Meme hücrelerinin Mikrodesenler ve nicel görüntüleme kullanarak acil uzamsal organizasyonu haritalama

Summary

Burada sunulan yöntem, memeliyle ilgili kültürlerin içinde uzamsal organizasyon ortaya çıkarmak için nicel görüntüleme ile birlikte micropatterning kullanır. Teknik standart bir hücre biyoloji laboratuarında kurmak kolaydır ve in vitro desen çalışması için bir uysal sistemi sunar.

Abstract

Biyolojide temel bir amaç, gelişim sırasında kalıplarının nasıl ortaya çıktığını anlamıdır. Çeşitli gruplar, kök hücreler dağınık bir şekilde mikrodesenler üzerine kapalı olduğunda desenlerin in vitro olarak elde edilebildiği, böylece tanımlamak için benzersiz fırsatlar sunan deneysel modeller kurmak göstermiştir, in vitro, biyolojik temel ilkeleri Organizasyon.

Burada metodoloji kendi uygulanması açıklanmaktadır. Biz standart bir hücre biyoloji laboratuarında yöntemi kurmak daha kolay hale getirmek için özel ekipman ihtiyacını azaltmak için bir fotoğraf desen tekniği adapte. Ayrıca, standart şekiller ve boyutlarda koloniler içindeki hücrelerin alt nüfuslarının Tercihli pozisyonlanmasını tam olarak ölçmek için ücretsiz, açık kaynaklı ve kolay kurulabilir bir görüntü analizi çerçevesi geliştirdik. Bu yöntem, hücrelerin görünüşte düzensiz nüfuslarında bile desen olayların varlığını ortaya çıkarmak mümkün kılar. Teknik, nicel öngörüler sağlar ve belirli bir desen sürecinde ortamın (örn. fiziksel ipuçları veya endojen sinyalizasyon) etkilerini ayrıştıracak şekilde kullanılabilir.

Introduction

Memelinin sistemlerinde, desen hücrelerin kolektif davranışlarının acil bir özelliğidir ve böylece, hücreler^1,2,3,4, uygun ipuçları sağlanırsa, desenler in vitro oluşturabilir ^{5 , 6}. hücrelerin içsel yeteneğini ortaya çıkarmak için bir yolu kendi kendine-vitro düzenlemek için hücreleri oluşturmak için zorlamak için gruplar/koloniler tanımlanan şekiller ve boyutlar^7,8,9,10 . Bunun sağlayan bir tekniği micropatterning¹¹. Micropatterning, hücre içi matrisin (ECM) moleküllerinin bir yüzeye yatırılan konumunu tam olarak tanımlamanızı mümkün kılar. Bu, sırayla hücrelerin nasıl uyabileceği ve bu nedenle hücrelerin nasıl dağınık şekilde düzenlendiği kontrol eder.

Micropatterning çok sayıda uygulama ile bir tekniktir, örneğin, micropatterning farklılaşma öncesinde ilk koşulların standardizasyonu sağlar¹². Önemlisi, micropatterning kolayca boyutu, şekil ve hücre kolonilerinin aralığını kontrol etmek mümkün kılar ve bu özellik, morphogen veya fiziksel ipuçları için hücrelerin toplu yanıt sorgulamayı amaçlayan deneyler hazırlamak için kullanılabilir^{7 , 8 , 10} ‘ dan fazla ^{, 13} ‘ ü ^{, 14 , 15 , 16 , 17 yaşında}.

Çeşitli micropatterning yöntemleri geliştirilmiştir¹¹. Photopatterning teknikleri belki¹⁸kurmak için en kolay yöntemlerdir. Tek hücrelerin şeklini kontrol etmek için kullanılabilir gibi bu yaklaşımlar da hassasiyet avantajı var^18,19,20. Ancak, onlar da dahil olmak üzere pahalı özel ekipman gerektirir bir spin coater, bir plazma odası ve bir UVO (UV-ozon) temizleyici hangi genellikle kolay standart biyoloji laboratuvarlarında mevcut değildir. Tekniğin kabulü kolaylaştırmak için, biz sadece UVO lamba gerektirmek için protokol adapte. Biz makas veya istenilen biçime bir delik Punch ile kesilebilir ticari olarak kullanılabilir plastik slaytlar başlar.

Mikrokalıplarının önemli bir yardımcı programı, kolonileri bireysel kolonileri birden fazla çoğaltır arasında karşılaştırmak için standartlaştırmak etme yeteneğidir. Bu, bu kolonilerin içinde hangi ölçüde desen oluşumunun yeniden üretilebilirliğini sormayı ve Pattern sürecinin sağlamlığını etkileyen faktörleri keşfetmeyi mümkün kılar. Daha da önemlisi, birden fazla standartlaştırılmış koloniler arasında “Ortalama” kalıplarının ölçülmesi, aksi takdirde belirgin olmayacaktır desen süreçleri ortaya çıkarabilir. Standardize koloniler üzerinde desen ölçmek mümkün olmanın avantajı doğru tek hücre düzeyinde, ideal protein ifadesi ölçmek mümkün olmaya bağlıdır. Ancak, mikrodesenler üzerinde hücreler genellikle sıkıca paketlenmiş, yüksek doğruluk ile segment zor hale. Hücreler genellikle üç yerine iki boyut kendilerini organize ve algılamak ve segmentasyon sırasında üç boyutlu (3B) bilgileri korumak için zor olabilir. Hücreler başarıyla bölümlere ayrıldıktan sonra, sonuç veri kümelerinden desen bilgilerini ayıklamak için Hesaplamalı Yöntemler gereklidir.

Bu sorunların üstesinden gelmelerine yardımcı olmak için segmentasyon ve görüntü analiz araçları geliştirdik. Bu analiz yöntemi yalnızca ücretsiz ve açık kaynaklı yazılım kullanır ve komut satırı veya programlama bilgisini uygulamak için gerektirmez. Burada yöntemi göstermek için, biz fare embriyonik kök kullanın (mES) kendiliğinden erken farklılaşma brachyury bir marker ifade hücreleri (tbra)^21,22. Hiçbir belirgin uzamsal düzenleme görsel olarak algılanabilir iken, yöntem kolonilerde T + hücrelerin Tercihli konumlandırma bir harita oluşturulması sağlar. Ayrıca bu tbra deseni, Idon, kemik morfogenetik protein (BMP) yolu²³doğrudan bir okuma ifade hücrelerin tercihli bir lokalizasyonu yokluğunda kontrastlar gösterir. Ayrıca, yöntemin geçerli sınırlamalarını ve bu tekniğin diğer deneysel sistemlere nasıl adapte edilebilir olduğunu da tartışıyoruz.

Protocol

Not: yöntem genel bakış Şekil 1‘ de sağlanır.

1. maske tasarımı

1. Photomask, Azioune ve al.¹⁸‘ de açıklanan yönergelere göre tasarlayın. Bu çalışmada kullanılan yazılım ve maske üreticisine başvuru için malzeme tablosuna bakın.
   Not: birden çok geometriler, Boyutlar veya şekiller arasındaki boşluk bir maske üzerinde oluşturulabilir. UV lambası, 49 adede kadar farklı tasarıma (2 cm x 2 cm yongaları) sahip olabilecek 15 cm ‘lik bir photomask sığabilir.

2. mikrodesen üretim prosedürü

1. Gerekli materyalleri hazırlayın.
   1. Fosfat tamponlu tuzlu (PBS) içinde% 0,1 Poloksamer 407 (10 ml için 10 mg) bir çözüm hazırlayın ve oda sıcaklığında bir shaker bırakın. Poloksamer 407 çözülür yaklaşık 20 dakika sürer.
   2. Bir 10 cm kare Petri tabak altında laboratuar filmi ( malzeme tablosunabakın) Lay. Bu matris biriktirme için oda olarak kullanılacaktır.
   3. Photomask yüzeyini temizleyin, ilk 100% aseton ile, sonra 100% izopropanol ve sonunda DDH₂O ile. Mümkünse, hava fotomask kuru veya başka temiz kağıt havlu ile maske kuru.
   4. Fotomask ile aynı boyutta bir kare, sert ve opak bir plastik parçası hazırlayın (daha sonra ‘ Holder ‘ olarak adlandırılır).
      Not: Bu aydınlatma adım sırasında fotomask ile temas plastik coverflar korumak için kullanılır.
   5. UVO lambası açın ve 10 dakika ısınma aydınlatması çalıştırın.
2. Photopatterned cips oluşturun.
   Not: istenen boyutta fiş oluşturmak için yordamı adapte etmek mümkündür. Basitlik için, burada 12 mm yuvarlak mikrodesenli çip oluşturmak için prosedür açıklanmaktadır.
   1. 12 mm ‘lik delik yumruk kullanarak, 12 mm yuvarlak kapak oluşturmak ve onları temiz yeni bir petri tabağı içine yerleştirmek için hidrofobik plastik slaytlar kesti.
      DIKKAT: Bu yüzey işleme zarar verebilir gibi plastik yüzeyi ile cilt teması önlemek için her zaman eldiven kullanın.
   2. Dikkatle cımbız ile Cover, koruyucu film çıkarın.
      Not: Bu tohumlama prosedürü sırasında çip üzerindeki hücrelerin yerleşimi etkileyebilir gibi plastik yüzey zarar kaçının (Bölüm 3).
   3. Photomask ‘ı temiz ve istikrarlı bir yüzeye (örn. photomask kutusu), krom tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve istenilen çip tasarımının konumuna 2 μL damla ddH₂O ekleyin.
   4. DDH₂O damlası üzerine bir lamel magazini Lay ve hafifçe basın.
      Not: photomask yüzleri plastik yan önceki adımda kaldırıldı film tarafından korunan yan olduğundan emin olun.
   5. Tutucu plastik slaytların üstüne yerleştirin ve fotomask ile temas plastik parçaları korumak için dikkatle kelepçeler ile bu sandviç düzeltin.
      Not: plastik slaytların fotomask yüzeyi ile temas halinde mükemmel bir şekilde korunduğundan emin olmak için, kelepçeleri mümkün olduğunca yakın bir şekilde plastik kaydırakların konumuna yerleştirin.
   6. Montajı, ışık kaynağından yaklaşık 2 cm olan UVO lambaya yerleştirin ve 10 dakika aydınlatın.
      Not: ışığın gücü, yongası kaynaktan 2 cm mesafeye yerleştirildiğinde 254 nm dalga boyunda 6 mW/cm² olarak tahmin edilmektedir.
   7. Alt fotomask ile sandviç tutun ve sandviç Demontaj sırasında hareket eden slaytlar önlemek için bir elle basınç koruyarak dikkatli bir şekilde kelepçeleri kaldırmak. Tutucuyu çıkarın, tüm plastik parçaların hala maske üzerinde olduğundan ve tutucuya takıldığından emin olma.
   8. Fiş üzerine ddH₂O ekleyin ve hafifçe fotomask gelen yongaları ayırın.
      Not: plastik çip fotomask için sıkışmış ise, çip birden biraz üzerinde Chip ayırmak durumunda çip hafifçe üzerinde tutarken çip itmek için bir plastik pipet ucu kullanarak çip ayırın.
   9. Son olarak, photopatterned yongaları matris biriktirme odası içine yerleştirin.
      Not: çipin aydınlatmalı tarafındaki yukarı dönük olduğundan emin olun.
3. Matrisini yatırın.
   Not: Bu bölümdeki tüm prosedür bir doku kültürü kaputu içinde yapılmalıdır.
   1. Poloksamer 407 çözümünü 0,22 μm politersülfon (pes) filtresine göre filtreleyin.
   2. ECM kaplama çözümünü 500 μg/ml steril filtreli Poloksamer 407 ve 1 mg/ml jelatin karıştırarak hazırlayın.
      Not: diğer olası ECM molekülleri ile ilgili ek bilgi için Tablo 1 ‘ i de görün.
   3. Her ışıklı çipin üzerine kaplama çözeltisi 200 μL ekleyin. Laboratuar filmi, çipin dışına düşmesini önler.
   4. Evaporasyonu sınırlamak ve bir gecede 4 °C ‘ de yongası ile yerleştirmek için ddH₂O ile dolu 3 cm Petri tabağı ekleyin.

3. tohumlama prosedürü

Not: aşağıda açıklanan adımlar, standart mESC orta kullanarak CGR8 fare embriyonik kök hücreleri (mESC)²⁴ için optimize edilmiştir (Ayrıca bkz: malzeme tablosu). Ancak, herhangi bir hücre türü için prosedürü uyarlamak prensip olarak mümkündür. Ayrıca, fare embriyonik kök hücrelerinin geleneksel hücre kültürü burada açıklanan değil, kapsamlı belgeler başka bir yerde²⁵bulunabilir olduğunu unutmayın.

1. Kaplama çözeltisi aspirate ve steril PBS ile en az 5 dakika boyunca iki kez yongaları inküye.
2. Bu arada, sıcak ortamda 5,5 x 10⁵ hücreler/ml hücre süspansiyon hazırlayın.
3. Pipet 200 her çipte hücre süspansiyon μL (~ 100.000 hücreler/cm²).
4. Tohumlama odasını kapatın ve hücrelerden 1 saat boyunca kuluçkalıcıya uymasını bırakın.
5. 1 saat sonra, 500 μL/Well sıcak orta ile bir multiwell plaka (4-kuyu veya 24-kuyu plaka) kuyuları doldurun ve steril cımbız ile plaka içine yongaları aktarmak.
6. Yapışkan olmayan hücreleri ayırmak için plakayı şiddetle sallayın. Orta aspirate ve hemen taze sıcak orta ile değiştirin. Desen görünür olup olmadığını görmek için mikroskop altında kontrol edin (Şekil 2a).
   Not: yapıştırma süresi, mESC veya diğer matris proteinleri dışında hücre çizgileri kullanıldığında optimize edilmesi gerekebilir (Ayrıca bkz. Tablo 2).
7. Desenler Şekil 2a‘da gösterildiği gibi açıkça görünür hale gelene kadar bu adımı yineleyin.
   Not: Bu adım önemlidir ve yordamın başarısını belirler. Çok yoğun bir yıkama prosedürü hücreleri ayırmak olabilir, aksine yetersiz yıkama kalıpları arasında bağlı kalan hücreler neden olabilir (Şekil 2C, d).

4. sabitleme

Not: kültür 48 h sonra hücreler titizlikle desenler şeklini takip yoğun koloniler oluşturmalıdır ( Şekil 2B‘de gösterildiği gibi).

1. Plakadan fiş bırakarak, kaldırma ~ 90% orta, sadece yeterli orta kurutma yongaları önlemek için bırakarak.
   Not: çip hiçbir zaman boya eserler önlemek ve yüzey hücre dekolmanı önlemek için kurutmak önemlidir. Yapışkan desenler arasında çip yüzeyinin hidrophobicity nedeniyle, çip de-Wet bir eğilimi olabilir. Bu aşamada, fikfatif büyük kubbeli kolonilerin çipten ayırmasına neden olabilir. Yıkanabilir çok nazik olmalıdır, ideal pipetleme sıvı tarafından kuyu tarafında ve doğrudan çip üzerine yapılır.
2. İyi başına en az 500 μL civarında formaldehite (PFA) bazlı sabitleme çözeltisi ekleyin ve 10 dakika boyunca inküye yapın.
   Not: koloniler özellikle kalın görünüyorsa (5 ‘ ten fazla hücre katmanı), sabitleme süresini 20 dakikaya ayarlamak gerekli olabilir.
3. Sabitleme işleminden sonra, yıkama çözeltisi ile 3 kez yıkayın (0,01% Poloksamer 407 ile PBS). 50 mm NH₄CL kullanarak ekstra yıkama yıkama çözeltisi içinde seyreltilmiş, kalıntı PFA çapraz bağlama aktivitesini gidermek için Intercalated olabilir.
4. Numuneleri engelleme çözümünde en az 30 dakika boyunca kulbe etme.
   Not: Bu aşamada örnekler, boyama işleminden yaklaşık bir hafta önce 4 °C ‘ de depolanabilir. Eğer öyleyse, buharlaşma önlemek için laboratuar filmi ile plaka mühür.

5. immünostakajlı

1. 10 cm kare Petri tabak altında laboratuvar film bir levha yerleştirerek bir boyama odası hazırlayın.
2. Antikor çözümlerini hazırlayın (Bu yazıda kullanılan antikorlar ve seyreltme listesi için Tablo 3 ‘ a bakın).
3. Çipi boyama odasına yerleştirin ve hücreleri yukarı dönük olarak destekler ve hemen 100 μL birincil antikor çözeltisi yongasına ekleyin.
   DIKKAT: Bu aşamada, cips adım 4,1 olarak kolayca de-Wet olmamalıdır. Ancak, cips kuru değil önemli olduğu için bakım hala alınmalıdır. Birden çok fiş işlenmek zorunda ise, adım 5,3 her çip için sıralı olarak uygulayın.
4. Oda sıcaklığında dönen bir platformda 1 saat boyunca inküye yapın.
   Not: hücreler büyük 3B yapıları oluşturdular, numunenin Tekdüzen boyama için izin vermek için daha uzun bir kuluçak süresi gerekebilir. İnkübasyon süresi 24 saate kadar artırılabilir. Ancak, boyama odası su ile dolu 3 cm çanak içermelidir ve boyama odası buharlaşma önlemek için laboratuar filmi ile mühürlü olmalıdır.
5. Çipleri taze bir multiwell plakasına aktarın ve yıkama çözeltisi ile 3 kez yıkayın.
6. Adım 5,3 ve 5,4 olarak açıklandığı gibi ikincil antikorlar ile inkübasyon gerçekleştirin.
7. Herhangi bir standart montaj ortamını (örn. Mowiol) 20 μL kullanarak bir mikroskobik slaytta çip bağlayın.

6. görüntüleme

Not: görüntüleme, standart bir Konfokal mikroskop üzerinde gerçekleştirilebilir. Burada sadece sonraki Nicel analiz için yeterli olacak bir görüntü kalitesi sağlamak için öneriler sunuyoruz.

DIKKAT: herhangi bir operatör önyargı önlemek Için, görüntü için koloniler sadece nükleer zarf sinyali kullanılarak seçilmelidir (bir koloni düzgün desen şeklini takip olup olmadığını görmek için). Mikroskop ayarlarını ayarlarken dışında ilgi işaretçileri sinyalini kontrol kaçının.

1. Edinme biti derinliğinin 12 veya 16 bit olduğundan emin olun.
2. Her görüntü kanalı için dinamik aralığı maksimize etmek için uygun ayarları tanımlayın. Özellikle, görüntü kırpma kaçının.
3. Mikrodesen otofloresans görüntüye bir kanal ekleyin (bkz. Şekil 3).
4. X ve y eksenlerinde 0,1 ile 0,6 μm arasında değişen ve z ekseninde 0,2 ile 2 μm arasında değişen Voksel boyutları elde etmek için görüntü boyutunu ve yakınlaştırma faktörünü ayarlayın.
   Not: Örneğin, bu çalışmada, 40 x objektif (1,3 eşittir sayısal diyafram), dijital zoom olmadan 1024 x 1024 piksel görüntü boyutu ve 0,5 μm z-Step boyutu ile ters tarama Konfokal mikroskop kullandık. Bu da 0,38 μm x 0,38 μm x 0,5 μm ‘ lık bir Voksel boyutuyla sonuçlandı.
5. Her kolonide, tüm koloninin elde edilmesini sağlamak için z ekseni boyunca minimum ve maksimum konumu tanımlayın. En az bir uçak, hiçbir sinyal düşük ile koloninin altına ve altına dahil edilmelidir.
6. Z-yığını oryantasyonlardan tutarlı bir şekilde elde edilmesini sağlayın (her zaman üstten alta veya her zaman alt üste)
7. Görüntü kalitesi ve görüntüleme süresi arasında optimum belirlemek için tarama hızını, görüntü çözünürlüğünü, çerçeve ortalamasını ve dedektör kazançlarını ayarlayın. Bir belirti olarak, Şekil 3 ‘ te gösterildiği gibi bir koloni için görüntüleme süresi yaklaşık 2 – 3 dk. görüntü edinme gerçekleştirin.
   DIKKAT: karşılaştırılabilir olması için tüm görüntüler, aynı objektif ve edinme ayarları ile aynı mikroskop üzerinde elde edilmelidir.
8. Alım sonunda, tüm görüntüleri kaydedin ve her görüntünün temsil ettiği deneysel koşulu tanımlamak için benzersiz bir adlandırma kuralı atayın.
   Not: bkz. Şekil 4 örnek olarak, bu kural daha sonra çözümleme yordamı sırasında kullanılacaktır. Görüntülerin BioFormats ²⁶tarafından desteklenen herhangi bir biçime kaydedilebilir unutmayın. Koloniler görüş alanından daha büyükse, ımagej ‘nin dikiş eklentisi²⁷kullanılabilir. Ayrıca dikiş durumunda, aydınlatma roll off düzeltme gerekli olabilir unutmayın.

7. görüntü analizi

Not: Bu yordam için önerilen bilgisayar belirtimleri: 16 GB RAM, çok çekirdekli 3,33 GHz CPU ve en az 50 GB disk alanı (veya daha fazla görüntülenmiş yongaları sayısına bağlı olarak). Yazılım Linux, Windows ve MacOS üzerinde test edilmiştir. PickCells karmaşık çok boyutlu görüntülerde hücrelerin kolektif organizasyonun analizine adanmış bir grafik kullanıcı arayüzü ile bir çapraz platform görüntü analizi uygulamasıdır (Blin ve al, hazırlık). Burada bahsedilen belirli modüller için PickCells hakkında daha fazla bilgi yanı sıra belgeleri çevrimiçi bulunabilir unutmayın: https://pickcellslab.frama.io/docs/. Biz yazılımı geliştirmeye devam gibi arayüz değişebilir de unutmayın. Arayüz şekil veya videoda gösterilenden farklıysa, lütfen çevrimiçi el kitabına bakın.

1. Yükleyin ve çevrimiçi kullanılabilir belgeleri izleyerek PickCells çalıştırın.
2. Görüntüleri içe aktarın ve sağlanan bilgilerin doğruluğunu doğrulayın (Şekil 4-1).
3. Her kanalın adını belgeleyin.
4. Bölüm çekirdekleri Nessys modülünü kullanarak nükleer zarf sinyaline dayanan²⁸ (Şekil 4-2) ve oluşturulan segmentli görüntüleri adlandırmak için kullanılacak bir önek (örneğin “çekirdekler”) sağlar.
   Not: kullanım ve parametre ayarlamaları hakkında belgeler https://framagit.org/pickcellslab/nessys adresinde bulunabilir.
5. Segmentasyon Editor modülünü kullanarak, gerekirse segmentleri inceleyin ve düzenleyin (Şekil 4-3)
   Not: herhangi bir nedenle segmentasyon işlemi tatmin edici sonuçlar sağlamamadı, el ile veritabanı klasöründeki görüntüleri silin ve ayrıca MetaModel görünümünde ‘ segmentasyon sonucu ‘ düğümünü silin. Ardından, adım 7,4 ve 7,5 yineleyin. Görüntülerin sadece küçük bir alt kümesini segmentasyon tatmin edici sonuçlar sağlamaz ise, o zaman Nessys standalone uygulama kullanın (7,4 bağlantı bakın), ‘ hatalı görüntüler ‘ segment girişimi ve veritabanı klasöründe ilgili dosyayı değiştirmek).
6. Temel segmentasyon modülünü kullanarak desen otofloresans sinyalini segmentlere ayırma (Şekil 4-4)
   1. Oluşturulan bölümlenmiş görüntüleri adlandırmak için kullanılacak bir önek (örneğin “desen”) sağlayın.
   2. Otofloresans sinyalini içeren kanalı seçin.
   3. Gürültü azaltma Uygula; genellikle 10 x 10 x 0,5 voxels çekirdek boyutu ile bir Gauss filtresi kullanarak tatmin edici sonuçlar verir.
   4. Ön plan beyaz göründüğünde arka planda mavi renkte görünecek şekilde alt eşik değerini ayarlayın. Yüksek yoğunlukları nihai sonucu (kırmızı alanlar) hariç tutulması önlemek için de üst eşik maksimum değerine ayarlayın.
   5. Son adım için Atla ‘yı seçin.
   6. Son ‘u tıklatın ve tüm görüntüler işlenene kadar bekleyin.
7. Çekirdekler gelince, segmentasyon sonuçları artık görsel olarak incelenebilir ve gerekirse segmentasyon düzenleyici modülünü kullanarak düzeltilmiş (Şekil 4-5).
8. Çekirdekler nesneleri oluşturun ve temel nesne özelliklerini hesaplar.
   1. Ana arabirimin solundaki görev çubuğundan içsel Özellikler modülünü başlatın (Şekil 4-6).
   2. Yalnızca temel özellikler panelini açık tutmak Için ellipsoid Fitter ve Surface Extractor panelleri ‘ni kapatın.
   3. Nucleus nesne türü olarak seçin ve “segmentlenmiş görüntüler” için 7,4 adımda verilen öneki seçin.
   4. COMPUTE tuşuna basın ve tüm görüntüleri işlenene kadar bekleyin.
      Not: Bu adımdan sonra, çekirdekler segmentleri yeniden düzenlemek mümkün olmayacaktır.
9. Desen nesneleri oluşturun ve temel nesne özelliklerini hesaplar. 7.8.4 için 7.8.1 adımları yineleyin, yalnızca bu kez özel türü olarak nesne türü ve bölümlenmiş görüntüleriçin adım 7.6.1 verilen öneki seçin.
   Not: Bu adımın ardından, desen segmentini yeniden düzenlemek mümkün olmayacaktır.
10. Her çekirdeğin bir kernel niteliği olarak ait olduğu görüntünün adını saklayın.
    1. Tıklayın veri ≫ yeni nitelik ve seçin Nucleus Popup Iletişim kutusunda ve tıklayın ok.
    2. Düğüme bağlı diğer nesnelerden veri topla ‘yı seçin ve İleri‘yi tıklatın.
    3. Sol bölmede, resim ‘i seçin ve sonra yol tanımı panelinde bitiş bayrağı altındaki sorgu işaretini çift tıklatarak görüntü düğümünü yolun hedefi olarak ayarlayın.
    4. Sol paneldeki kullanılabilir öznitelikler bölmesini genişletin ve ad özniteliğini seçin.
    5. Azaltma işlemi bölmesini genişletin ve bir al‘ı seçin, ardından Değiştir düğmesine tıklayın ve İleri‘ye tıklayın.
    6. “Resim adı” yazın, sekme tuşuna basın ve Tamam‘ı tıklatın.
11. Çekirdekler nesnelerinde bir “normalleştirilmiş koordinat” niteliği oluşturun (Şekil 4-7).
    1. Desen centroid koordinatları bir Nucleus özniteliği olarak depolamak için 7.10.6 için 7.10.1 adımları uyarlayın. Bu yeni öznitelik “desen koordinatı” adı.
    2. Ardından, veri ≫ yeni öznitelik‘ i tıklatın, Nucleus seçin ve Tamam‘ ı tıklatın.
    3. Düğümün uzamsal veya yönlü vektörler arasında bir Işlev tanımla ‘yı seçin ve İleri‘yi tıklatın.
    4. Işlev türü Için dizi Işlemiseçin, v1 için Madde vektörü ve ardından centroidseçin ve v2 için Madde vektörü seçin ve sonra desen koordinasyonue.
    5. İleri‘yi tıklatın, ad alanına “normalleştirilmiş koordinat” yazın ve son‘u tıklatın.
12. Verileri bir sekmeyle ayrılmış değer dosyasına dışa aktarın.

8. R Analizi

1. Rstudio ‘Yu indirin ve yükleyin.
   Not: yazılım bilgileri ve indirme bağlantıları https://www.rstudio.com/adresinde mevcuttur.
2. Bu analiz için gereken R komut dosyalarını indirin.
   Not: komut dosyaları GitLab deposundan indirilebilir: https://framagit.org/pickcellslab/hexmapr.
3. Rstudio ‘Yu açın.
   Not: komut dosyalarını ilk kez çalıştırıyorsanız, gerekli R paketlerini (ggplot2 ve ölçekler) yükleyin.
4. Rstudio ‘dan binnedmap_template açın. R Script.
5. Çalışma dizinini kaynak dosya konumuna ayarlayın.
6. Şekil 5‘ te gösterildiği gibi uzamsal eşlemeleri elde etmek için belirli bir veri kümesine komut dosyası uyarlamak için komut dosyasında sağlanan yönergeleri izleyin.
7. Yoğunluk eşlemeleri oluşturmak için komut dosyasını çalıştırın.

Representative Results

Discussion

Burada hücrelerin kültürlerinde acil desenlemeyi analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Basitleştirilmiş bir mikrodesen yaklaşımı, hücre kolonilerinin şeklini ve boyutunu standardizmek için kullanılır ve bu kolonilerde desenlerin algılanmasını ve ölçülmesini sağlayan görüntü analiz araçları ve R scriptleri sunuyoruz.

Önerdiği boru hattı, yazarları kültür koşullarına odaklanarak, ticari olarak kullanılabilen mikrodesenleri kullanarak, ESC kolonilerinde yeniden üretilebilen germ katmanı oluşumu elde etmek için önceden yayımlanan bir yöntem³¹ ‘ e benzer. in vitro erken gastrülasyon olayların çalışması. Amacımız, hücrelerin kolektif organizasyonunun sadece istatistiksel analizden sonra belirgin hale gelmesine neden olan model oluşumunun keşfi için genelleştirilebilir bir boru hattı sağlamaya odaklanmıştır. Bu nedenle, çoklu koloniler üzerinde 3D alanda nükleer pozisyonun doğru tanımlanması ve analizini sağlayan sağlam bir görüntü analizi iş akışı sağlıyoruz (Ayrıca bkz. tartışma). Biz de topluluk için yararlı olacağını umuyoruz uzun vadede ticari çözümler için daha esnek ve ucuz bir alternatif sunan basit bir ev mikrodesen yaklaşımı geliştirmeye karar verdik.

Son olarak, bu makalenin revizyonu sırasında, R betiklerine benzer desen analizi için yeni bir paket³²serbest bırakıldı. Bu yeni paket, yüksek verimlilik görüntüleme platformlarından elde edilebilir giriş olarak hücre özelliklerinin tablolarını kabul eder. Biz bu olasılığı kendimizi test değil olsa da bu yeni pakete bir giriş olarak ilke olabilir bizim protokolün 7 adımda oluşturulan çekirdekler özellikleri tablo inanıyoruz.

Yöntemin diğer hücre türlerine ve koloniye geometrilerine adaptability

Biz serum varlığında pluripotent hücrelerin kültürlerinde Mezodermal transkripsiyon faktörlerinin ortaya çıkması eğitim bağlamında bu yaklaşımı sunuyoruz. Ancak bu yöntem ECM/poloxamer 407 konsantrasyonlarını optimize etmek için gerekli olabilir, ancak diğer hücre türlerine ve serum içermeyen kültürlere kolayca uyarlanabilir (test konsantrasyonları için Tablo 1 ve bir sorun giderme kılavuzu için Tablo 2 ‘ ye bakın). Yöntem ayrıca, daha büyük veya daha küçük boyutlarda mikrodesenler ve Kullanıcı ihtiyaçlarına göre şekiller geniş bir yelpazede adapte edilebilir. Ancak, yöntemi oluştururken, tüm şekil/hücre türü kombinasyonları en iyi olduğunu farkında olmak önemlidir. Örneğin, mesc Express yüksek seviyeleri E-cadherin^33,34 bu hücrelerin ECM yoksun alanları kapsayan kolektif yapıları oluşturmak için etkinleştirme. Bu hücreler kesinlikle keskin açılarla geometrileri takip etmez veya desen küçük delikler içerir. Örneğin dikkat edin, Şekil 3B‘de, hücreler merkezi alanı kolonizasyon sürecinde. Bizim elimizde küçük bir merkezi alan mESC halka şekilli koloniler oluşturmak için zorlamaz. Bu nedenle, test etmek ve en uygun boyutları ve seçim hücre türü için uygun olacak eğrilik belirlemek muktedir fotomask tasarlarken geometrilerin bir çeşitlilik dahil etmek için tavsiye edilir.

Dikkate almak için bir diğer önemli faktör, deneme uzunluğu ve hücrelerin proliferasyon oranı. Bazı hızla Proliferasyona hücre türleri için (pluripotent hücreleri dahil) Bu birçok gün içinde mikrodesenler üzerinde hücreleri korumak için zor olabilir (mesc için üç gün maksimum). Ayrıca, mikrodesenler üzerinde hücrelerin tohumlama her zaman optimum her koloni için oluşmaz, bu yüzden yedek olması için kolonilerin aşırı tohum tavsiye edilir.

Avantaj ve desen algılama yönteminin sınırlamaları

Yöntemin belirli bir avantajı, birden fazla çoğaltma kolonilerinden gelen görüntü analizi sonuçlarını birleştirerek “ortalamayı” çoğaltmayı algılama yeteneğidir (Şekil 5). Bu, bireysel kolonilerin kontrollerinden belirgin olmayan desen olaylarını ortaya çıkarabilir. Bu ‘ ortalama ‘ yaklaşımının bir dezavantajı, örneğin küçük noktalar veya dar çizgiler için tekrarlayan kalıpların belirli türlerini kaçırmasıdır. Ancak, bu tür desen yerine dikkatle seçilmiş desen boyutları⁸kombinasyonu ile ortaya çıkabilir. Ayrıca, burada açıklanan görüntü analizi ardışık düzen kolonik değişkenlik seviyesini araştırmak için imkanı sunan hem tek hücreli hem de koloni çözünürlükte nicel veriler sağlar (Şekil 5) veya birden fazla komşu analizi gerçekleştirmek için ölçekler¹⁰.

Ortalama yöntemin bir diğer önemli avantajı da algılama kanalları mevcut fluorophores ile sınırlı kalmadan birçok işaretçileri tercihli konumu harita fırsatı sunuyor olmasıdır. Nitekim, biz burada sunulan çalışmalar farklılaşma sadece iki belirteçleri kullanmak rağmen, yeteneği koloniler standartlaştırmak ve özü “Ortalama” desenler mümkün kolonilerin farklı setleri dağıtım haritaları birlikte sırayla karşılaştırmak için yapar birbirine işaretçilerin Genelleştirilmiş uzamsal ilişkilerini ortaya çıkarmak için.

Ayrıca, burada bizim odak farklılaşma işaretçileri çalışma olmuştur rağmen, analiz yöntemi nükleer işaretçileri mevcut diğer biyolojik süreçleri incelemek için uzatılabilir. Örneğin, bir floresans mayası hücre döngüsü göstergesi³⁵ (fuccı) içeren bir hücre satırının micropatterning nasıl koloni düzeyi geometrisi gruptaki hücre döngüsü olaylarını etkileyebilecek çalışma mümkün kılar.

Gelecekteki talimatlar

Yöntem orta verimlilik görüntü analizine imkan sağlar, ancak görüntü edinme Şu anda tam olarak otomatik değildir ve çok büyük deneyler için sınırlayıcı hale gelebilir. Kolonilerin düzenli düzenlemeleri mümkün olan tek hücreli ortalama²⁰için geliştirilen ne benzer tam otomatize edinme rutinleri oluşturmak için yapmak gerekir. Ancak, bir koloni görüntü için gerekli alan boyutu büyük olasılıkla, mozaikleme gerektirdiğinden ve kolonilerin üç boyutlu olduğu için, sadece ilgili koloniler görüntüleme tarafından hem veri kümesi boyutunu ve edinme süresini azaltmak için son derece arzu edilir. Bu nedenle, gelecekteki çabaları ilgili kolonileri tanımlamak ve her örnek için görüntüleme koordinatları uyum mümkün bir ‘ akıllı ‘ mikroskop geliştirmek için adanmış olabilir. Bu sadece zaman ve çaba azaltmak değil, aynı zamanda potansiyel operatör önyargıları önlemek.

Çözümleme ardışık düzenlerini de Kullanıcı almak gereken adımlar sayısını azaltarak daha verimli hale gelebilir. Biz planları bir boru hattı oluşturma mekanizması oluşturmak ve R doğrudan bizim yazılım entegre etmek için (Ayrıca sorunları pickcells-API # 3 ve pickcells-rjava # 1 bizim kod depoları [https://framagit.org/groups/pickcellslab/-/issues] sorun izci bakın). Analiz prosedürün tam otomasyonu zaman ve çaba azaltacak ve olası kullanıcı hatalarını kısıtlayacaktır.

Son olarak, analiz yöntemimizin hücresel deseninin dinamik yapısını henüz tam olarak yakalayamamaktadır. Bazı sınırlı dinamik bilgiler anlık görüntü görüntüleri^8,10,36bir zaman serisi inceleyerek ayıklanabilir. Ancak, biz daha iyi desen nasıl ortaya anlamak istiyorsanız hücre nüfus geçmişini kaydetmek mümkün olmak çok arzu edilir. Bir sınırlama, 3B yoğun hücre popülasyonunda bireysel hücrelerin doğru izlenmesi çok zorlu bir görev³⁷kalır. Bizim hücre algılama yöntemi nükleer zarf kullanır ve özellikle iyi yoğun ve çakışan hücre nüfusu²⁸gerçekleştirir. Nükleer zarfın canlı gazetecileri^28,38 ve micropatterning tekniğinin bir avantajı kolayca mevcut uzun süreli görüntüleme sırasında görüş alanı dışında hareket hücreleri önlemek için kullanılabilir olmasıdır. Genel olarak, hücrelerin otomatik izleme yakın zamanda kurulan araçların bir kombinasyonu kullanılarak ulaşılabilir olacak eminiz^28,39,40 ve bu temel içine yeni Öngörüler getirmelidir kendi kendini organizasyon ilkeleri.

Materials

2-mercaptoethanol	Gibco	31350-010	handle in fume hood
1× Master quartz anti-reflective chromium photomask	Toppan Photomask	Custom design
24-well plates	Corning	3526
4-well plates	Nunclon Delta	176740
5% Donkey Serum	Sigma	D9663
Anti Nuclear pore complex	Abcam	ab24609	Mouse monoclonal, use 1:1000
Anti-Id1	Biocheck	37-2	Rabbit polyclonal, use 1:200
Anti-Lamin B1	Abcam	ab16048	Rabbit polyclonal, use 1:1000
Anti-Tbra	R&D	AF2085	Goat ployclonal, use 1:400
Blocking Solution	NA	NA	0.1% TritonX-100<br/> 0.01% Pluronic F-127<br/> 5% Donkey Serum<br/> 0.003% Sodium Azide<br/> In PBS
CGR8 mESC	NA	NA	Reference: Mountford et al. PNAS, 1994
Fixation solution	NA	NA	4% PFA diluted in washing solution
Foetal bovine serum	Gibco	10270-106	Serum batches must be tested to ensure compatibility with ESC maintenance
Gelatin	Sigma	G1890
Glasgow Minimum Essential Medium	Sigma	G5154
Laboratory Film	VWR	291-1212
Layout Editor Software	LayoutEditor	NA	https://layouteditor.com/
Layout Editor Software	Klayout	NA	https://www.klayout.de/
L-glutamine	Gibco	25030-024
LIF	Millipore	ESG1107
MEM NEAA	Gibco	11140-035
mESC Culture medium	NA	NA	GMEM<br/> 10% FCS<br/> 100 U/ml LIF<br/> 100 nM 2-mercaptoethanol<br/> 1&times; non-essential amino acids,<br/> 2 mM L- glutamine<br/> 1 mM sodium pyruvate
NH4Cl 50mM	Sigma	9718
Paraformaldehyde	Sigma	158127	CAUTION: Toxic, handle undiluted stocks in fume hood and wear protective equipment
PBS (immunostaining)	Sigma	P4417	Dilute in 200ml of ddH<sub>2</sub>O
PBS (tissue culture)	Gibco	11140-035
Plastic slides	Ibidi	IB-10813
Poloxamer 407	Sigma	P2443
ProLong Gold Antifade Mountant	Molecular Probes	P36930
Sodium Azide	Sigma	8591	CAUTION: Toxic, handle in fume hood and wear protective equipment
Sodium pyruvate	Gibco	11360070
TritonX-100	Sigma	T8532
Trypsin	Gibco	25200056
UVO cleaner	Jetlight, USA	42-220	CAUTION: Follow manufacturer&rsquo;s safety recommendations
Washing Solution	NA	NA	0.1% TritonX-100<br/> 0.01% Pluronic F-127<br/> In PBS