Method Article

Farede Birden Fazla Organdan Zika Virüsünün İzolasyon ve Nicelikselleştirilmesi

DOI:

10.3791/59632

⸱

August 15th, 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology, Saint Louis University, 2School of Veterinary Medicine University of California Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokolün amacı, enfeksiyon sonrasında faredeki birden fazla organdan Zika virüsünü izole ederek ve ölçerek viral hastalıkları araştırmak için kullanılan teknikleri göstermektir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sunulan yöntemler, zika virüsü bulaşmış hayvanlardan organların izole edilmesi ve viral yükün ölçülmesi için laboratuvar prosedürlerini göstermektedir. İşlemin amacı, zika virüs enfeksiyonunu düzenleyen virolojik ve immünolojik faktörleri belirlemek için farklı zaman noktalarında veya farklı deneysel koşullar altında farenin periferik ve CNS bölgelerindeki viral titreleri ölçmektir. Organ izolasyon prosedürleri hem odak lama nın hem de viral titrelerin kantitatif PCR değerlendirmesine olanak sağladığını göstermiştir. Hızlı organ izolasyon teknikleri virüs titresinin korunması için tasarlanmıştır. Odak oluşturarak analiz ile viral titreme quantification Zika virüsünün hızlı iş lenme değerlendirmesi için izin verir. Odak oluşturan testin yararı bulaşıcı virüsün değerlendirilmesidir, bu sadenin sınırlandırılması, tespit sınırını azaltan organ toksisitesi potansiyelidir. Viral titre değerlendirmesi kantitatif PCR ile birleştirilir ve organ içinde rekombinant RNA kopya kontrol viral genom kopya numarası kullanılarak algılama düşük sınırı ile değerlendirilir. Genel olarak bu teknikler, Zika virüsü enfekte hayvanların çevre ve CNS'lerinde Zika viral titrelerinin analizi için doğru bir hızlı yüksek iş elde etme yöntemi sağlar ve en çok enfekte olmuş hayvanların organlarındaki viral titrelerin değerlendirilmesinde uygulanabilir. patojenler, Dang virüsü de dahil olmak üzere.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zika virüsü (ZIKV) flaviviridae ailesine ait bir arbovirüstür, Powassan virüsü gibi önemli nöroinvaziv insan patojenleri içeren (POWV), Japon ensefalit virüsü (JEV), ve Batı Nil virüsü (WNV)1. İzolasyon ve tanımlamasının ardından, Afrika ve Asya'dainsan ZIKV enfeksiyonlarının periyodik raporları 2 ,3,4,5, ve Orta ve Güney Amerika'daki salgınhastalıklar ( referans6). Ancak, yakın zamana kadar ZIKV ciddihastalığaneden olduğu düşünüldü 7 değildi . Şimdi zikv enfeksiyonları ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmanın tüm prosedürleri St. Louis Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından belirlenen yönergelere uygundur. SLU, Uluslararası Laboratuvar Hayvan Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından tamamen akredite edilmiştir.

1. Organ İzole

NOT: Virüs oda sıcaklığında (RT) stabil değildir, bu nedenle bir seferde hasat edilen hayvan sayısı viral titreleri korumak için dikkatlice planlanmalıdır.

  1. Seçilen doz ve rotayı kullanarak farelere gerekli fenotipten yola uyarlanan bulaştırın. Bu protokol için 8-10 haftalık erkek ve kadın tip I interferon ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıda açıklanan protokolü kullanarak ZIKV titrelerini değerlendirmek için Ifnar1-/- farelerayak altına deri altı (SC) enjeksiyonu ile ZIKV (PRVABC59) ile enfekte olmuşlardır. Burada, 8-12 haftalık Ifnar1-/- fareler SC zikv 1 x 105 FFU uygulanması öldürücü değildir ama virüs hem çevre ve CNS çoğalabilir. Bu doz ve rota konak patojen immün yanıtları ve patojenite çalışma için kullanılır. 8-12 haftalık Ifnar1 -/- far.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ZIKV enfeksiyonu nörolojik bir hastalığa neden olabilir bu nedenle mevcut hayvan modellerinin patogenezi, immün yanıtları ve aşıların ve antivirallerin koruyucu etkinliğini incelemesi cns içinde viral kontrole odaklanması gerekir. CNS hastalığına odaklanmanın zorluklarından biri de genellikle periferik enfeksiyonu nitreşme pahasına gelmesidir. Burada önerilen organ izolasyon yöntemleri, CNS aracılı ZIKV ilişkili hastalığı değerlendirmek ve antivirallerin preklinik test için bir model oluşturmak için hem çevre hem de CNS'.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Pinto, Saint Louis Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden bir tohum bağışı ve Saint Louis Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden başlangıç fonları ile finanse edilmektedir. Dr. Brien, NIH NIAID'in K22AI104794 erken araştırmacı ödülü ve Saint Louis Üniversitesi Okulu'ndan bir tohum hibesi ile finanse edilmektedir. Finanse edilen tüm bireyler için fon layıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, makalenin yayımlama kararı veya hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-bromo-3-kloropropan (BCP)MRC geniBP151
10 cc şırıngaThermo Fisher ScientificBD 309642
18 G iğneThermo Fisher Scientific22-557-145
1 cc TB şırıngaThermo Fisher Scientific14-823-16H
20 cc şırıngaThermo Fisher Scientific05-561-66
24 tüp boncuk değirmeniThermo Fisher Scientific15 340 163
3,2 mm paslanmaz çelik boncuklarThermo Fisher ScientificNC9084634
37 ° C Doku Kültürü inkübatörüNuair5800
4G2 evde antikor
96 kuyulu düz tabanlı plakalarMidsciTP92696
96 kuyulu yuvarlak alt plakalarMidsciTP92697
Basix 1.5 mL eppendorf tüpleriThermo Fisher Scientific02-682-002
Konsantre Antiseptik ÇamaşırSuyu Zımbaları30966CT
CTL S6 AnalizörüCTLCTL S6 Üniversal Analiz
Cihazı Kavisli kesme makasıGüzel Bilim Araçları14061-11
Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta - yüksek glikoz 4.500 mg / L glikoz ileMilliporeSigmaD5671
Etanol (moleküler biyoloji sınıfı)MilliporeSigmae7023
Fetal Sığır SerumuMilliporeSigmaF0926-500ML
ForsepsGüzel Bilim Araçları11036-20
Buzlu asetik asitMilliporeSigma537020
Keçi anti-fare HRP etiketli antikorMilliporeSigma8924
HEPES 1 MMilliporeSigmaH3537-100ML
İzopropanol (moleküler biyoloji sınıfı)MilliporeSigmaI9516
Ketamin/Ksilazin kokteyliKarşılaştırmalı Tıp
L-glutaminMilliporeSigmag7513
Magmax RNA saflaştırma kitiThermo Fisher ScientificAM1830
MetilselülozMilliporeSigmaM0512
MikrosantrifüjEpendorf5424R
MiniCollect 0.5 mL EDTA tüpleriBio-one450480
O-ring tüpleriThermo Fisher Scientific21-403-195
Bir adım q RT-PCR karışımıThermo Fisher Scientific4392938
ParaformaldehitThermo Fisher ScientificEMS- 15713-S
Fosfat Tamponlu TuzluMilliporeSigmad8537-500ml
Proline çok kanallı pipetlerSartorius72230/72240
Proline tek kanallı pipetlerSartorius728230
RNAse serbest suThermo Fisher Scientific10-977-023
RNAzol BDMRC geniRB192
Sallanan PlatformThermo Fisher Scientific11-676-333
RPMI 1640FisherMT10040CV
SaponinMilliporeSigmas7900
Kaşık / spatulaGüzel Bilim Araçları10090-17
Düz kesme makasıGüzel Bilim Araçları14060-11
Triton X-100MilliporeSigmat8787
Gerçek Mavi YüzeyVWR95059-168
TripsinMilliporeSigmaT3924-100ML

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lazear, H. M., Diamond, M. S. Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere. Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).
  2. Simpson, D. I. Zika Virus Infection in Man. Transactions of the Royal Society of Tr....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Zika Virus IsolationViral Titer QuantificationFocus Forming AssayQuantitative PCROrgan HarvestingSpinal Cord ExtractionViral Load AnalysisMouse Infection ModelFlavivirus DetectionViral Pathogenesis

Related Articles