moleküler mekanizmalarını ayırt etmek için önemli bir adımdır. Çeşitli miRNA hedef tahmin programları olası miRNA-mRNA etkileşimlerini aramak için kullanılabilir. Ancak, en zorlu soru nasıl bir miRNA ilgi doğrudan hedef genleri doğrulamak için. Bu protokol bir miRNA işlevi ile ilgili miRNA hedeflerini tanımlamak nasıl anahtar yöntemleri tekrarlanabilir bir strateji açıklanır. Bu protokol, Mirna seviyeleri, fonksiyonları ve ilgili hedef mrnas 'ı Probe tabanlı gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), sülforhodamin içinde B (SRB) tahlil bir Mirna taklit transfeksiyon aşağıdaki kullanarak ortaya çıkarmak için adım adım prosedürler üzerinde pratik bir kılavuz sunar , doz-yanıt eğrisi oluşturma, ve Lusiferaz tahlil birlikte klonlama ile 3 ' UTR bir gen, hangi bireysel mirnas rollerini doğru anlayış için gerekli olan.
Giriş
MicroRNAs (miRNAs), özellikle haberci RNAs 'ın (mRNAs) tercüme ve bozulma sürecini, gerçek hedef genler1' de 3 ' tercüme edilmemiş bölgeye (3 ' UTR) tepki vererek modüle eden küçük düzenleyici RK 'lerdir. Mirnas 'ın ifadesi transkripsiyon ve post-transkripsiyonel mekanizmalar tarafından düzenlenebilir. Bu tür Düzenleyici mekanizmaların dengesizliği, kanserler de dahil olmak üzere sayısız hastalıklarda kontrolsüz ve ayırt edici miRNAs ifade düzeylerini getiriyor2. Tek bir miRNA çeşitli MRI 'lar ile birden fazla etkileşime sahip olabilir. Buna karşılık, bireysel mRNA çeşitli miRNAs tarafından kontrol edilebilir. Bu nedenle....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. olgun MicroRNA (miRNA) Ifade Analizi
-
Olgun miRNA tamamlayıcı DNA (cDNA) sentezini
- 254 ng toplam RNA ve 4,5 μL deoksirribonuclease ı (DNase ı) karışımları ekleyin ve sonra 18 μL (Şekil 2a) yapmak için PCR Strip-tüpler içine ultra saf su ekleyin. Toplam reaksiyon sayısına dayalı olarak yeterli sayıda DNase ı karışımı kullanarak çeşitli hücre hatlarından arındırılmış her toplam RNA örneği için reaksiyonu hazırlayın.
Not: DNase ı karışımları DNase ı (1,8 μL), ribonükleaz inhibitörü (0,3 μL) ve 25 mm MgCl2 (2,4 μL) ' den oluşur. Toplam RNA 'nın yeniden üretilebilirliği içi....
- 254 ng toplam RNA ve 4,5 μL deoksirribonuclease ı (DNase ı) karışımları ekleyin ve sonra 18 μL (Şekil 2a) yapmak için PCR Strip-tüpler içine ultra saf su ekleyin. Toplam reaksiyon sayısına dayalı olarak yeterli sayıda DNase ı karışımı kullanarak çeşitli hücre hatlarından arındırılmış her toplam RNA örneği için reaksiyonu hazırlayın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
MiRNA 'nın sınıflandırılmasının, bir hastalığın gelişimi ve ilerlemesinde miRNAs 'ın beklenen rollerini temel alan verilerin yorumlanması için başarılı ve doğru bir şekilde onaylaması önemlidir. MiRNA-107 ve miRNA-301 seviyeleri, prob bazlı niceliksel PCR kullanılarak üç pankreas hücresi çizginde ölçülmüştür. Hem belirli bir miRNA 'nın hem de aynı reaksiyonda bir referans geni olan cDNAs sentezini veri yeniden üretilebilirliğini artırabilir. Panc-1 ve capan-1 insan pankreatik duktal adenokarsinoma hücre hatları, hpne ins.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
MiRNA 'nın bir miRNA 'nın fonksiyonları ile en uygun şekilde belirlenmesine yönelik stratejiler, Mırnas 'ın birden çok rolünün anlaşılması için vazgeçilmez bir unsurdır. MiRNA hedef genlerinin tanımlanması, bir hücrede miRNAs tarafından modüle edilen hücre sinyalizasyon olaylarını yorumlamak için bir kılavuz olabilir. MiRNAs 'ın işlevsel olarak önemli hedef genlerinin bir açıklanması, kanserde miRNA tabanlı bir tedavi geliştirmek için temel bilgi sağlayabilir.
Mikrodiziler, küçük RNA Kütüphane.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Bu çalışmada, Eğitim Bakanlığı (2017R1D1A3B03035662) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) aracılığıyla temel bilim araştırma programı tarafından destekleniyordu; ve Hallym Üniversitesi Araştırma Fonu, 2017 (HRF-201703-003).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 15 mL konik tüp | SPL Yaşam Bilimleri | 50015 | |
| 24 oyuklu plaka | Thermo Scientific | 142475 | |
| 50 mL konik tüp | SPL Yaşam Bilimleri | 50050 | |
| 6 oyuklu plaka | Falcon | 353046 | |
| 6x DNA yükleme boyası | Real Biotech Corporation | RD006 | 1 mL |
| 8 kapaklı şerit | Uygulandı Biyosistemler | N8010535 | cDNA sentezi için |
| 8 tüplü şerit | Uygulamalı Biyosistemler | N8010580 | cDNA sentezi için |
| 96 oyuklu plaka | Falcon | 353072 | |
| Asetik asit | Sigma | A6283-1L | 1 L |
| Agaroz A | Bio Basic | D0012 | 500 g |
| Alkalin fosfataz | New England Biolabs | M0290S | 10.000 U/mL |
| Ampisilin | Bio basic Canada Inc | AB0028 | 25 g |
| AriaMx 96 tüp şeritleri | Gerçek zamanlı PCR için | Agilent Technologies | 401493 |
| AriaMx gerçek zamanlı PCR sistemi | Agilent Technologies | G8830A | qPCR amplifikasyonu, tespiti ve veri analizi |
| AsiSI | New England Biolabs | R0630 | 10.000 ünite/mL |
| CAPAN-1 hücresi | ATCC | HTB-79 | |
| Hücre kültürü başlığı | Labtech | Modeli: LCB-1203B-A2 | |
| V-eğik çizgili sayma odaları | Paul Marienfeld | 650010 | Hücre sayacı |
| CutSmart tamponu | New England Biolabs | B7204S | 10X konsantrasyon |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | 500 mL |
| DNA jel ekstraksiyon kiti | Bionics | DN30200 | 200 hazırlık |
| DNA merdiveni | NIPPON Genetics EUROPE | MWD1 | 1 Kb merdiven |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | 100 birim |
| Çift lusiferaz raportör tahlil sistemi | Promega | E1910 | 100 tahlil |
| Fetal sığır serumu | Gibco | 26140-079 | 500 mL |
| HIT yetkin hücreler | Gerçek Biyoteknoloji Şirketi (RBC) | RH617 | Yetkili hücreler |
| HPNE hücreleri | ATCC | CRL-4023 | |
| LB agar suyu | Bio Basic | SD7003 | 250 g |
| Lipofektamin 2000 | Invitrogen | 11668-027 | 0.75 mL |
| Lipofektamin RNAiMax | Invitrogen | 13778-075 | 0.75 mL |
| Luminometre | Promega | Model: E5311 | |
| Mikrosantrifüj tüpü | Eppendorf | 22431021 | |
| Mikroplaka okuyucu | TECAN | Infinite F50 | |
| miRNA kontrol taklidi | Ambion | 4464058 | 5 nmole |
| miRNA-107 taklit | Ambion | 4464066 | 5 nmole |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | 50 hazırlık |
| Mupid-2plus (elektroforez sistemi) | TaKaRa | Model: AD110 | |
| NotI | New England Biolabs | R3189 | 20.000 birim/mL |
| Oligo kaşif programı | GeneLink | Astar tasarımı için | |
| Optik tüp şerit kapakları (8x Şerit) | Agilent Technologies | 401425 | Gerçek zamanlı PCR için |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | 500 Ml |
| PANC-1 hücreleri | ATCC | CRL-1469 | |
| Penisilin / streptomisin | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
| Fosfat tamponu salin | Gibco | 14040117 | 1000 mL |
| Plazmid DNA miniprep S & V kit | Biyonik | DN10200 | 200 hazırlık |
| PrimeSTAR GXL DNA polimeraz | TaKaRa | R050A | 250 birim |
| Çalkalayıcı | TECAN | Çalkalama platformu | |
| Çalkalama inkübatörü | Labtech | Model: LSI-3016A | |
| Sigmaplot 14 yazılımı | Systat Software Inc | Doz-yanıt eğrisi üretimi için | |
| Sulforhodamine B tozu | Sigma | S1402-5G | 5 g |
| SYBR yeşil ana karışım | Smobio | TQ12001805401-3 | için bağlayıcı floresan boya |
| TaKaRa | 2011A | 25.000 U | |
| TaqMan ana karışımı | Uygulamalı Biyosistemler | 4324018 | 200 reaksiyon, AmpErase UNG |
| TaqMan mikroRNA testi yok (has-miR-107) | Uygulamalı Biyosistemler | 4427975 | Tahlil Kimliği: 000443 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan mikroRNA testi (has-miR-301) | Uygulamalı Biyosistemler | 4427975 | Testi Kimliği: 000528 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan miR RT kiti | Uygulamalı Biyosistemler | 4366597 | 1.000 reaksiyon |
| Thermo CO2 inkübatörü (BB15) | ThermoFisher Scientific | 37 ° C ve %5 CO2 inkübasyon | |
| Trikloroasetik asit | Sigma | 91228-100G | 100 g |
| Trizma baz | Sigma | T4661-100G | 100 g |
| Ultrasaf su | Invitrogen | 10977-015 | 500 mL |
| Veriti 96 kuyulu termal döngüleyici | DNA'nın (veya cDNA'nın) amplifikasyonu için | Uygulamalı BiyosistemlerXhoI | |
| New England Biolabs | R0146 | 20.000 birim/mL |
Kaynaklar
- He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).
- Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells. International Journal of Mole....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
