Method Article

Meme hücrelerinin Mikrodesenler ve nicel görüntüleme kullanarak acil uzamsal organizasyonu haritalama

DOI:

10.3791/59634

⸱

April 30th, 2019

 ,  , 
1MRC Centre for Regenerative Medicine, Institute for Stem Cell Research, School of Biological Sciences, University of Edinburgh

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan yöntem, memeliyle ilgili kültürlerin içinde uzamsal organizasyon ortaya çıkarmak için nicel görüntüleme ile birlikte micropatterning kullanır. Teknik standart bir hücre biyoloji laboratuarında kurmak kolaydır ve in vitro desen çalışması için bir uysal sistemi sunar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyolojide temel bir amaç, gelişim sırasında kalıplarının nasıl ortaya çıktığını anlamıdır. Çeşitli gruplar, kök hücreler dağınık bir şekilde mikrodesenler üzerine kapalı olduğunda desenlerin in vitro olarak elde edilebildiği, böylece tanımlamak için benzersiz fırsatlar sunan deneysel modeller kurmak göstermiştir, in vitro, biyolojik temel ilkeleri Organizasyon.

Burada metodoloji kendi uygulanması açıklanmaktadır. Biz standart bir hücre biyoloji laboratuarında yöntemi kurmak daha kolay hale getirmek için özel ekipman ihtiyacını azaltmak için bir fotoğraf desen tekniği adapte. Ayrıca, standart şekiller ve boyutlarda koloniler içindeki hücrelerin alt nüfuslarının Tercihli pozisyonlanmasını tam olarak ölçmek için ücretsiz, açık kaynaklı ve kolay kurulabilir bir görüntü analizi çerçevesi geliştirdik. Bu yöntem, hücrelerin görünüşte düzensiz nüfuslarında bile desen olayların varlığını ortaya çıkarmak mümkün kılar. Teknik, nicel öngörüler sağlar ve belirli bir desen sürecinde ortamın (örn. fiziksel ipuçları veya endojen sinyalizasyon) etkilerini ayrıştıracak şekilde kullanılabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Memelinin sistemlerinde, desen hücrelerin kolektif davranışlarının acil bir özelliğidir ve böylece, hücreler1,2,3,4, uygun ipuçları sağlanırsa, desenler in vitro oluşturabilir 5 , 6. hücrelerin içsel yeteneğini ortaya çıkarmak için bir yolu kendi kendine-vitro düzenlemek için hücreleri oluşturmak için zorlamak için gruplar/koloniler tanımlanan şekiller ve boyutlar7,8,9,10 . Bunun sağlayan bir tekniği micropatterning11. Micropatterning, hücre içi matrisin (ECM) moleküllerinin bir yüzeye yatırılan konumunu tam olarak tanımlamanızı mümkün kılar. Bu, sırayla hücrelerin nasıl uyabileceği ve bu nedenle hücrelerin nasıl dağınık şekilde düzenlendiği kontrol eder.

Micropatterning çok sayıda uygulama ile bir tekniktir, örneğin, micropatterning farklılaşma öncesinde ilk koşulların standardizasyonu sağlar12. Önemlisi, micropatterning kolayca boyutu, şekil ve hücre kolonilerinin aralığını kontrol etmek mümkün kılar ve bu özellik, morphogen veya fiziksel ipuçları için hücrelerin toplu yanıt sorgulamayı amaçlayan deneyler hazırlamak için kullanılabilir7 , 8 , 10 ' dan fazla , 13 ' ü , 14 , 15 , 16 , 17 yaşında.

Çeşitli micropatterning yöntemleri geliştirilmiştir11. Photopatterning teknikleri belki18kurmak için en kolay yöntemlerdir. Tek hücrelerin şeklini kontrol etmek için kullanılabilir gibi bu yaklaşımlar da hassasiyet avantajı var18,19,20. Ancak, onlar da dahil olmak üzere pahalı özel ekipman gerektirir bir spin coater, bir plazma odası ve bir UVO (UV-ozon) temizleyici hangi genellikle kolay standart biyoloji laboratuvarlarında mevcut değildir. Tekniğin kabulü kolaylaştırmak için, biz sadece UVO lamba gerektirmek için protokol adapte. Biz makas veya istenilen biçime bir delik Punch ile kesilebilir ticari olarak kullanılabilir plastik slaytlar başlar.

Mikrokalıplarının önemli bir yardımcı programı, kolonileri bireysel kolonileri birden fazla çoğaltır arasında karşılaştırmak için standartlaştırmak etme yeteneğidir. Bu, bu kolonilerin içinde hangi ölçüde desen oluşumunun yeniden üretilebilirliğini sormayı ve Pattern sürecinin sağlamlığını etkileyen faktörleri keşfetmeyi mümkün kılar. Daha da önemlisi, birden fazla standartlaştırılmış koloniler arasında "Ortalama" kalıplarının ölçülmesi, aksi takdirde belirgin olmayacaktır desen süreçleri ortaya çıkarabilir. Standardize koloniler üzerinde desen ölçmek mümkün olmanın avantajı doğru tek hücre düzeyinde, ideal protein ifadesi ölçmek mümkün olmaya bağlıdır. Ancak, mikrodesenler üzerinde hücreler genellikle sıkıca paketlenmiş, yüksek doğruluk ile segment zor hale. Hücreler genellikle üç yerine iki boyut kendilerini organize ve algılamak ve segmentasyon sırasında üç boyutlu (3B) bilgileri korumak için zor olabilir. Hücreler başarıyla bölümlere ayrıldıktan sonra, sonuç veri kümelerinden desen bilgilerini ayıklamak için Hesaplamalı Yöntemler gereklidir.

Bu sorunların üstesinden gelmelerine yardımcı olmak için segmentasyon ve görüntü analiz araçları geliştirdik. Bu analiz yöntemi yalnızca ücretsiz ve açık kaynaklı yazılım kullanır ve komut satırı veya programlama bilgisini uygulamak için gerektirmez. Burada yöntemi göstermek için, biz fare embriyonik kök kullanın (mES) kendiliğinden erken farklılaşma brachyury bir marker ifade hücreleri (tbra)21,22. Hiçbir belirgin uzamsal düzenleme görsel olarak algılanabilir iken, yöntem kolonilerde T + hücrelerin Tercihli konumlandırma bir harita oluşturulması sağlar. Ayrıca bu tbra deseni, Idon, kemik morfogenetik protein (BMP) yolu23doğrudan bir okuma ifade hücrelerin tercihli bir lokalizasyonu yokluğunda kontrastlar gösterir. Ayrıca, yöntemin geçerli sınırlamalarını ve bu tekniğin diğer deneysel sistemlere nasıl adapte edilebilir olduğunu da tartışıyoruz.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: yöntem genel bakış Şekil 1' de sağlanır.

1. maske tasarımı

  1. Photomask, Azioune ve al.18' de açıklanan yönergelere göre tasarlayın. Bu çalışmada kullanılan yazılım ve maske üreticisine başvuru için malzeme tablosuna bakın.
    Not: birden çok geometriler, Boyutlar veya şekiller arasındaki boşluk bir maske üzerinde oluşturulabilir. UV lambası, 49 adede kadar farklı tasarıma (2 cm x 2 cm yongaları) sahip olabilecek 15 cm 'lik bir photomask sığabilir.

2. mikrodesen üretim prosedürü

  1. Gerekli materyalleri hazırlayın.
    1. Fosfat tamponlu tuzlu (PBS) içinde% 0,1 Poloksamer 407 (10 ml için 10 mg) bir çözüm hazırlayın ve oda sıcaklığında bir shaker bırakın. Poloksamer 407 çözülür yaklaşık 20 dakika sürer.
    2. Bir 10 cm kare Petri tabak altında laboratuar filmi ( malzeme tablosunabakın) Lay. Bu matris biriktirme için oda olarak kullanılacaktır.
    3. Photomask yüzeyini temizleyin, ilk 100% aseton ile, sonra 100% izopropanol ve sonunda DDH2O ile. Mümkünse, hava fotomask kuru veya başka temiz kağıt havlu ile maske kuru.
    4. Fotomask ile aynı boyutta bir kare, sert ve opak bir plastik parçası hazırlayın (daha sonra ' Holder ' olarak adlandırılır).
      Not: Bu aydınlatma adım sırasında fotomask ile temas plastik coverflar korumak için kullanılır.
    5. UVO lambası açın ve 10 dakika ısınma aydınlatması çalıştırın.
  2. Photopatterned cips oluşturun.
    Not: istenen boyutta fiş oluşturmak için yordamı adapte etmek mümkündür. Basitlik için, burada 12 mm yuvarlak mikrodesenli çip oluşturmak için prosedür açıklanmaktadır.
    1. 12 mm 'lik delik yumruk kullanarak, 12 mm yuvarlak kapak oluşturmak ve onları temiz yeni bir petri tabağı içine yerleştirmek için hidrofobik plastik slaytlar kesti.
      DIKKAT: Bu yüzey işleme zarar verebilir gibi plastik yüzeyi ile cilt teması önlemek için her zaman eldiven kullanın.
    2. Dikkatle cımbız ile Cover, koruyucu film çıkarın.
      Not: Bu tohumlama prosedürü sırasında çip üzerindeki hücrelerin yerleşimi etkileyebilir gibi plastik yüzey zarar kaçının (Bölüm 3).
    3. Photomask 'ı temiz ve istikrarlı bir yüzeye (örn. photomask kutusu), krom tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve istenilen çip tasarımının konumuna 2 μL damla ddH2O ekleyin.
    4. DDH2O damlası üzerine bir lamel magazini Lay ve hafifçe basın.
      Not: photomask yüzleri plastik yan önceki adımda kaldırıldı film tarafından korunan yan olduğundan emin olun.
    5. Tutucu plastik slaytların üstüne yerleştirin ve fotomask ile temas plastik parçaları korumak için dikkatle kelepçeler ile bu sandviç düzeltin.
      Not: plastik slaytların fotomask yüzeyi ile temas halinde mükemmel bir şekilde korunduğundan emin olmak için, kelepçeleri mümkün olduğunca yakın bir şekilde plastik kaydırakların konumuna yerleştirin.
    6. Montajı, ışık kaynağından yaklaşık 2 cm olan UVO lambaya yerleştirin ve 10 dakika aydınlatın.
      Not: ışığın gücü, yongası kaynaktan 2 cm mesafeye yerleştirildiğinde 254 nm dalga boyunda 6 mW/cm2 olarak tahmin edilmektedir.
    7. Alt fotomask ile sandviç tutun ve sandviç Demontaj sırasında hareket eden slaytlar önlemek için bir elle basınç koruyarak dikkatli bir şekilde kelepçeleri kaldırmak. Tutucuyu çıkarın, tüm plastik parçaların hala maske üzerinde olduğundan ve tutucuya takıldığından emin olma.
    8. Fiş üzerine ddH2O ekleyin ve hafifçe fotomask gelen yongaları ayırın.
      Not: plastik çip fotomask için sıkışmış ise, çip birden biraz üzerinde Chip ayırmak durumunda çip hafifçe üzerinde tutarken çip itmek için bir plastik pipet ucu kullanarak çip ayırın.
    9. Son olarak, photopatterned yongaları matris biriktirme odası içine yerleştirin.
      Not: çipin aydınlatmalı tarafındaki yukarı dönük olduğundan emin olun.
  3. Matrisini yatırın.
    Not: Bu bölümdeki tüm prosedür bir doku kültürü kaputu içinde yapılmalıdır.
    1. Poloksamer 407 çözümünü 0,22 μm politersülfon (pes) filtresine göre filtreleyin.
    2. ECM kaplama çözümünü 500 μg/ml steril filtreli Poloksamer 407 ve 1 mg/ml jelatin karıştırarak hazırlayın.
      Not: diğer olası ECM molekülleri ile ilgili ek bilgi için Tablo 1 ' i de görün.
    3. Her ışıklı çipin üzerine kaplama çözeltisi 200 μL ekleyin. Laboratuar filmi, çipin dışına düşmesini önler.
    4. Evaporasyonu sınırlamak ve bir gecede 4 °C ' de yongası ile yerleştirmek için ddH2O ile dolu 3 cm Petri tabağı ekleyin.

3. tohumlama prosedürü

Not: aşağıda açıklanan adımlar, standart mESC orta kullanarak CGR8 fare embriyonik kök hücreleri (mESC)24 için optimize edilmiştir (Ayrıca bkz: malzeme tablosu). Ancak, herhangi bir hücre türü için prosedürü uyarlamak prensip olarak mümkündür. Ayrıca, fare embriyonik kök hücrelerinin geleneksel hücre kültürü burada açıklanan değil, kapsamlı belgeler başka bir yerde25bulunabilir olduğunu unutmayın.

  1. Kaplama çözeltisi aspirate ve steril PBS ile en az 5 dakika boyunca iki kez yongaları inküye.
  2. Bu arada, sıcak ortamda 5,5 x 105 hücreler/ml hücre süspansiyon hazırlayın.
  3. Pipet 200 her çipte hücre süspansiyon μL (~ 100.000 hücreler/cm2).
  4. Tohumlama odasını kapatın ve hücrelerden 1 saat boyunca kuluçkalıcıya uymasını bırakın.
  5. 1 saat sonra, 500 μL/Well sıcak orta ile bir multiwell plaka (4-kuyu veya 24-kuyu plaka) kuyuları doldurun ve steril cımbız ile plaka içine yongaları aktarmak.
  6. Yapışkan olmayan hücreleri ayırmak için plakayı şiddetle sallayın. Orta aspirate ve hemen taze sıcak orta ile değiştirin. Desen görünür olup olmadığını görmek için mikroskop altında kontrol edin (Şekil 2a).
    Not: yapıştırma süresi, mESC veya diğer matris proteinleri dışında hücre çizgileri kullanıldığında optimize edilmesi gerekebilir (Ayrıca bkz. Tablo 2).
  7. Desenler Şekil 2a'da gösterildiği gibi açıkça görünür hale gelene kadar bu adımı yineleyin.
    Not: Bu adım önemlidir ve yordamın başarısını belirler. Çok yoğun bir yıkama prosedürü hücreleri ayırmak olabilir, aksine yetersiz yıkama kalıpları arasında bağlı kalan hücreler neden olabilir (Şekil 2C, d).

4. sabitleme

Not: kültür 48 h sonra hücreler titizlikle desenler şeklini takip yoğun koloniler oluşturmalıdır ( Şekil 2B'de gösterildiği gibi).

  1. Plakadan fiş bırakarak, kaldırma ~ 90% orta, sadece yeterli orta kurutma yongaları önlemek için bırakarak.
    Not: çip hiçbir zaman boya eserler önlemek ve yüzey hücre dekolmanı önlemek için kurutmak önemlidir. Yapışkan desenler arasında çip yüzeyinin hidrophobicity nedeniyle, çip de-Wet bir eğilimi olabilir. Bu aşamada, fikfatif büyük kubbeli kolonilerin çipten ayırmasına neden olabilir. Yıkanabilir çok nazik olmalıdır, ideal pipetleme sıvı tarafından kuyu tarafında ve doğrudan çip üzerine yapılır.
  2. İyi başına en az 500 μL civarında formaldehite (PFA) bazlı sabitleme çözeltisi ekleyin ve 10 dakika boyunca inküye yapın.
    Not: koloniler özellikle kalın görünüyorsa (5 ' ten fazla hücre katmanı), sabitleme süresini 20 dakikaya ayarlamak gerekli olabilir.
  3. Sabitleme işleminden sonra, yıkama çözeltisi ile 3 kez yıkayın (0,01% Poloksamer 407 ile PBS). 50 mm NH4CL kullanarak ekstra yıkama yıkama çözeltisi içinde seyreltilmiş, kalıntı PFA çapraz bağlama aktivitesini gidermek için Intercalated olabilir.
  4. Numuneleri engelleme çözümünde en az 30 dakika boyunca kulbe etme.
    Not: Bu aşamada örnekler, boyama işleminden yaklaşık bir hafta önce 4 °C ' de depolanabilir. Eğer öyleyse, buharlaşma önlemek için laboratuar filmi ile plaka mühür.

5. immünostakajlı

  1. 10 cm kare Petri tabak altında laboratuvar film bir levha yerleştirerek bir boyama odası hazırlayın.
  2. Antikor çözümlerini hazırlayın (Bu yazıda kullanılan antikorlar ve seyreltme listesi için Tablo 3 ' a bakın).
  3. Çipi boyama odasına yerleştirin ve hücreleri yukarı dönük olarak destekler ve hemen 100 μL birincil antikor çözeltisi yongasına ekleyin.
    DIKKAT: Bu aşamada, cips adım 4,1 olarak kolayca de-Wet olmamalıdır. Ancak, cips kuru değil önemli olduğu için bakım hala alınmalıdır. Birden çok fiş işlenmek zorunda ise, adım 5,3 her çip için sıralı olarak uygulayın.
  4. Oda sıcaklığında dönen bir platformda 1 saat boyunca inküye yapın.
    Not: hücreler büyük 3B yapıları oluşturdular, numunenin Tekdüzen boyama için izin vermek için daha uzun bir kuluçak süresi gerekebilir. İnkübasyon süresi 24 saate kadar artırılabilir. Ancak, boyama odası su ile dolu 3 cm çanak içermelidir ve boyama odası buharlaşma önlemek için laboratuar filmi ile mühürlü olmalıdır.
  5. Çipleri taze bir multiwell plakasına aktarın ve yıkama çözeltisi ile 3 kez yıkayın.
  6. Adım 5,3 ve 5,4 olarak açıklandığı gibi ikincil antikorlar ile inkübasyon gerçekleştirin.
  7. Herhangi bir standart montaj ortamını (örn. Mowiol) 20 μL kullanarak bir mikroskobik slaytta çip bağlayın.

6. görüntüleme

Not: görüntüleme, standart bir Konfokal mikroskop üzerinde gerçekleştirilebilir. Burada sadece sonraki Nicel analiz için yeterli olacak bir görüntü kalitesi sağlamak için öneriler sunuyoruz.

DIKKAT: herhangi bir operatör önyargı önlemek Için, görüntü için koloniler sadece nükleer zarf sinyali kullanılarak seçilmelidir (bir koloni düzgün desen şeklini takip olup olmadığını görmek için). Mikroskop ayarlarını ayarlarken dışında ilgi işaretçileri sinyalini kontrol kaçının.

  1. Edinme biti derinliğinin 12 veya 16 bit olduğundan emin olun.
  2. Her görüntü kanalı için dinamik aralığı maksimize etmek için uygun ayarları tanımlayın. Özellikle, görüntü kırpma kaçının.
  3. Mikrodesen otofloresans görüntüye bir kanal ekleyin (bkz. Şekil 3).
  4. X ve y eksenlerinde 0,1 ile 0,6 μm arasında değişen ve z ekseninde 0,2 ile 2 μm arasında değişen Voksel boyutları elde etmek için görüntü boyutunu ve yakınlaştırma faktörünü ayarlayın.
    Not: Örneğin, bu çalışmada, 40 x objektif (1,3 eşittir sayısal diyafram), dijital zoom olmadan 1024 x 1024 piksel görüntü boyutu ve 0,5 μm z-Step boyutu ile ters tarama Konfokal mikroskop kullandık. Bu da 0,38 μm x 0,38 μm x 0,5 μm ' lık bir Voksel boyutuyla sonuçlandı.
  5. Her kolonide, tüm koloninin elde edilmesini sağlamak için z ekseni boyunca minimum ve maksimum konumu tanımlayın. En az bir uçak, hiçbir sinyal düşük ile koloninin altına ve altına dahil edilmelidir.
  6. Z-yığını oryantasyonlardan tutarlı bir şekilde elde edilmesini sağlayın (her zaman üstten alta veya her zaman alt üste)
  7. Görüntü kalitesi ve görüntüleme süresi arasında optimum belirlemek için tarama hızını, görüntü çözünürlüğünü, çerçeve ortalamasını ve dedektör kazançlarını ayarlayın. Bir belirti olarak, Şekil 3 ' te gösterildiği gibi bir koloni için görüntüleme süresi yaklaşık 2 – 3 dk. görüntü edinme gerçekleştirin.
    DIKKAT: karşılaştırılabilir olması için tüm görüntüler, aynı objektif ve edinme ayarları ile aynı mikroskop üzerinde elde edilmelidir.
  8. Alım sonunda, tüm görüntüleri kaydedin ve her görüntünün temsil ettiği deneysel koşulu tanımlamak için benzersiz bir adlandırma kuralı atayın.
    Not: bkz. Şekil 4 örnek olarak, bu kural daha sonra çözümleme yordamı sırasında kullanılacaktır. Görüntülerin BioFormats 26tarafından desteklenen herhangi bir biçime kaydedilebilir unutmayın. Koloniler görüş alanından daha büyükse, ımagej 'nin dikiş eklentisi27kullanılabilir. Ayrıca dikiş durumunda, aydınlatma roll off düzeltme gerekli olabilir unutmayın.

7. görüntü analizi

Not: Bu yordam için önerilen bilgisayar belirtimleri: 16 GB RAM, çok çekirdekli 3,33 GHz CPU ve en az 50 GB disk alanı (veya daha fazla görüntülenmiş yongaları sayısına bağlı olarak). Yazılım Linux, Windows ve MacOS üzerinde test edilmiştir. PickCells karmaşık çok boyutlu görüntülerde hücrelerin kolektif organizasyonun analizine adanmış bir grafik kullanıcı arayüzü ile bir çapraz platform görüntü analizi uygulamasıdır (Blin ve al, hazırlık). Burada bahsedilen belirli modüller için PickCells hakkında daha fazla bilgi yanı sıra belgeleri çevrimiçi bulunabilir unutmayın: https://pickcellslab.frama.io/docs/. Biz yazılımı geliştirmeye devam gibi arayüz değişebilir de unutmayın. Arayüz şekil veya videoda gösterilenden farklıysa, lütfen çevrimiçi el kitabına bakın.

  1. Yükleyin ve çevrimiçi kullanılabilir belgeleri izleyerek PickCells çalıştırın.
  2. Görüntüleri içe aktarın ve sağlanan bilgilerin doğruluğunu doğrulayın (Şekil 4-1).
  3. Her kanalın adını belgeleyin.
  4. Bölüm çekirdekleri Nessys modülünü kullanarak nükleer zarf sinyaline dayanan28 (Şekil 4-2) ve oluşturulan segmentli görüntüleri adlandırmak için kullanılacak bir önek (örneğin "çekirdekler") sağlar.
    Not: kullanım ve parametre ayarlamaları hakkında belgeler https://framagit.org/pickcellslab/nessys adresinde bulunabilir.
  5. Segmentasyon Editor modülünü kullanarak, gerekirse segmentleri inceleyin ve düzenleyin (Şekil 4-3)
    Not: herhangi bir nedenle segmentasyon işlemi tatmin edici sonuçlar sağlamamadı, el ile veritabanı klasöründeki görüntüleri silin ve ayrıca MetaModel görünümünde ' segmentasyon sonucu ' düğümünü silin. Ardından, adım 7,4 ve 7,5 yineleyin. Görüntülerin sadece küçük bir alt kümesini segmentasyon tatmin edici sonuçlar sağlamaz ise, o zaman Nessys standalone uygulama kullanın (7,4 bağlantı bakın), ' hatalı görüntüler ' segment girişimi ve veritabanı klasöründe ilgili dosyayı değiştirmek).
  6. Temel segmentasyon modülünü kullanarak desen otofloresans sinyalini segmentlere ayırma (Şekil 4-4)
    1. Oluşturulan bölümlenmiş görüntüleri adlandırmak için kullanılacak bir önek (örneğin "desen") sağlayın.
    2. Otofloresans sinyalini içeren kanalı seçin.
    3. Gürültü azaltma Uygula; genellikle 10 x 10 x 0,5 voxels çekirdek boyutu ile bir Gauss filtresi kullanarak tatmin edici sonuçlar verir.
    4. Ön plan beyaz göründüğünde arka planda mavi renkte görünecek şekilde alt eşik değerini ayarlayın. Yüksek yoğunlukları nihai sonucu (kırmızı alanlar) hariç tutulması önlemek için de üst eşik maksimum değerine ayarlayın.
    5. Son adım için Atla 'yı seçin.
    6. Son 'u tıklatın ve tüm görüntüler işlenene kadar bekleyin.
  7. Çekirdekler gelince, segmentasyon sonuçları artık görsel olarak incelenebilir ve gerekirse segmentasyon düzenleyici modülünü kullanarak düzeltilmiş (Şekil 4-5).
  8. Çekirdekler nesneleri oluşturun ve temel nesne özelliklerini hesaplar.
    1. Ana arabirimin solundaki görev çubuğundan içsel Özellikler modülünü başlatın (Şekil 4-6).
    2. Yalnızca temel özellikler panelini açık tutmak Için ellipsoid Fitter ve Surface Extractor panelleri 'ni kapatın.
    3. Nucleus nesne türü olarak seçin ve "segmentlenmiş görüntüler" için 7,4 adımda verilen öneki seçin.
    4. COMPUTE tuşuna basın ve tüm görüntüleri işlenene kadar bekleyin.
      Not: Bu adımdan sonra, çekirdekler segmentleri yeniden düzenlemek mümkün olmayacaktır.
  9. Desen nesneleri oluşturun ve temel nesne özelliklerini hesaplar. 7.8.4 için 7.8.1 adımları yineleyin, yalnızca bu kez özel türü olarak nesne türü ve bölümlenmiş görüntüleriçin adım 7.6.1 verilen öneki seçin.
    Not: Bu adımın ardından, desen segmentini yeniden düzenlemek mümkün olmayacaktır.
  10. Her çekirdeğin bir kernel niteliği olarak ait olduğu görüntünün adını saklayın.
    1. Tıklayın veri ≫ yeni nitelik ve seçin Nucleus Popup Iletişim kutusunda ve tıklayın ok.
    2. Düğüme bağlı diğer nesnelerden veri topla 'yı seçin ve İleri'yi tıklatın.
    3. Sol bölmede, resim 'i seçin ve sonra yol tanımı panelinde bitiş bayrağı altındaki sorgu işaretini çift tıklatarak görüntü düğümünü yolun hedefi olarak ayarlayın.
    4. Sol paneldeki kullanılabilir öznitelikler bölmesini genişletin ve ad özniteliğini seçin.
    5. Azaltma işlemi bölmesini genişletin ve bir al'ı seçin, ardından Değiştir düğmesine tıklayın ve İleri'ye tıklayın.
    6. "Resim adı" yazın, sekme tuşuna basın ve Tamam'ı tıklatın.
  11. Çekirdekler nesnelerinde bir "normalleştirilmiş koordinat" niteliği oluşturun (Şekil 4-7).
    1. Desen centroid koordinatları bir Nucleus özniteliği olarak depolamak için 7.10.6 için 7.10.1 adımları uyarlayın. Bu yeni öznitelik "desen koordinatı" adı.
    2. Ardından, veri ≫ yeni öznitelik' i tıklatın, Nucleus seçin ve Tamam' ı tıklatın.
    3. Düğümün uzamsal veya yönlü vektörler arasında bir Işlev tanımla 'yı seçin ve İleri'yi tıklatın.
    4. Işlev türü Için dizi Işlemiseçin, v1 için Madde vektörü ve ardından centroidseçin ve v2 için Madde vektörü seçin ve sonra desen koordinasyonue.
    5. İleri'yi tıklatın, ad alanına "normalleştirilmiş koordinat" yazın ve son'u tıklatın.
  12. Verileri bir sekmeyle ayrılmış değer dosyasına dışa aktarın.

8. R Analizi

  1. Rstudio 'Yu indirin ve yükleyin.
    Not: yazılım bilgileri ve indirme bağlantıları https://www.rstudio.com/adresinde mevcuttur.
  2. Bu analiz için gereken R komut dosyalarını indirin.
    Not: komut dosyaları GitLab deposundan indirilebilir: https://framagit.org/pickcellslab/hexmapr.
  3. Rstudio 'Yu açın.
    Not: komut dosyalarını ilk kez çalıştırıyorsanız, gerekli R paketlerini (ggplot2 ve ölçekler) yükleyin.
  4. Rstudio 'dan binnedmap_template açın. R Script.
  5. Çalışma dizinini kaynak dosya konumuna ayarlayın.
  6. Şekil 5' te gösterildiği gibi uzamsal eşlemeleri elde etmek için belirli bir veri kümesine komut dosyası uyarlamak için komut dosyasında sağlanan yönergeleri izleyin.
  7. Yoğunluk eşlemeleri oluşturmak için komut dosyasını çalıştırın.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan fotoğraf deseni yöntemi, kültürlü hücreleri tanımlanmış şekiller ve boyutlarda kolonilere tam olarak düzenlemenize olanak sağlar. Bu prosedürün başarısı, Şekil 2a'da gösterildiği gibi fotomask tasarımına göre küme olacak şekilde hücre tohumlama prosedürü (adım 3,7) hemen sonra açıkça belirgin olmalıdır. Hücre tohumlama sonra 1 saat, bireysel desenler tam confluent olmayabilir (desen başına sadece birkaç hücre), ancak, hücreler zaman içinde çoğalırlar gibi, desenler tamamen yapışkan yüzeyler dışında sadece çok az hücre ile kolonize olacak (Şekil 2B). Kültürün tam görünümünü hücre satırı bağımlı olacaktır. Örneğin, mESC formu kubbeli şekilli koloniler10. Hücre tohumlama prosedürün başarısızlığı gösterir sonra desen 1 ila 2 h açık değildir bir çip (Şekil 2C, d).

Büyük ve kalın koloniler bazen homojen leke yapmak için zor olabilir. Biz düzeltmek ve bu antikor penetrasyon artırabilir gibi bir adımda (Bölüm 4) hücreleri penetrabilize öneririz29. Bu nedenle, seçilmiş olan fixatif çözümün bir deterjan içerdiğinden dolayı. Şekil 3 , immünostesden sonra beklenen floresan sinyalini gösterir. Parlak ID3 pozitif hücrelerin kolonilerin yoğun bölgelerinde (parlak NPC bölgeleri) bulundukları dikkat edin (Şekil 3A). Bu gibi ipuçları antikor boyama prosedürü kalitesini değerlendirmek için yararlıdır. Ayrıca mevcut tekniği ile oluşturulan mikrodesenler autofluorescent olduğunu dikkat edin. Bu sinyal (Şekil 3A, B sol çoğu görüntü), analiz aşamasında kolonileri birbirleriyle dağınık şekilde kaydetmek ve Şekil 5' te gösterilen sonuçları oluşturmak için yararlıdır. Örnek bir 405 nm lazer ile heyecan ve bu kanal bu amaç için boyama olmadan bırakılmalıdır zaman otofloresans sinyali genellikle parlak. Şekil 3 aynı zamanda hücrelerin farklı şekillerin desenlerinde tam olarak nasıl kısıtlı olduğunu gösterir.

Görüntüleme verilerinin analizi, laboratuvarımızda (Blin ve al., hazırlık aşamasında) geliştirilen ücretsiz ve açık kaynaklı bir yazılım olan PickCells 'da gerçekleştirilir. Bu yazılım, nesne hesaplamak için (Şekil 4-2,4-4) vesegmentli nesneleri (Şekil 4-3, 4-5) segmentlere ayırmak için Konfokal görüntüleri (Şekil 4-1), okumak ve sıralamak için görüntü analiz modülleri içerir koordinatları veya Ortalama Yoğunluk gibi özellikleri (Şekil 4-6) ve verileri dışa aktarmak için (Şekil 4-7, 4-8). Daha da önemlisi, özellikle micropatterns üzerinde yetiştirilen hücreler gibi hücrelerin yoğun ve heterojen nüfusu için uygun olan Nessys28 denilen sağlam bir nükleer segment yöntemi geliştirdik (Şekil 3). Şekil 4 -2 her hücrenin doğru benzersiz bir renk kimliği verilen nessys modülünün temsili bir çıkış gösterir. Yalnızca en az düzenleme gerekli olmalıdır, ancak düzenleme Kullanıcı buna karar vermelidir mümkündür (Şekil 4-3). Son olarak PickCells veri görselleştirmek için görselleştirme modülleri bir dizi sağlar. Şekil 4-6' d a bir örnek verilmiştir: halka şeklinde bir koloni, çekirdeklerin z ekseni boyunca konumlarına göre renk kodlu olduğu 3B olarak işlenir. Analiz PickCells 'de doğrulandıktan sonra, Şekil 530' da gösterildiği gibi (https://framagit.org/pickcellslab/hexmapr) adresinde bulunan komut dosyalarını kullanarak R 'de uzamsal eşlemeleri oluşturmak için veri ihraç edilebilir.

Son zamanlarda mesc 'nin küçük (30.000 μm2) disk veya elips mikrodesenlerinin uzamsal kısıtlanması, Mezodermal Marker tbra10' ı ifade eden hücrelerin alt popülasyonunun desenlerini yönlendirecektir. Böylece, burada bizim yöntemi göstermek için, Tbra deseni büyük kolonilerde (90.000 μm2) BMP sinyalizasyon etkilenir olabilir eğer sormak. Şekil 5A mesc büyük disk mikrodesenler üzerinde yetiştirilen gösterir, tbra + hücreler tercihen desen çevre (tbra + Yoğunluk Haritası), nerede yerel hücre yoğunluğu en düşük olduğu sınırlıdır ( Şekil 5A sol mavi harita bakın ). Tbra 'nın bu deseni, ortalama Tbra yoğunluğunun haritasına göre onaylanmıştır.

Bu veriler, yöntem alt görsel bilgileri gösterebilir gösterir. Nitekim, Şekil 3' ten, bir koloninin görsel gözetimi tbra ifadesinde herhangi bir uzamsal organizasyonun belirlenmesi için yeterli değildir. Bu özellikle önemli koloni tarafından ölçülebilir ve Şekil 5Asağ en panelinde gösterilen koloni değişkenliği tarafından açıklanmıştır.

Teknik aynı zamanda hiçbir algılanamayan desen var olduğunu gösterir ID+ (BMP sinyalizasyon hedefi), T desenleme BMP bu bağlamda sinyalizasyon tarafından tahrik değil gösterebilir.

Micropatterning mümkün neredeyse herhangi bir geometri benimsemeye koloniler zorlamak için yapar. Bu, sistemin çeşitli geometriler için nasıl yanıt verdiğini sorgulamak için özellikle yararlıdır. Örneğin, koloninin merkezinde bir morfojen degradesi yaratılırsa kolonide bir delik yaratmanın bu degradeyi bozmasına neden olabilir. İlginçtir ki hala daha az sağlam bir şekilde (Şekil 5B) bir halka mikrodesen üzerinde paterning gözlemlemek.

figure-results-1
Şekil 1: yönteme genel bakış. Yöntemin ana adımlarını gösteren diyagram. Her adım için, tahmini süreyi görevin adı altında belirtilir ve bir şematik yordamın amacını gösterir. Kullanılabilir olduğunda ilgili bir rakam için bir başvuru da sağlanır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2: kültür görünümü 1 h ve 48 h mikrodesenler hücreleri tohumlama sonra. MESC Brightfield görüntüleri mikrodesenler üzerine diktir. (a) beklenen hücre organizasyonu 1 saat tohumlama sonra, desenler açıkça tanımlanabilir olmalıdır. (b) kültür 48 h sonra beklenen sonuç. mesc çoğaldı ve hala kesinlikle desen şekilleri ile sınırlıdır. (c-d) Mümkün olmayan en iyi sonuçlar, ya çok az hücre slayt (c) veya hücreler arasında (d) arasında uyur çevre dışında plastik uyması. Sorun giderme kılavuzu için Tablo 2 ' ye bakın. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 3: mikrodesenler üzerinde yetiştirilen immünostik kolonilerin temsilcisi Konfokal görüntüler.
(A) IDD ve nükleer gözenek kompleksi veya (B) tbra ve LaminB1 için immünofluorescence sonrası temsilci mesc kolonileri. Her boyama için, bir disk micropattern üzerinde yetiştirilen bir koloni ve bir halka mikrodesen üzerinde yetiştirilen bir koloni gösterilir. Bireysel kanallar gri ölçekli görüntüler olarak sağlanır. Micropattern (405 nm lazer uyarma) net otomatik floresan sinyali dikkat edin. Ölçek çubuğu 50 μm temsil eder. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .

figure-results-4
Şekil 4: görüntü analiz prosedürün akış çizelgesi. 3B Konfokal görüntülerin listesi analiz için PickCells 'a aktarılır (1). Bu örnek, iki farklı şekil (disk ve yüzük Şekil 2' de olduğu gibi) ile bir deneme gösterir. Görüntü adlandırma kuralı soldaki gösterilir ve PickCells sağdaki arabirim. Sonra, Nessys modülü otomatik olarak çekirdeğini segmentlere ayırmak için kullanılır (2). Ekran görüntüsünde, her çekirdek doğru segmentasyon gösteren benzersiz bir renk verilir. Desenin otofloresans de bu kez, ' temel segmentasyon ' modülü (4) kullanarak, bölümlenmiştir. Arka plan mavi ve beyaz sinyalin desen şekli olarak tanımlanacaktır. Bölümlere ayrılmış şekiller daha sonra doğru segmentasyon sağlamak için görsel olarak denetlenir ve segment düzenleyici modülünü (3 – 5) kullanarak gerekirse düzenlenebilir. Ekran görüntüleri algılanan şekillerin anahatlarını gösterir. Pembe ve sarı şekiller düzenlenmiştir. Son olarak, nesneler özellikleri hesaplanır ve daha sonra R (6 – 7) işlenmek üzere dosyaya verilir. 3B görünüm olarak işlenen bir koloninin ekran görüntüsü sağlanır (6). 2 ile 6 arasındaki adımlar için, bu makaleyi yazma sırasında PickCells arabiriminde bulunan simgeler adım dizininin yanında verilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

figure-results-5
Şekil 5: iki farklı transkripsiyon faktörü ve mikrodesen şekilleri için temsilci sonuçları
(A) disk şekilli mikrodesenler veya (B) halka şekilli mikrodesenler için 48 h için yetiştirilen mesc için Binned uzamsal harita. Her mikrodesen şekli için, hücre fenotipinden bağımsız olarak hücre yoğunluğunun Haritası sol tarafta mavi renk ölçeğinde gösterilir. Daha sonra her marker için (üst satırda Tbra ve alt satırda ID3), üç farklı haritalar, soldan sağa sağlanır: hücre yoğunluğu Haritası işaret hücreleri sadece (eşik tabanlı analiz), ortalama Marker yoğunluğu Haritası (log2) ve harita işaret yoğunluğunun standart sapması. Yoğunlukları, rasgele floresan üniteleri olarak verilir. Her harita için mikro desen şekli beyaz bir anahat olarak verilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

ECM tipiJelatinFibronektinBodrum membran matris
KonsantrasyonECM konsantrasyonu1 mg/mL20 μg/mL200 μg/mL
Poloxamer 407 konsantrasyon500 μg/mL400 μg/mL1 mg/mL
İle test edildimESCEvetEvetEvet
MesicNoEvetEvet
Serum ücretsiz ortaNoEvetEvet

Tablo 1: Poloksamer 407 ve ECM 'nin test edilmiş konsantrasyonları. Bu tablo, laboratuvarımızda test ettiğimiz ECM ve Poloksamer 407 konsantrasyonlarına genel bir bakış sağlar. Her ECM/poloxamer 407 kombinasyonu için, deseninin başarıyla elde edildiği hücre tipi, kültürün serum olup olmadığına bakılmaksızın gösterilir. mESC = fare embriyonik kök hücre, Mesic = fare epiblast kök hücresi.

YordamGözlemOlası sorunÇözüm
MikrodesenlamaDüşük hücreli ataşmanuygunsuz ECM/poloxamer 307 konsantrasyon oranıECM/poloxamer 307 konsantrasyon oranını artırın
Hücre eki süresi çok kısaHücrelerde düzgün desenlerine uymak için yeterli zaman vermek için inkübasyon süresini artırın (adım 3,4). Bu adımı optimize etmek için, mikroskop altındaki hücreleri kontrol etmek, hücrelerin uyamaya başladığını belirten hücre morfolojisinde bir değişiklik saptamanıza yardımcı olabilir.
Çok yoğun yıkıyor (adım 3,6)Orta değiştirirken, doğrudan çiplerin üzerine pipetleme orta kaçının. Bunun yerine, yavaşça yerine kuyu duvarlarında orta pipet
Hücreler desenler arasında uyuruygunsuz ECM/poloxamer 307 konsantrasyon oranıECM/poloxamer 407 konsantrasyon oranını azaltın
Hücre eki süresi çok uzunİnkübasyon süresini azaltın (adım 3,4).
Etkisiz yıkıyor (adım 3,6)Plaka sallama şiddetle genellikle fazla hücreleri ayırmak için yeterlidir. Çip için güçlü bir şekilde yapışmaya eğilimli hücre türleri için, doğrudan çipin üzerine pipetleme sonucu artırabilir. Yıkanmaları sayısını artırmak da yardımcı olabilir, özellikle hiçbir hücre bu adımdan sonra ortamda yüzen kalmasını sağlamak için.
Hücreler desen şeklini kesinlikle takip etmiyor' Uyumsuz ' hücre türü ve desen geometrisiBelirli bir desen şekli ve hücre türü için optimum desen boyutunu test etmek ve tanımlamak için photomask üzerine eklenecek çoklu geometrileri/boyutları planlayın/tasarlayın. Lütfen, tartışmada ' sınırlamalar ' bölümüne bakın
Optimum olmayan fotoğraf deseni, bu otomatik osilesan sinyalinin keskinliğini gözlemleyerek teşhis edilebilir. Desen sınırları Şekil 2 ' de olduğu gibi keskin görünmelidir. Kalıpların kenarlıkları bulanık görünüyorsa, fotoğraf deseni adımının geliştirilmesi gerekir.Bulanık desen kenarları, plastik kaydırmanın aydınlatma adımında maske yüzeyine yeterince yakın olmadığını gösterir. Fotoomask için slaytları tutan parçaların bile ve aydınlatma prosedürü sırasında montaj için sabit ve yeterli basınç uygulandığından emin olun.
Boy -amaHomojen olmayan boyamaantikor inkübasyon süresi çok kısaAntikor kuluçk süresini artırın (Oda sıcaklığında 24 saate kadar)
montaj prosedürü sırasında düzleştirilmiş kolonilerHücre montajı için ihtiyaç duymadan hem immünostasyon hem de görüntüleme yapmak için chamlid veya cytoo-Chambers gibi bir oda içinde mikro desen slaytlar monte edin. Bu daha iyi koloni 3D-yapı korumak olacaktır.
Boyama prosedürü sırasında koloniler ayırmaÇipin dewettingYeterli orta bırakın veya 2 pipetler kullanın, bir orta ve diğer taze çözüm eklemek için kaldırmak için
Koloniler mikroskop altında parçalanmış görünüyormikroskobik slayt üzerinde çip monte ederken koloniler yamultulmuş edildiYongaları monte ederken çok nazik olun. Alternatif olarak, mikrodesenler monte etmek için pah veya sitooda gibi bir odada hücrelerin montajı gerek kalmadan hem immünostalite hem de görüntüleme yapmak için slaytlar. Bu da koloni ultrastrine korur.

Tablo 2: sorun giderme kılavuzu. Bu tablo, olası alt optimal sonuçlara genel bir bakış sağlar. Sorunların potansiyel kaynakları da önerilen çözümlerle birlikte listelenir.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada hücrelerin kültürlerinde acil desenlemeyi analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Basitleştirilmiş bir mikrodesen yaklaşımı, hücre kolonilerinin şeklini ve boyutunu standardizmek için kullanılır ve bu kolonilerde desenlerin algılanmasını ve ölçülmesini sağlayan görüntü analiz araçları ve R scriptleri sunuyoruz.

Önerdiği boru hattı, yazarları kültür koşullarına odaklanarak, ticari olarak kullanılabilen mikrodesenleri kullanarak, ESC kolonilerinde yeniden üretilebilen germ katmanı oluşumu elde etmek için önceden yayımlanan bir yöntem31 ' e benzer. in vitro erken gastrülasyon olayların çalışması. Amacımız, hücrelerin kolektif organizasyonunun sadece istatistiksel analizden sonra belirgin hale gelmesine neden olan model oluşumunun keşfi için genelleştirilebilir bir boru hattı sağlamaya odaklanmıştır. Bu nedenle, çoklu koloniler üzerinde 3D alanda nükleer pozisyonun doğru tanımlanması ve analizini sağlayan sağlam bir görüntü analizi iş akışı sağlıyoruz (Ayrıca bkz. tartışma). Biz de topluluk için yararlı olacağını umuyoruz uzun vadede ticari çözümler için daha esnek ve ucuz bir alternatif sunan basit bir ev mikrodesen yaklaşımı geliştirmeye karar verdik.

Son olarak, bu makalenin revizyonu sırasında, R betiklerine benzer desen analizi için yeni bir paket32serbest bırakıldı. Bu yeni paket, yüksek verimlilik görüntüleme platformlarından elde edilebilir giriş olarak hücre özelliklerinin tablolarını kabul eder. Biz bu olasılığı kendimizi test değil olsa da bu yeni pakete bir giriş olarak ilke olabilir bizim protokolün 7 adımda oluşturulan çekirdekler özellikleri tablo inanıyoruz.

Yöntemin diğer hücre türlerine ve koloniye geometrilerine adaptability

Biz serum varlığında pluripotent hücrelerin kültürlerinde Mezodermal transkripsiyon faktörlerinin ortaya çıkması eğitim bağlamında bu yaklaşımı sunuyoruz. Ancak bu yöntem ECM/poloxamer 407 konsantrasyonlarını optimize etmek için gerekli olabilir, ancak diğer hücre türlerine ve serum içermeyen kültürlere kolayca uyarlanabilir (test konsantrasyonları için Tablo 1 ve bir sorun giderme kılavuzu için Tablo 2 ' ye bakın). Yöntem ayrıca, daha büyük veya daha küçük boyutlarda mikrodesenler ve Kullanıcı ihtiyaçlarına göre şekiller geniş bir yelpazede adapte edilebilir. Ancak, yöntemi oluştururken, tüm şekil/hücre türü kombinasyonları en iyi olduğunu farkında olmak önemlidir. Örneğin, mesc Express yüksek seviyeleri E-cadherin33,34 bu hücrelerin ECM yoksun alanları kapsayan kolektif yapıları oluşturmak için etkinleştirme. Bu hücreler kesinlikle keskin açılarla geometrileri takip etmez veya desen küçük delikler içerir. Örneğin dikkat edin, Şekil 3B'de, hücreler merkezi alanı kolonizasyon sürecinde. Bizim elimizde küçük bir merkezi alan mESC halka şekilli koloniler oluşturmak için zorlamaz. Bu nedenle, test etmek ve en uygun boyutları ve seçim hücre türü için uygun olacak eğrilik belirlemek muktedir fotomask tasarlarken geometrilerin bir çeşitlilik dahil etmek için tavsiye edilir.

Dikkate almak için bir diğer önemli faktör, deneme uzunluğu ve hücrelerin proliferasyon oranı. Bazı hızla Proliferasyona hücre türleri için (pluripotent hücreleri dahil) Bu birçok gün içinde mikrodesenler üzerinde hücreleri korumak için zor olabilir (mesc için üç gün maksimum). Ayrıca, mikrodesenler üzerinde hücrelerin tohumlama her zaman optimum her koloni için oluşmaz, bu yüzden yedek olması için kolonilerin aşırı tohum tavsiye edilir.

Avantaj ve desen algılama yönteminin sınırlamaları

Yöntemin belirli bir avantajı, birden fazla çoğaltma kolonilerinden gelen görüntü analizi sonuçlarını birleştirerek "ortalamayı" çoğaltmayı algılama yeteneğidir (Şekil 5). Bu, bireysel kolonilerin kontrollerinden belirgin olmayan desen olaylarını ortaya çıkarabilir. Bu ' ortalama ' yaklaşımının bir dezavantajı, örneğin küçük noktalar veya dar çizgiler için tekrarlayan kalıpların belirli türlerini kaçırmasıdır. Ancak, bu tür desen yerine dikkatle seçilmiş desen boyutları8kombinasyonu ile ortaya çıkabilir. Ayrıca, burada açıklanan görüntü analizi ardışık düzen kolonik değişkenlik seviyesini araştırmak için imkanı sunan hem tek hücreli hem de koloni çözünürlükte nicel veriler sağlar (Şekil 5) veya birden fazla komşu analizi gerçekleştirmek için ölçekler10.

Ortalama yöntemin bir diğer önemli avantajı da algılama kanalları mevcut fluorophores ile sınırlı kalmadan birçok işaretçileri tercihli konumu harita fırsatı sunuyor olmasıdır. Nitekim, biz burada sunulan çalışmalar farklılaşma sadece iki belirteçleri kullanmak rağmen, yeteneği koloniler standartlaştırmak ve özü "Ortalama" desenler mümkün kolonilerin farklı setleri dağıtım haritaları birlikte sırayla karşılaştırmak için yapar birbirine işaretçilerin Genelleştirilmiş uzamsal ilişkilerini ortaya çıkarmak için.

Ayrıca, burada bizim odak farklılaşma işaretçileri çalışma olmuştur rağmen, analiz yöntemi nükleer işaretçileri mevcut diğer biyolojik süreçleri incelemek için uzatılabilir. Örneğin, bir floresans mayası hücre döngüsü göstergesi35 (fuccı) içeren bir hücre satırının micropatterning nasıl koloni düzeyi geometrisi gruptaki hücre döngüsü olaylarını etkileyebilecek çalışma mümkün kılar.

Gelecekteki talimatlar

Yöntem orta verimlilik görüntü analizine imkan sağlar, ancak görüntü edinme Şu anda tam olarak otomatik değildir ve çok büyük deneyler için sınırlayıcı hale gelebilir. Kolonilerin düzenli düzenlemeleri mümkün olan tek hücreli ortalama20için geliştirilen ne benzer tam otomatize edinme rutinleri oluşturmak için yapmak gerekir. Ancak, bir koloni görüntü için gerekli alan boyutu büyük olasılıkla, mozaikleme gerektirdiğinden ve kolonilerin üç boyutlu olduğu için, sadece ilgili koloniler görüntüleme tarafından hem veri kümesi boyutunu ve edinme süresini azaltmak için son derece arzu edilir. Bu nedenle, gelecekteki çabaları ilgili kolonileri tanımlamak ve her örnek için görüntüleme koordinatları uyum mümkün bir ' akıllı ' mikroskop geliştirmek için adanmış olabilir. Bu sadece zaman ve çaba azaltmak değil, aynı zamanda potansiyel operatör önyargıları önlemek.

Çözümleme ardışık düzenlerini de Kullanıcı almak gereken adımlar sayısını azaltarak daha verimli hale gelebilir. Biz planları bir boru hattı oluşturma mekanizması oluşturmak ve R doğrudan bizim yazılım entegre etmek için (Ayrıca sorunları pickcells-API # 3 ve pickcells-rjava # 1 bizim kod depoları [https://framagit.org/groups/pickcellslab/-/issues] sorun izci bakın). Analiz prosedürün tam otomasyonu zaman ve çaba azaltacak ve olası kullanıcı hatalarını kısıtlayacaktır.

Son olarak, analiz yöntemimizin hücresel deseninin dinamik yapısını henüz tam olarak yakalayamamaktadır. Bazı sınırlı dinamik bilgiler anlık görüntü görüntüleri8,10,36bir zaman serisi inceleyerek ayıklanabilir. Ancak, biz daha iyi desen nasıl ortaya anlamak istiyorsanız hücre nüfus geçmişini kaydetmek mümkün olmak çok arzu edilir. Bir sınırlama, 3B yoğun hücre popülasyonunda bireysel hücrelerin doğru izlenmesi çok zorlu bir görev37kalır. Bizim hücre algılama yöntemi nükleer zarf kullanır ve özellikle iyi yoğun ve çakışan hücre nüfusu28gerçekleştirir. Nükleer zarfın canlı gazetecileri28,38 ve micropatterning tekniğinin bir avantajı kolayca mevcut uzun süreli görüntüleme sırasında görüş alanı dışında hareket hücreleri önlemek için kullanılabilir olmasıdır. Genel olarak, hücrelerin otomatik izleme yakın zamanda kurulan araçların bir kombinasyonu kullanılarak ulaşılabilir olacak eminiz28,39,40 ve bu temel içine yeni Öngörüler getirmelidir kendi kendini organizasyon ilkeleri.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar açıklamak için hiçbir şey var

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iş Bir Sör Henry Wellcome sonrası Doktora Bursu (WT100133 için), bir Wellcome Trust kıdemli Bursu (WT103789AIA S.L.) ve bir Wellcome Trust doktora öğrencilik (108906/z/15/z D.W.) tarafından finanse edildi. Biz de Dr manuel thery için photopatterning tekniği uyarlama hakkında onun tavsiyesi için minnettarız.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-merkaptoetanolGibco31350-010çeker ocakta
1 kez; Master kuvars yansıma önleyici krom fotoğraf maskesiToppan Fotoğraf MaskesiÖzel tasarım
24 oyuklu plakalarCorning3526
4 oyuklu plakalarNunclon Delta176740
%5 Eşek SerumuSigmaD9663
Anti Nükleer gözenek kompleksiAbcamab24609Fare monoklonal, 1:1000
Anti-Id1kullanınBiocheck37-2Tavşan poliklonal, 1:200
Anti-Lamin B1Abcamab16048Tavşan poliklonal kullanın, 1:1000
Anti-TbraR& kullanın DAF2085Keçi ployclonal, 1:400
Engelleme Çözümükullanın NANA%0.1 TritonX-100
%0.01 Pluronic F-127
%5 Eşek Serumu
PBS8 mESC NA NA'da %0.003 Sodyum Azide
Referans: Mountford ve ark. PNAS, 1994
Fiksasyon çözeltisiNANA%4 PFA yıkama solüsyonunda seyreltilmiş
Fetal sığır serumuGibco10270-106Serum partileri, ESC bakımıyla uyumluluğu sağlamak için test edilmelidir
JelatinSigmaG1890
Glasgow Minimum Temel OrtaSigmaG5154
Laboratuvar FilmiVWR291-1212
Düzen Düzenleyici YazılımıLayoutEditorNAhttps://layouteditor.com/
Layout Editor YazılımKlayoutNAhttps://www.klayout.de/
L-glutaminGibco25030-024
LIFMilliporeESG1107
MEM NEAAGibco11140-035
mESC Kültür ortamıNANAGMEM
%10 FCS
100 U/ml LIF
100 nM 2-merkaptoetanol
1 & kez; esansiyel olmayan amino asitler,
2 mM L- glutamin
1 mM sodyum piruvat
NH4Cl 50mMSigma9718
ParaformaldehitSigma158127DİKKAT: Toksik, çeker ocakta seyreltilmemiş stokları kullanın ve koruyucu ekipman giyin
PBS (immün boyama)Sigma P4417200 ml ddH < sub > 2 < / sub>O
PBS (doku kültürü)Gibco11140-035
Plastik slaytlarIbidiIB-10813
Poloxamer 407SigmaP2443
ProLong Altın Antifade MountantMoleküler ProblarP36930
Sodyum AzideSigma8591DİKKAT: Toksik, çeker ocakta tutun ve koruyucu ekipman giyin
Sodyum piruvatGibco11360070
TritonX-100SigmaT8532
TrypsinGibco25200056
UVO temizleyiciJetlight, ABD42-220DİKKAT: Üreticiyi takip edin s güvenlik önerileri
PBS'de Yıkama SolüsyonuNANA%0.1 TritonX-100
%0.01 Pluronic F-127
kullanın

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sasai, Y. Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture. Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).
  2. Turner, D. A., Baillie-Johnson, P., Martinez Arias, A. Organoids and the genetically encoded self-assembly of embryonic stem cells. BioEssays. 38 (2), 181-191 (2016).
  3. Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144 (6), 976-985 (2017).
  4. Tewary, M., Shakiba, N., Zandstra, P. W. Stem cell bioengineering: building from stem cell biology. Nature Reviews. Genetics. 19 (10), 595-614 (2018).
  5. Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo. Nature Cell Biology. 20 (8), 878(2018).
  6. Laurent, J., et al. Convergence of microengineering and cellular self-organization towards functional tissue manufacturing. Nature Biomedical Engineering. 1 (12), 939(2017).
  7. McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Developmental Cell. 6 (4), 483-495 (2004).
  8. Tewary, M., et al. A stepwise model of Reaction-Diffusion and Positional-Information governs self-organized human peri-gastrulation-like patterning. Development. , (2017).
  9. Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
  10. Blin, G., Wisniewski, D., Picart, C., Thery, M., Puceat, M., Lowell, S. Geometrical confinement controls the asymmetric patterning of brachyury in cultures of pluripotent cells. Development. 145 (18), (2018).
  11. Micropatterning in cell biology. Pt. A. , Elsevier. Amsterdam. (2014).
  12. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), Dayton, Ohio. 2300-2310 (2008).
  13. Heemskerk, I., Burt, K., Miller, M., Chabra, S., Guerra, M. C., Warmflash, A. Morphogen dynamics control patterning in a stem cell model of the human embryo. bioRxiv. , 202366(2017).
  14. Nemashkalo, A., Ruzo, A., Heemskerk, I., Warmflash, A. Morphogen and community effects determine cell fates in response to BMP4 signaling in human embryonic stem cells. Development. 144 (17), 3042-3053 (2017).
  15. Peerani, R., Onishi, K., Mahdavi, A., Kumacheva, E., Zandstra, P. W. Manipulation of signaling thresholds in “engineered stem cell niches” identifies design criteria for pluripotent stem cell screens. PloS One. 4 (7), e6438(2009).
  16. Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. The EMBO journal. 26 (22), 4744-4755 (2007).
  17. Etoc, F., et al. A Balance between Secreted Inhibitors and Edge Sensing Controls Gastruloid Self-Organization. Developmental Cell. 39 (3), 302-315 (2016).
  18. Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein micropatterns: A direct printing protocol using deep UVs. Methods in Cell Biology. 97, 133-146 (2010).
  19. Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).
  20. Degot, S., et al. Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (46), e2514(2010).
  21. Beddington, R. S. P., Rashbass, P., Wilson, V. Brachyury - a gene affecting mouse gastrulation and early organogenesis. Development. 116 (Supplement), 157-165 (1992).
  22. Wilkinson, D. G., Bhatt, S., Herrmann, B. G. Expression pattern of the mouse T gene and its role in mesoderm formation. Nature. 343 (6259), 657-659 (1990).
  23. Hollnagel, A., Oehlmann, V., Heymer, J., Rüther, U., Nordheim, A. Id Genes Are Direct Targets of Bone Morphogenetic Protein Induction in Embryonic Stem Cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19838-19845 (1999).
  24. Mountford, P., et al. Dicistronic targeting constructs: reporters and modifiers of mammalian gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4303-4307 (1994).
  25. Smith, A. G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. Journal of tissue culture methods. 13 (2), 89-94 (1991).
  26. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  27. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
  28. Blin, G., Sadurska, D., Migueles, R. P., Chen, N., Watson, J. A., Lowell, S. Nessys: a novel method for accurate nuclear segmentation in 3D. bioRxiv. , 502872(2018).
  29. Weiswald, L. -B., Guinebretière, J. -M., Richon, S., Bellet, D., Saubaméa, B., Dangles-Marie, V. In situ protein expression in tumour spheres: development of an immunostaining protocol for confocal microscopy. BMC cancer. 10, 106(2010).
  30. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org/ (2013).
  31. Deglincerti, A., et al. Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns. Nature Protocols. 11 (11), 2223-2232 (2016).
  32. Ostblom, J., Nazareth, E. J. P., Tewary, M., Zandstra, P. W. Context-explorer: Analysis of spatially organized protein expression in high-throughput screens. PLOS Computational Biology. 15 (1), e1006384(2019).
  33. Larue, L., Ohsugi, M., Hirchenhain, J., Kemler, R. E-cadherin null mutant embryos fail to form a trophectoderm epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (17), 8263-8267 (1994).
  34. Pieters, T., van Roy, F. Role of cell-cell adhesion complexes in embryonic stem cell biology. J Cell Sci. 127 (12), 2603-2613 (2014).
  35. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
  36. Morgani, S. M., Metzger, J. J., Nichols, J., Siggia, E. D., Hadjantonakis, A. -K. Micropattern differentiation of mouse pluripotent stem cells recapitulates embryo regionalized cell fate patterning. eLife. 7, e32839(2018).
  37. Ulman, V., et al. An objective comparison of cell-tracking algorithms. Nature Methods. 14 (12), 1141(2017).
  38. Moir, R. D., Yoon, M., Khuon, S., Goldman, R. D. Nuclear Lamins a and B1. The Journal of Cell Biology. 151 (6), 1155-1168 (2000).
  39. McDole, K., et al. In Toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level. Cell. 175 (3), 859-876 (2018).
  40. Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-Dimensional Cell Segmentation in Large-Scale Microscopy Data of Developing Embryos. Developmental Cell. 36 (2), 225-240 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Micropatterning TechniqueQuantitative ImagingSpatial OrganizationCell PatterningPhoto Patterning MethodImage Analysis FrameworkNuclei SegmentationDensity Map GenerationEmbryonic Stem CellsBrachyury Marker

Related Articles