Method Article

Farede Birden Fazla Organdan Zika Virüsünün İzolasyon ve Nicelikselleştirilmesi

DOI:

10.3791/59632

⸱

August 15th, 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology, Saint Louis University, 2School of Veterinary Medicine University of California Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokolün amacı, enfeksiyon sonrasında faredeki birden fazla organdan Zika virüsünü izole ederek ve ölçerek viral hastalıkları araştırmak için kullanılan teknikleri göstermektir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sunulan yöntemler, zika virüsü bulaşmış hayvanlardan organların izole edilmesi ve viral yükün ölçülmesi için laboratuvar prosedürlerini göstermektedir. İşlemin amacı, zika virüs enfeksiyonunu düzenleyen virolojik ve immünolojik faktörleri belirlemek için farklı zaman noktalarında veya farklı deneysel koşullar altında farenin periferik ve CNS bölgelerindeki viral titreleri ölçmektir. Organ izolasyon prosedürleri hem odak lama nın hem de viral titrelerin kantitatif PCR değerlendirmesine olanak sağladığını göstermiştir. Hızlı organ izolasyon teknikleri virüs titresinin korunması için tasarlanmıştır. Odak oluşturarak analiz ile viral titreme quantification Zika virüsünün hızlı iş lenme değerlendirmesi için izin verir. Odak oluşturan testin yararı bulaşıcı virüsün değerlendirilmesidir, bu sadenin sınırlandırılması, tespit sınırını azaltan organ toksisitesi potansiyelidir. Viral titre değerlendirmesi kantitatif PCR ile birleştirilir ve organ içinde rekombinant RNA kopya kontrol viral genom kopya numarası kullanılarak algılama düşük sınırı ile değerlendirilir. Genel olarak bu teknikler, Zika virüsü enfekte hayvanların çevre ve CNS'lerinde Zika viral titrelerinin analizi için doğru bir hızlı yüksek iş elde etme yöntemi sağlar ve en çok enfekte olmuş hayvanların organlarındaki viral titrelerin değerlendirilmesinde uygulanabilir. patojenler, Dang virüsü de dahil olmak üzere.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zika virüsü (ZIKV) flaviviridae ailesine ait bir arbovirüstür, Powassan virüsü gibi önemli nöroinvaziv insan patojenleri içeren (POWV), Japon ensefalit virüsü (JEV), ve Batı Nil virüsü (WNV)1. İzolasyon ve tanımlamasının ardından, Afrika ve Asya'dainsan ZIKV enfeksiyonlarının periyodik raporları 2 ,3,4,5, ve Orta ve Güney Amerika'daki salgınhastalıklar ( referans6). Ancak, yakın zamana kadar ZIKV ciddihastalığaneden olduğu düşünüldü 7 değildi . Şimdi zikv enfeksiyonları ile bağlantılı nörolojik hastalık ve doğum kusurları vakaları binlerce vardır. ZIKV'nin hızlı bir şekilde ortaya çıkışı ile ilgili birçok soru yöneltti: neden hastalığın şiddetinde bir artış var, ZIKV enfeksiyonuna immünolojik yanıt nedir ve nörolojik artışa bağlı viral ve/veya immün aracılı patolojiler vardır? belirtileri ve doğum kusurları. Artık ZIKV ile ilişkili merkezi sinir sistemi (CNS) ile ilişkili hastalığı ve antivirallerin ve aşıların ZIKV'e karşı etkinliğini hızla test etme ihtiyacının anlaşılması için acele vardır. Zikv'e özgü odak lama tahlilleri (FFA) kullanarak hem çevre de hem de CNS'de ZIKV titrelerinin hızlı analizi için yöntemler geliştirdiğimiz bu zemine aykırıdır.

Küçük hayvan modelleri hastalığın ilerlemesini anlamak ve aşıların erken değerlendirilmesi için önemlidir, terapötik, ve anti-viral. Biz arbovirüs hastalığı nın çalışması için insan enfeksiyonu ve viral patojenlere karşı koruma modellemek için çeşitli fare suşları kullanarak küçük hayvan modelleri kurduk8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Bu önceki deneyimi kullanarak, wnv ve Dang virüsü, hem periferik organlarda zikv titresinin değerlendirilmesi için ilgili bir flavivirüs değerlendirilmesi için kullanılan teknikleri değiştirmeye başladı hem de CNS21,23, 24- Bu yöntemlerin diğer tahlillere göre avantajları şunlardır: 1) analiz için hem periferik hem de CNS organlarını toplama yeteneğini birleştirdikleri; 2) yöntemleri akış sitometri için uyarlanabilir, doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık yanıtları ölçümleri için, aynı organda aynı hayvan üzerinde viral titreler ile birlikte; 3) hasat tekniği histolojik analiz için uyarlanabilir; 4) ZIKV FFA viral titreşme analizi için hızlı bir yüksek iş elde yöntemidir; ve 5) bu yöntemler en patojenler 25 ile enfekte hayvanlarınorganlarında viral titrelerin değerlendirilmesi için uygulanabilir .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmanın tüm prosedürleri St. Louis Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından belirlenen yönergelere uygundur. SLU, Uluslararası Laboratuvar Hayvan Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından tamamen akredite edilmiştir.

1. Organ İzole

NOT: Virüs oda sıcaklığında (RT) stabil değildir, bu nedenle bir seferde hasat edilen hayvan sayısı viral titreleri korumak için dikkatlice planlanmalıdır.

  1. Seçilen doz ve rotayı kullanarak farelere gerekli fenotipten yola uyarlanan bulaştırın. Bu protokol için 8-10 haftalık erkek ve kadın tip I interferon reseptör eksikliği (Ifnar1-/-) C57BL/6 fareleri enfekte edin.
    1. Ketamin (90 mg/kg) ve Xylazine (10 mg/kg) kokteyli ile Ifnar1-/- fareleri anestezik. Anesteziyi onaylamak için sağlam bir ayak ucutu ile pedal refleksini test edin. 1 x 105 odak şekillendirme ünitelerini (FFU) zikv'in 50 μL subkutan (SC) olarak ayak takımı üzerinden uygulayın.
  2. Bir gün önce hasat için gerekli tüm malzemeleri hazırlayın: 2 makas, forseps ve 20 mL% 70 etanol (EtOH) bir 50 mL konik alet dezenfeksiyon için.
    1. Şırınga ve iğneleri hazırlayın: perfüzyon için 20 mL şırınga, 23 G iğne (kafes başına yaklaşık 1) ve 25 G iğneli 1 mL şırınga (3-5 fare başına 1). Tartım tüplerinden önce, 1,5 mL O-ring vidalı kapak tüplerine (her organ için bir tane) çelik boncuk (kaputiçinde) ekleyin. Tüplerhomojenizasyon için uygun olmalıdır.
  3. Perfüzyon ve organ dondurma için gerekli malzemeleri hasat günü hazırlayın.
    1. Bir buz banyosu yapmak için kuru buz ve% 70 EtOH ile bir buz kovası doldurun. Her perfüzyon için her perfüzyon için PBS fare başına 25-30 mL omurilik için 5-10 mL gerekli olduğunu varsayarak steril fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın. Anestezi, Ketamin ve Xylazine bir kokteyl elde ve fare başına 300 μL varsayalım. Akış sitometrisi, vb. için gerekli olan tüm malzemeleri ve ek tüpleri hayvan tesisine taşınması için ikincil bir konteynere yerleştirin.
  4. Hayvan tesisine giriş ve çıkış sırasında kişisel koruma ekipmanı takmak ve çıkarmak da dahil olmak üzere giriş için gerekli tüm prosedürleri uygulayın.
    DİkKAT: Tüm işlemler, Biyogüvenlik seviyesi 2 laboratuarı (BSL-2) tesisinde sertifikalı bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmalıdır.
  5. Anestezi uygulayın, 200-500 μL, intraperitoneally hayvanın büyüklüğü ne bağlı olarak. Tek başına çalışıyorsanız, organ hasat önce hayvanları öldürmemek için bir seferde bir hayvan anestezi uygulayın.
    1. Pedal refleksini değerlendirmek için ayak parmaklarını forceps ile sıkıştırarak anestezi dozuna onaylayın. Tamamen yanıt vermemedikçe devam etmeyin. Fareyi balmumu tahtasına sabitlemek için iğneler kullanın. Bu noktada, organ hasat işleminde saç kontaminasyonunu önlemek için fareyi %70 etanol ile tarayın
  6. Ölümcül kalp delinmesi ile kanama.
    1. Makas ve forceps kullanarak, kalp ortaya çıkarmak için göğüs boşluğu ile hayvan açın. Kalp delinme yoluyla kan toplamak (~ 800 μL), Bu klinik kimya, hematoloji, akım sitometri antijen spesifik yanıtları tespit etmek ve viral kopya numarası analizi için gerçek zamanlı kantitatif PCR (qRT-PCR) dahil olmak üzere birden fazla tahliller için kullanılabilir.
    2. qRT-PCR ile viral RNA analizi için, serumdan çıkarılan ise tam kandan veya mikrosantrifüj tüpünden elde edilen bir EDTA tüpünde kan toplayın. (Serum için, santrifüj maksimum hızda tüp spin, oda sıcaklığı, için 20 dk ve ayrı bir tüp için serum kaldırın). Bitirdikten sonra serum örneğine taşıyıcı olarak lineer poliakrilamid ekleyin. RNA daha sonra analiz edilebilir veya daha sonraki bir tarihte daha fazla işlem için -80 °C'de saklanabilir.
  7. 20 mL şırıngayı oda sıcaklığında (veya 37 °C) PBS ile doldurun ve kelebek iğnesini sol ventriküle yerleştirerek fareleri perfüzyonlayın. Kan ve PBS'nin çıkmasına izin vermek için sağ atriyumu delin. Yavaş yavaş hayvan tamamen perfüzyon olduğunu doğrulamak için karaciğer rengini kontrol ederken PBS uygulayın. Karaciğer koyu kırmızıdan pembe somon rengine dönüşmelidir.
    1. Organları histolojiye hazırlarken kelebek iğnesini yerinde bırakın ve 20 mL buz soğuklusu %4 paraformaldehit geçirin. Eğer öyleyse, şırınganın her iki şırıngaya bağlı 3 yönlü bir stopcock'a bağlanması, valfin PBS ve PFA arasında tek bir alternatif olarak avejve KAPALI olarak açılması uygundur.
  8. Organları etiketli, tartılanmış tüplerhalinde toplayın. Periferik organlar için, hasat için belirlenmiş bir sıraizleyin: karaciğer, dalak, böbrek ve akciğerler.
    1. Karaciğerden sadece bir lob alın; hangisi olduğu önemli değildir, ama tüm deneyler için her zaman aynı boyutta parça ile aynı lob almaya çalışın. Benzer şekilde, böbrekler ve akciğerler için, aynı böbrek ve akciğer almak. Akış sitometrisi de tamamlanacaksa, herhangi bir organ ikiye ayrılabilir. Roswell Park Memorial Institute orta (RPMI) hasat tamamlanana kadar oda sıcaklığında sitometri için kullanılacak yarısı saklayın.
    2. Hasattan hemen sonra, her organı etiketli bir tüpe koyun ve kuru buz banyosuna koyun. Virüs titreği oda sıcaklığında zaman içinde azalır, bu nedenle organların hasat için gereken zaman miktarı son derece önemlidir. Fareler arasında tutarlılık olmalı, bu yüzden güvenlikten sonra, bir sonraki öncelik hızdır.
      NOT: Viral titreler için organ toplama ise, viral titreleri korumak için, bu noktada ikinci bir bireysel hasat beyin için çok yararlıdır.
  9. Omurga ve kafatası erişim elde etmek için fare vücut boşluğundan kalan organları çıkarın.
    1. Tahtadan fareyi çıkarın ve pelt çıkarın, kol lar ve bacaklar kaldırılması takip.
      Bir decapitation, künt veya cerrahi makas ile farenin başını çıkarın foramen magnum ile tırtıklı LaGrange makas ile kafatası keserek beyin hasat. Sonra, forceps ile kafatası soyma ve bir spatula ile beyin dışarı kepçe.
    2. Güçlü, körelmiş makas kullanarak, kaburga ve omurga çevreleyen diğer kemikleri çıkarın. Sonra, pelvik kemik boyunca kesilmiş, lomber düzeyde vertebraformen açığa. Omuriliğin küçük ucu bu noktada görülmelidir.
    3. PBS ile dolu 10 mL şırınga ve 18 G iğne kullanarak bir Petri kabının üzerinde kordonu lomberden servikal omurgaya "temizleyerek" omuriliği dışarı atabilirsiniz.
    4. Dikkatle, vertebraforamen içine iğne nin yontma ucu yerleştirin, omur gövdesi izinsiz girmek için iğne önlemek için aşırı basınç kaçınarak. Vertebral vücut ve iğne üzerinde baskı uygulamak için güçlü tutun ve kordon uçıkarmak için şırınga piston basın. Hemen etiketli tüp ve kuru buz banyosu yer omurilik transfer.
  10. Hasat tamamlanana kadar tüm hayvanlarla işlemi tekrarlayın. Hayvanlar arasında% 70 etanol hasat araçları yerleştirin. Tutarlılık ve hıza odaklanın. Her organ hasat arasındaki süre böylece önyargı viral titre sonuçları değil tutarlı kalmalıdır.
  11. Bittiğinde, biyogüvenlik kabinini ve tüm malzemeleri hayvan tesisinden çıkarmadan önce dezenfekte edin.
  12. Buz banyosundan her tüp çıkarın ve organların ağırlığını belirlemek için tüpler tartmak. Organların ağırlığını belirlemek için, boş tüpün ağırlığını tüp içeren organın ağırlığından çıkarın.
    NOT: Bu noktada organlar -80 °C'de dondurularak daha sonraki bir tarihte işlenebilir veya organlar tek tek donmadan hemen önce homojenleştirilebilir. Çözülme örnekleri birden çok kez viral titreşme azalır. Bu nedenle, tek bir projedeki tüm denemeler için aynı yordamı yapmak önemlidir.

2. Organ Homojenizasyonu

  1. Her organın homojenleştirilmesi için 3 etiketli, 1,5 mL snap-kapaklı tüp hazırlayın.
  2. Numuneler hasattan hemen sonra homojenize edilmiyorsa, tüpleri -80 °C'den çıkarın. Homojenize etmek için örneklerin çözülmesi gerekmez.
  3. Viral titre kaybını en aza indirmek için onları soğuk tutmak için buz üzerinde örnekleri koyun. Daha sonra, tüp içeren her organa %5 FBS içeren 1 mL soğuk DMEM ekleyin.
  4. Hemen üreticinin talimatlarına göre boncuk çırpıcı tüpler yendi. Boncuk-homogenizer aletinde tüm organları çelik boncuklarla homojenize edin. Her organın tamamen homojenleştirildiğini kontrol edin.
  5. 8 °C'ye kadar soğutulmuş bir mikrofuge 5 dakika için 12.000 x g mikrofuge organ enkaz aşağı spin. Sonra tüpleri buz kovasına geri ver. Biyogüvenlik kabininde, gerekli tahliller için tüpler içine aliquot örnekleri. Sonra tüpleri buz kovasına geri ver.
  6. Odak oluşturma çıktısı için, etiketli bir tüp içine 500 μL aliquot. Sonra bir buz kovası üzerinde raftüpleryerleştirin. Aliquot 50 μL viral genom kopya numarasını ölçmek için florojenik kantitatif RT-PCR (qRT-PCR) için RNA için bir tüp içine.
  7. Ticari bir RNA izolasyon kiti kullanarak enfekte hayvanların organlarından toplam RNA izole. Her flavivirüs genomunda benzersiz dizileri tanıyan ZIKV'e özgü astar sonda setlerini kullanarak flavivirus viral RNA'yı belirleyin. ZIKV hedef dizilerini içeren T7 polimeraz kullanılarak in vitro olarak oluşturulan tanımlanmış pozitif tek telli RNA içeren bir kopya kontrol plazmidi kullanarak viral kopya numarasını belirleyin.
  8. Yaklaşık 300 μL olan kalan numuneyi üçüncü tüpe aktarın ve gerekirse -80 °C'de saklayın.
    NOT: Numuneler daha önce dondurulmamışsa -80 °C'de donun. Numuneler daha önce dondurulmuşsa, durdurmadan öncetest ve/veya RNA yalıtımı oluşturan odaklamaya devam edin.

3. Zika Virüs Odak Oluşturma Testi26

NOT: Bu bir virüs kontrolü ve pozitif kontrol dahil etmek önemlidir. Pozitif kontrol bilinen bir konsantrasyon ile bir virüs stok seyreltme serisidir. Tüm kontrollerin aynı plaka üzerinde olması gerekmez, ancak titreşme 5 plakadan daha büyük hale geldikçe, daha fazla kontrol eklenmeli ve plakalar arasında yayılmalıdır. Boru uçları veya güçlü yıkama ile monolayer çizik değil dikkat edin. Birden fazla organ aynı gün veya farklı günlerde titreşebilir. Ama farklı test koşulları viral titreyi etkileyebilir, çünkü bireysel bir organ birden fazla gün içinde titretli olmamalıdır. Tek bir organın tek bir günde çalıştırılması şiddetle tavsiye edilir.

  1. Tgörünüşe göre, odak noktası için gerekli hücreleri ve reaktifleri hazırlayın.
    1. 5 mL HEPES ve 25 mL FBS ile 500 mL DMEM içeren büyüme ortamı hazırlayın. Vero-Dünya Sağlık Örgütü (WHO) hücreleri 37 °C, 5% CO2 olarak büyüme medya büyüme hücreleri için daha önce tsur. Vero hücreleri yüksek bir geçit olmamalı veya hiç üzerinde büyüdü 100% birleştirme önce tetkik başlamadan önce.
    2. 10 g metilselüloz ve büyük bir karıştırma çubuğu ve 500 mL H2O ile ayrı bir 1 L cam ortam şişesi ile 1 L cam ortam şişesi otomatikkleyerek %2'lik bir metilselüloz çözeltisinin 500 mL'sini hazırlayın. Otoklavlı su, şişe dokunmak için sıcak olana kadar mikrodalga yeniden ısıtılmış ise, ama kaynama değil.
    3. Yavaşça doku kültürü başlık iken metilselüloz şişesi içine sıcak / sıcak su dökün. Kısmen kap şişe ve metilselüloz çözeltisi (1-4 saat) olana kadar ocak üzerinde karıştırın. Aliquot steril 50 mL konik tüp içine% 2 metilselüloz çözeltisi. %2 Metilselüloz ihtiyaç duyulana kadar 4 °C'de saklanabilir.
    4. Plakaları sabitlemek için PBS'de %5'lik bir Paraformaldehit çözeltisi hazırlayın ve ihtiyaç duyulana kadar 4 °C'de saklayın. PBS'ye %0,05 Triton X-100 ekleyerek ve RT'de depolanan 1x odak yıkama tamponu hazırlayın. Bunlar bir-iki hafta önceden hazırlanabilir.
  2. Her organ triplicate plakalı olduğu gibi tsay için gerekli düz alt 96 iyi plakaların sayısını hesaplayın. Pozitif ve negatif denetimler için yeterli ek kuyular ekleyin.
    1. Tasarlanmış tsay tamamlamak için büyüme medya yeterli Vero hücreleri büyümek. Vero hücrelerini trypnizie ve büyüme ortamlarında mL başına 1,5 x 105 hücre de yeniden sayaonları saymak. 3.0 x 104 Vero-WHO hücrelerinde/iyi büyüme ortamlarında 96 iyi düz alt plakadaki Plaka Vero hücreleri kuyu başına 200 μL ekleyerek.
    2. Bir gecede %5 CO2 ile 37°C'de kuluçka plakaları, hücrelerin kuyu içinde eşit olarak dağıtılması için plakaların kuvözde eşit olduğundan emin olun.
      NOT: Her laboratuvar Vero hücrelerini biraz farklı yetiştirir; hedef, Zika virüsünün teşrinin olduğu gün her kuyuda %90-95'lik bir tek katmanlı dır.
  3. Seyreltik Zika virüsü test günü örnekleri. Organ örnekleri daha önce homojenleştirilmiş olsaydı, -80 °C'lik dondurucudan numuneleri çıkarın ve numuneleri test için buza koymadan önce erimelerine izin verin.
    1. Buz üzerinde, B'den H'ye kadar olan a sırasını boş bırakarak 180 μL soğuk büyüme ortamı ekleyerek yuvarlak bir alt 96 kuyu plakası hazırlayın. Yuvarlak alt plakanın A satırına her homojenize organ örneğinden 150 μL ekleyin.
    2. Çok kanallı pipet kullanarak her numunenin seri 10 kat seyreltmelerini hazırlayın. 180 μL'lik büyüme ortamına 20 μL numune ekleyerek, numuneleri yuvarlak bir alt 96 kuyu plakasında seyreltin ve her seyreltme arasındaki pipet uçlarını değiştirin.
  4. Vero hücrelerini kaplayan düz alt 96 kuyu plakasından ortamı çıkararak odak şekillendirme plakasını hazırlayın. Monolayer'ın kurumasını önlemek için virüs örneklerini eklemeden hemen önce bunu yapın.
    1. Vero plakasındaki her kuyuya 100 μL virüs seyreltme ekleyin. En düşükten en yüksek konsantrasyona giderek aynı ipuçları kümesini kullanarak örnek ekleyin. Kaya plakaları yan yana 2-4 kez girdap yapmamaya dikkat etmek.
    2. 37 °C'de kuluçka, 1-2 saat için %5 CO2. Kuluçka sırasında RT% 2 metilselüloz ısınmak.
    3. Büyüme ortamlarında %2 metilselüloz çözeltisini seyreltin. Seyreltme büyüme ortamına yaklaşık 2:1% 2 metilselüloz oranında olmalıdır. Kullanma zamanı olana kadar oda sıcaklığında tutun. Metilselülozun 1-2 damla/kuyuekleyin (pipet'i 125°L'ye ayarlayın: 96 kuyu plakasının her bir kuyusuna büyüme ortamı.
    4. Kuluçka 32-40 saat 37 °C, %5 CO2. Herkesin Vero hücreleri biraz farklı büyüdükçe ve hücre birleşimi ve Zika virüsü nün türü gibi faktörler kuluçka süresini değiştirebilir.
  5. Hazırlanan %5 paraformaldehit çözeltisini kullanarak Vero hücrelerini düzeltin.
    1. Biyogüvenlik kabinindeki metilselüloz tabakasının üst kısmındaki her kuyuya %5 paraformaldehit ekleyin. RT'de 60 dakika kuluçka. Sabitleme 4 °C'de bir gecede gidebilir, ancak buharlaşmayı azaltmak için plakayı parafilm ile kaplar.
    2. Bindirme ve medya yıkın hücreleri biyogüvenlik kabini içinde bir bertaraf konteyner içine. PBS, 150 μL/iyi ile hafifçe yıkayın. PBS'yi plakalardan çıkarın ve plakayı BSL-2'den çıkarın.
    3. PBS yıkamayı 150 μL/kuyu ekleyerek 2x tekrarlayın. Sonra PBS kaldırın. 150 μL/well FFA yıkama tamponu ekleyin ve sabit hücreleri permeabilize etmek için RT'de 5-10 dakika oturun.
  6. Primer Zika antikorunu kullanarak enfeksiyonu sapta. FFA boyama tamponunda 1 mg/mL konsantrasyonda primer antikor 4G2 (D1-4G2-4-15) hazırlayın. Tüm teşekkat için yeterli antikor hazırlayın.
    NOT: Lifler foci görüntüleme olumsuz etkileyeceğinden laboratuvar bezi veya diğer yüksek tiftik emici malzeme uzak durun.
    1. FFA yıkama tamponu tabaklardan çıkarın. FFA boyama tamponuna primer antikordan 50 μL/kuyu ekleyin. Plakaları parafilm ile kapatın ve gece boyunca 4 °C'de sallanan bir platformda kuluçkaya yatırın. Tsur, RT'de 2 saat kuluçka ile yapılabilir.
  7. İkincil HRP konjuge antikor ilavesi ile enfeksiyonu görselleştirin. FFA boyama tampon1:5.000 konsantrasyonda ikincil Keçi anti-fare HRP etiketli antikor hazırlayın. Tüm teşekkat için yeterli antikor hazırlayın.
    1. Hücreleri FFA yıkama tamponu ile 3kat yıkayın, her seferinde lavaboya girerek yıkama tamponunu temizler. Hücreleri FFA boyama tamponundaki ikincil antikorla 50 μL/iyi de lekelendirin. RT'de 1-2 saat kuluçka.
    2. Hücreleri FFA yıkama tamponu ile 3kat yıkayın, her seferinde lavaboya girerek yıkama tamponunu temizler. Trueblue Substrat'ın 50 μL/iyi kısmını ekleyin.
    3. Noktalar tam olarak tanımlanmış ve en az arka plan olana kadar 2-15 dk bekleyerek plakaları dikkatlice izleyin. Lekeler görünür olduktan sonra, akan suyun kuvvetinden monolayer kalkan bir el kullanarak, su ile yavaşça yıkayın. Kağıt havlular (NOT BEZLER) ve görüntü en kısa sürede kuru dokunun.
    4. Noktalar el ile veya otomatik bir nokta sayacı kullanılarak sayılabilir. El ile sayılırsa, görselleştirmeye yardımcı olmak için bir kesme kapsamı kullanılabilir.
    5. Her örnek için, kolayca ayırt edilebilir foci (örneğin, kuyu başına 200-200) ile bir seyreltme seçin ve yinelenen kuyuların ortalamasını kullanarak mL başına odak oluşturan birimler (FFU/ml) titresini hesaplayın: FFU/mL = (ortalama foci/kuyu) × (seyreltme faktörü) ÷ (mL inoculum).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıda açıklanan protokolü kullanarak ZIKV titrelerini değerlendirmek için Ifnar1-/- farelerayak altına deri altı (SC) enjeksiyonu ile ZIKV (PRVABC59) ile enfekte olmuşlardır. Burada, 8-12 haftalık Ifnar1-/- fareler SC zikv 1 x 105 FFU uygulanması öldürücü değildir ama virüs hem çevre ve CNS çoğalabilir. Bu doz ve rota konak patojen immün yanıtları ve patojenite çalışma için kullanılır. 8-12 haftalık Ifnar1 -/- far...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ZIKV enfeksiyonu nörolojik bir hastalığa neden olabilir bu nedenle mevcut hayvan modellerinin patogenezi, immün yanıtları ve aşıların ve antivirallerin koruyucu etkinliğini incelemesi cns içinde viral kontrole odaklanması gerekir. CNS hastalığına odaklanmanın zorluklarından biri de genellikle periferik enfeksiyonu nitreşme pahasına gelmesidir. Burada önerilen organ izolasyon yöntemleri, CNS aracılı ZIKV ilişkili hastalığı değerlendirmek ve antivirallerin preklinik test için bir model oluşturmak için hem çevre hem de CNS'...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Pinto, Saint Louis Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden bir tohum bağışı ve Saint Louis Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden başlangıç fonları ile finanse edilmektedir. Dr. Brien, NIH NIAID'in K22AI104794 erken araştırmacı ödülü ve Saint Louis Üniversitesi Okulu'ndan bir tohum hibesi ile finanse edilmektedir. Finanse edilen tüm bireyler için fon layıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, makalenin yayımlama kararı veya hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-bromo-3-kloropropan (BCP)MRC geniBP151
10 cc şırıngaThermo Fisher ScientificBD 309642
18 G iğneThermo Fisher Scientific22-557-145
1 cc TB şırıngaThermo Fisher Scientific14-823-16H
20 cc şırıngaThermo Fisher Scientific05-561-66
24 tüp boncuk değirmeniThermo Fisher Scientific15 340 163
3,2 mm paslanmaz çelik boncuklarThermo Fisher ScientificNC9084634
37 ° C Doku Kültürü inkübatörüNuair5800
4G2 evde antikor
96 kuyulu düz tabanlı plakalarMidsciTP92696
96 kuyulu yuvarlak alt plakalarMidsciTP92697
Basix 1.5 mL eppendorf tüpleriThermo Fisher Scientific02-682-002
Konsantre Antiseptik ÇamaşırSuyu Zımbaları30966CT
CTL S6 AnalizörüCTLCTL S6 Üniversal Analiz
Cihazı Kavisli kesme makasıGüzel Bilim Araçları14061-11
Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta - yüksek glikoz 4.500 mg / L glikoz ileMilliporeSigmaD5671
Etanol (moleküler biyoloji sınıfı)MilliporeSigmae7023
Fetal Sığır SerumuMilliporeSigmaF0926-500ML
ForsepsGüzel Bilim Araçları11036-20
Buzlu asetik asitMilliporeSigma537020
Keçi anti-fare HRP etiketli antikorMilliporeSigma8924
HEPES 1 MMilliporeSigmaH3537-100ML
İzopropanol (moleküler biyoloji sınıfı)MilliporeSigmaI9516
Ketamin/Ksilazin kokteyliKarşılaştırmalı Tıp
L-glutaminMilliporeSigmag7513
Magmax RNA saflaştırma kitiThermo Fisher ScientificAM1830
MetilselülozMilliporeSigmaM0512
MikrosantrifüjEpendorf5424R
MiniCollect 0.5 mL EDTA tüpleriBio-one450480
O-ring tüpleriThermo Fisher Scientific21-403-195
Bir adım q RT-PCR karışımıThermo Fisher Scientific4392938
ParaformaldehitThermo Fisher ScientificEMS- 15713-S
Fosfat Tamponlu TuzluMilliporeSigmad8537-500ml
Proline çok kanallı pipetlerSartorius72230/72240
Proline tek kanallı pipetlerSartorius728230
RNAse serbest suThermo Fisher Scientific10-977-023
RNAzol BDMRC geniRB192
Sallanan PlatformThermo Fisher Scientific11-676-333
RPMI 1640FisherMT10040CV
SaponinMilliporeSigmas7900
Kaşık / spatulaGüzel Bilim Araçları10090-17
Düz kesme makasıGüzel Bilim Araçları14060-11
Triton X-100MilliporeSigmat8787
Gerçek Mavi YüzeyVWR95059-168
TripsinMilliporeSigmaT3924-100ML

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lazear, H. M., Diamond, M. S. Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere. Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).
  2. Simpson, D. I. Zika Virus Infection in Man. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).
  3. Fagbami, A. Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria. Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).
  4. McCrae, A. W., Kirya, B. G. Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).
  5. Rodhain, F., et al. Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).
  6. Wikan, N., Smith, D. R. Zika virus: history of a newly emerging arbovirus. Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).
  7. Zika virus outbreaks in the Americas. The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).
  8. Brien, J. D. Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , Oregon Health & Science University. (2007).
  9. Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection. Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).
  10. Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).
  11. Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
  12. Shrestha, B., et al. The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1. PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823(2010).
  13. Brien, J. D., et al. Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230(2011).
  14. Pinto, A. K., et al. A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407(2011).
  15. Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).
  16. Brien, J. D., et al. Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus. Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).
  17. Messaoudi, I., et al. Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343(2013).
  18. Pinto, A. K., et al. A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice. Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).
  19. Sukupolvi-Petty, S., et al. Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection. Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).
  20. Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086(2014).
  21. Pinto, A. K., et al. Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection. MBio. 6 (5), (2015).
  22. Pinto, A. K., et al. Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families. Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).
  23. Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathog. 14 (9), e1007237(2018).
  24. Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathog. 10 (4), e1004086(2014).
  25. Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).
  26. Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237(2018).
  27. Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection. Virology. 412 (1), 101-109 (2011).
  28. Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice. Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Zika Virus IsolationViral Titer QuantificationFocus Forming AssayQuantitative PCROrgan HarvestingSpinal Cord ExtractionViral Load AnalysisMouse Infection ModelFlavivirus DetectionViral Pathogenesis

Related Articles