Method Article

CRISPR Plazmidlerinin Yapımı ve Çift Luciferase Muhabir Sistemi Ile Memeli Hücrelerinde Nakavt Etkinliğinin Saptanması

DOI:

10.3791/59639

⸱

December 5th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Qingdao Agricultural University, Qingdao, China, 2University of Cantabria, Santander y Torrelavega, Spain

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, hem CRISPR enzimini hem de ilişkili tek kılavuz RNA'ları (sgRNA) ifade eden verimli plazmid üretimi için aerodinamik bir yöntemi açıklayan bir protokol salıyoruz. Memeli hücrelerinin bu sgRNA/CRISPR vektörü ve çift iplikli break onarımını inceleyen çift luciferase muhabiri vektörü ile birlikte transfeksiyonu nakavt etkinliğinin değerlendirilmesini sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek verimli olmasına rağmen, crispr enzimi ile genomik bir alanın değiştirilmesi, önceden hedef bölgeye özgü bir sgRNA(lar) oluşturmayı gerektirir. Bu çalışma, DNA dizilimi öncesinde PCR tarafından pozitif kolonilerin etkin bir şekilde algılanmasını sağlayan bir strateji kullanarak verimli sgRNA vektörlerinin inşasına giden önemli adımları açıklamaktadır. CRISPR sistemi kullanılarak verimli genom düzenleme sgRNA gerektirdiğinden, zaman ve çabadan tasarruf etmek için aday sgRNA hedeflerinin önceden seçilmesi gereklidir. Çift iplikçikli break onarımı tek iplikçikli annealing ile inceleyerek nakavt verimliliğini değerlendirmek için çift luciferase muhabir sistemi geliştirilmiştir. Burada, belirli gen düzenleme için aday sgRNA vektörlerinden tercih edilen xCas9/sgRNA hedefini almak için bu muhabir sistemini kullanıyoruz. Belirtilen protokol 10 gün içinde tercih edilen bir sgRNA/CRISPR enzim vektörü sağlayacaktır (uygun şekilde tasarlanmış oligonükleotidlerden başlayarak).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRISPR sgRNA'lar 20 nükleotit dizisini (protospacer) oluşturur ve bu dizi1,2'yitamamlar. Son derece verimli olmasına rağmen, CRISPR/Cas sisteminin belirli bir genomik siteyi değiştirebilme yeteneği, hedef bölgeye özgü verimli bir sgRNA taşıyan bir vektörün üretilmesi için2. Bu makalede, sgRNA vektörünün oluşumundaki önemli adımlar açıklanmaktadır.

CRISPR/Cas sistemi kullanılarak başarılı genom düzenleme için, yüksek verimli sgRNA kullanımı önemli bir ön koşul3,4,5. Genom düzenlemede kullanılan mühendislik çekirdekleri farklı hedeflenen loci1'defarklı verimlilikler gösterdiğinden, zaman ve çabadan tasarruf etmek için aday sgRNA hedeflerinin ön seçimigereklidir 6,7,8,9. Çift luciferase muhabir sistemi tek iplikçik annealing 3 ,10ile çift iplikçik break onarım inceleyerek nakavt verimliliğini değerlendirmek için geliştirilmiştir. Burada bu muhabir sistemini, belirli gen düzenleme için tasarlanmış farklı aday sgRNA vektörlerinden tercih edilen CRISPR sgRNA hedefini seçmek için kullanıyoruz. Burada belirtilen protokol, CRISPR SGRNA'ları oluşturmak ve değerlendirmek için son birkaç yıldır grubumuzda ve işbirliği laboratuvarlarımızda uygulanmaktadır.

Aşağıdaki protokol, ağ yazılımı aracılığıyla uygun sgRNA'nın nasıl tasarılabildiğini özetleyin. Uygun sgRNA'lar seçildikten sonra, gerekli oligonükleotidleri elde etmek için farklı adımları ve eşleştirilmiş oligonükleotidlerin pX330-xCas9 ekspresyon vektörüne eklenmesi için farklı adımları anlatıyoruz. Ayrıca, bu dizilerin önceden sindirilmiş bir ifade vektörü içine bağlanmasına dayalı sgRNA-ekspres ve çift luciferase muhabiri vektörlerinin biraraya getirilmesi için bir yöntem satıyoruz (2-10 adım, Şekil 1A). Son olarak, sgRNA'ların her biri için DNA kesme veriminin nasıl analiz edilebildiğini anlatıyoruz (11-12. adım).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. sgRNA oligonükleotid tasarımı

  1. Cas-Designer çevrimiçi aracı (http://www.rgenome.net/cas-designer/) gibi çevrimiçi araçları kullanarak sgRNA'ları tasarla. PAM dizisi, Cas9'un kullanılmasına göre önemlidir. xCas9 için, ilgili PAM dizileri NG'dir ve eski başvuruyapılan Cas-Designer çevrimiçi aracı xCas9 ilgili sgRNA'lar oluşturabilir.
    1. Hedef te ve hedef dışı tahmin (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)11için algoritmaları kapsayan sgRNA tasarım araçlarını kullanın. 0,2 veya daha büyük bir puan tercih edilir.
  2. Optimum tarama için en fazla 3 gen düzenleme hedefi seçin (örneğin, T1, T2 ve T3 koyun DKK2 ekson 1 gen hedeflemesi için tasarlanmıştır [Tablo 1]).

2. Oligonükleotid modifikasyonu

  1. SgRNA oligonükleotidini değiştirmek için, 3'-NG protospacer bitişik motifini (PAM) silmek için, protospacer dizisini (örneğin, T1 için başlangıç sırası: TGCCTGCTCCTACTGGCCGC [20 nt]) saklar.
  2. Pentanükleotid CACCG'yi oligonun 5'ucuna ekleyin.
    NOT: pX330-xCas9 iskeletinin bağlanması üzerine bu sekans, SgRNA transkripsiyonunu motive eden U6 organizatörün 3'-sonunu içerecektir. "CACC" dizisi, oligonun BbsI sindirilmiş pX330-xCas9 plazmidin çıkıntılarıyla eşleşin. Temel "G" RNA Polimeraz III organizatörleri bir ön koşuldur ve sgRNA transkripsiyon etkili başlangıç garanti (örneğin, T1 protospacer için 5'-CACCG dizi ekleyen, T1-F elde: CACCGTGCCTGCtCTCTTACTGGCCGC [25 nt]). 21 nt gRNA'nın dekolte verimi 20 nt gRNA 1,12,13,14'ündenönemli ölçüde farklıdır. Genellikle daha kısa bir protospacer üreterek 5'-G ile 20 nt kullanılması tavsiye edilir, bu mümkün değilse o zaman ekstra 5'-G ile 21 nt kullanılabilir.
  3. Protospacer dizisinin ters tamamlayıcısı (rc) oluşturun.
    NOT: Örneğin, T1 protospacer rc GCGGCCAGTAGGAGCAGGCA (20 nt) olduğunu.
  4. Rc protospacer dizisinin 5'-sonuna AAAC'yi ekle. RC protospacer'In 3'ucuna ek bir C ekle.
    NOT: "AAAC" dizisi, oligonükleotidin BbsI sindirilmiş pX330-xCas9 plazmidine klonlama için uygun olmasını sağlar. 3'-end üzerinde ek "C", yukarıda açıklanan sgRNA transkripsiyonu için "G" ile annealing için gereklidir (örneğin, AAACGCGGCCAGTAGGAGCAGGCAC [25 nt] T1 rc protospacer için son oligonükleotid dizisidir).
  5. Oligonükleotidleri sipariş et.

3. Oligonükleotid tavlama

  1. Seyreltilmiş lyophilized oligonükleotidler 10 μM çift distile suda son konsantrasyon (ddH2O).
  2. Herhangi bir ekstra tampon eklemeden 1:1 oranı (örneğin, 20°L her) ana-ince bir duvar PCR tüp ileri ve ters oligonükleotidkarıştırın.
  3. Karışımı 95 °C'de 5 dk kuluçkaya yatırın ve sıcaklığı 10 dk boyunca 72 °C'ye kadar düşürün. Numuneyi PCR makinesinden çıkarıp RT'ye yerleştirmekten oluşan oda sıcaklığında (RT) bir soğuma süresi uygulayın.
    NOT: Ligasyonunu kolaylaştırmak için oligonükleotid karışımlarının fosforilasyonunu yapmak gerekli değildir.

4. sgRNA/CRISPR vektör sindirim

  1. Seçilen pX330-xCas9 vektörünün 1 μg'ini BbsI ile (1 μg plazmid başına 10 birim enzim) 37 °C'de 2 saat boyunca sindirin(Şekil 2). PX330-xCas9 sgRNA ekspresyon vektörünün toplam hacmi50 μL, 5 μL 10x sindirim tamponu ve distile su içeren son hacmi elde etmek için sindirimini gerçekleştirin.
  2. 10 V/cm'nin altındaki %2'lik agarose jelden bant çıkarımı ile sindirilmiş vektörü arındırın ve daha sonra ticari bir jel çıkarma kiti kullanarak silika sütunu kullanarak arındırın.

5. Eklenmiş sgRNA oligonükleotidlerin ekspresyon vektörüne bağlanması

  1. BbsI sindirilmiş pX330-xCas9 vektörü (saflaştırılmış, 100 ng) ile annealed sgRNA oligonükleotidleri (4. adımdan karışımın 5 μL'si) karıştırın.
  2. 1 μL ligaz ve 1 0x ligaz tampon 1 μL ekleyin.
  3. 10 μL'ye kadar uygun hacimde distile su ekleyin.
  4. Gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.

6. Yetkin hücre dönüşümü

  1. E. coli DH5α yetkili hücreleri -80 °C'deki depodan çıkarın ve buzüzerinde eritin.
  2. 50 μL'lik e. coli DH5α'ya 5 μL ligasyon karışımı ekleyin ve karışımı 30 dakika boyunca buzüzerinde tutun.
  3. Isı 90 s için 42 °C karışımı şok.
  4. 2 dakika buz üzerinde dinlendirin.
  5. 37 °C'de 1 saat boyunca 500 μL LB ortamdaki bir döner çalkalayıcıda kültürü kurtarın.
  6. Plaka 200 μL bir ampisilin direnci LB agarose plaka üzerinde kültür ve 37 °C gecede kuluçka.

7. DOĞRU rekombinant plazmidlerin PCR ile tanımlanması

  1. LB plakasından 5 ila 10 bakteri kolonisi seçin ve her birini 60 mg/mL ampisilin içeren 1 mL'lik bir 1,5 mL tüp içeren bir tüpü aşılamak için kullanın.
  2. Tüpleri 2-3 saat döner çalkalayıcıya inküler.
  3. SgRNA oligonükleotidler için spesifik astar çiftleri kullanarak doğru rekombinant plazmidlerin saptanması gerçekleştirin [örn. T1 sgRNA ekspresyon vektör konstrüksiyonu için ileri astar (T1-F): CACCGTGCCTGGCTCTTACTGGCCGC, ters astar (BbsI-R): AAAGTCCCTATTGGCGTTAC, üreten 287 bp amplicon (Şekil 3)].
    1. PCR karışımını hazırlayın (Tablo 2).
    2. Aşağıdaki PCR bisiklet koşullarını kullanın: Ön denatürasyon için 5 dk için 95 °C; Denatürasyon için 30 s için 95 °C' lik 30 devir, annelik için 30 s için 60 °C ve uzatma için 30 s için 72 °C. 30 döngü tamamlandıktan sonra, 72 °C'de 5 dakika ısıtılarak son bir uzatma adımı atın.
    3. PCR ürününü 10 V/cm'nin altında %2'lik agarose jel üzerinde çalıştırın. Doğru boyutta bir bant [örneğin, 287 bp] pozitif olarak kabul edilir.

8. SgRNA ekspresyonu plazmid dizisini doğrulayın

  1. Ters astar BbsI-R kullanarak15 Sanger sıralama (adım 7.3 bakınız) pcr pozitif kolonilerin sırasını doğrulayın. Bu astar sgRNA oligo eklemek aşağı sitede anneals. PX330-xCas9-T1 ifade sgRNA dizisi protospacer TGCCTGCTCTTACTGGCCGCGG ve xCas9 içeren inşa edilmiştir.
  2. Pozitif kolonileri sıralamak için ileri astar T1-F'yi kullanın. SgRNA oligo ekleme sitesini çevreleyen site için tam sıra bilgisi veremedi, çünkü sıralama astarını takip eden 30-50 bp'lik parça tam olarak okunamadı.

9. Çift luciferase muhabir vektörü yapımı

  1. SgRNA hedeflerini içeren 300-500 bp DNA parçalarını sentezleyin ve çift sindirim yoluyla çift luciferase muhabiri vektöre batırın [örneğin, subclone 440 bp koyun DKK2 ekson1 parçası pSSA-Dual plasmid16,17 AscI ve SalI ile çift sindirim kullanarak, sonuçlanan pSSA-Dual-DKK2].
  2. SGRNA hedeflerini içeren 300-500 bp DNA parçasını sentezleyin. DNA parçalarının dizilerinin, NCBI web sitesinden (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) veya ilgili referanslardan elde edilebilen genomik dizilerin parçaları olması gerektiğini unutmayın.
  3. PSSA-Dual16,17 (veya sırasıyla firefly luciferase ve renilla luciferase ifade eden iki vektör) gibi uygun bir çift luciferase muhabir vektör seçin ve sonra bu vektör ve DNA parçaları AscI ve SalI gibi iki endonucleases ile yukarıda belirtilen sindirmek.
  4. Son olarak bu iki parçayı T4 DNA Ligase ile bağlayarak pSSA-Dual-Target'a dönüştürün. Çift sindirim ve ligasyon için ayrıntılar sırasıyla Tablo 3 ve Tablo 4'tegörüntülenir. Bu muhabir vektör dna rekombinasyon önlemek amacıyla, daha düşük dönme hızı (genellikle en fazla 200 rpm) ile kültüre önerilir istikrarlı bakteri suşları (Top10 gibi) güçlendirilmiş olması gerektiğini belirtmekte değerlidir.

10. Hücre transfeksiyonu

  1. Yukarıda belirtilen vektörler için endotoksiniçermeyen plazmidleri ayıklayın. Plazmidlerin saflığını ve konsantrasyonu uygun aletler kullanarak değerlendirin. Bu plazmidler için en az 500 ng/μL'lik bir konsantrasyon ve 260/280 nm (A260/A280) saflık oranı 1.7-1.9 olarak önerilir.
  2. Piec18 gibi uygun bir hücre hattını, plazmidler ile eşit oranda (örneğin, pX330-xCas9-T1: pSSA-Dual-DKK2=1:1, 24 kuyu plakası kullanırken her çoğaltma için 0,5 μg plazmid) eş-transfect. Negatif kontrol olarak pX330-xCas9 gibi boş bir vektör kullanın.
    1. Transfeksiyondan bir gün önce, 2x 105 hücre/kuyu yoğunluğunda 24 kuyulu bir kültür plakasında plaka hücreleri. Hücreler %60-80'lik bir birleşme elde ettiklerinde transfeksiyona hazır olurlar.
    2. Transfeksiyon zaman noktasından önce, supernatant'ı mümkün olduğunca çıkarın ve her kuyu için 0,5 mL taze ortam ekleyin.
    3. DMEM ortamlarında seyreltik transfeksiyon reaktifi 1:25 oranında ve iyice karıştırın.
    4. 25 μL DMEM ortamlarında 0,5 μg DNA seyrelterek DNA'nın ana karışımını hazırlayın ve sonra 1 μL P3000 reaktifi ekleyin.
    5. Seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi (1:1 oranı) her tüp seyreltilmiş DNA ekleyin.
    6. Oda sıcaklığında 10-15 dakika kuluçka.
    7. Hücrelere 50 μL DNA-lipid kompleksi ekleyin.
    8. 37 °C'de 24 saat kuluçka hücreleri. Daha sonra, Adım 11'deki gibi transfected hücreleri analiz edin.

11. Çift luciferase algılama

  1. 4 hacimdist suya 1 hacim 5x PLB ekleyerek 1x pasif lisis tampon (PLB) yeterli miktarda hazırlayın ve iyice karıştırın.
  2. 24 kuyulu kültür plakalarında kültürlenmiş hücrelerin pasif lysis.
    1. Kültür hücrelerinden büyüme ortamını çıkarın ve kültür kabının yüzeyini yıkamak için yeterli miktarda fosfat tamponlu salin (PBS) uygulayın. Müstakil hücreleri ve artık büyüme ortamı kaldırmak için kısa bir süre gemi girdap. PLB reaktifini uygulamadan önce durulama çözeltisini tamamen çıkarın.
    2. Hücre monokatmanını tamamen kapsayacak şekilde her kültüre 100°L 1x PLB dağıtın. Kültür tabakları 20 dk bekletin.
    3. Daha fazla kullanım veya depolama için bir tüp veya şişe için lysate aktarın.
  3. Verilen luciferase issay arabelleği 10 mL'de sağlanan lyiferase ispat alt tabakasını yeniden sulandırarak luciferase issay reaktifini (LAR) hazırlayın.
  4. İstenilen çift luciferase muhabir tahlillerini (tahlil başına 100 μL reaktif) gerçekleştirmek için yeterli hacim hazırlayın. Bir cam veya silikonlu polipropilen tüp içinde stop tampon 50 hacimli 50 x stop substrat 1 hacim ekleyin.
  5. Çift luciferase muhabiri (DLR) teşp
    1. Program luminometreler 2 saniyelik önceden okuma gecikmesi sağlamak için, ardından 10 saniyelik bir ölçüm dönemi.
    2. İstenilen sayıda DLR Tahlil'i tamamlamak için uygun sayıda luminosmetre tüpüne 100 μL luciferase tahlil reaktifi öndispense.
    3. 20°L'ye kadar hücre lisatını LAR içeren luminometre tüpüne dikkatlice aktarın; 2 veya 3 kez pipetleme ile karıştırın. Tüpü luminometreye yerleştirin ve okumaya başla.
    4. Örnek tüpü luminometreden çıkarın, karıştırmak için 100 μL stop reaktifi ve girdap ekleyin. Luminometredeki örneği değiştirin ve okumayı başlatın.
    5. Firefly luciferase aktivitesi, yani ekranda görüntülenen oranın karşılıklı olarak normalleştirilmiş renilla luciferase aktivitesini kaydedin.
    6. Reaksiyon tüpünü atın ve bir sonraki tgörünüşe devam edin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde belirtilen yöntemler sgRNA ve xCas9 ekspresyon vektörlerinin yapımı ve daha sonra nispeten daha yüksek gen hedefleme verimliliğine sahip sgRNA oligolarının optimizasyon taraması içindir. Burada koyun DKK2 ekson 1 için 3 sgRNA hedeflerinin temsili bir örnek görüntüler. SgRNA ve xCas9 ifade vektörleri vektör omurgasının önceden sindirilmesi yle(Şekil 2)oluşturulabilir ve ardından oligo çiftçifti aracılığıyla kısa çift iplikli DNA parçaları bir dizi bağlanabilir. Pozitif ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada tanımladığımız sgRNA vektör klonlama prosedürleri, maliyetlerin çoğu oligonükleotid siparişi ve vektör diziliminden elde edilen sgRNA'ların verimli üretimini kolaylaştırır. Ana hatlarıyla anlatılan yöntem, kullanıcıların CRISPR/Cas9 ile kullanılmak üzere sgRNA'lar oluşturmasına olanak sağlamak üzere tasarlanmış olsa da, protokol, Cas9 ortologları veya Cpf1 gibi diğer RNA güdümlü endoklezazlarla kullanılmak üzere kolayca uyarlanabilir ve vektör omurgasında ve oligonükleotid sarkan dizilerde küçük değişiklikler yapa...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu proje Shandong Eyaleti Birinci Sınıf Otlak Bilim Disiplin Programı (Çin), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31301936, tarafından finanse edilmiştir 31572383), Kamu Yararına Tarımsal Bilimsel Araştırma Özel Fonu (201403071), Ulusal risk değerlendirme ana projesi süt ürünleri kalitesi ve güvenliği (GJFP201800804) ve Qingdao Halk Geçim Bilimi ve Teknolojisi Projeleri (19-6-1-68-nsh, 14-2-3-45-nsh, 13-1-3-88-nsh).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Yeni nesil tam dokunmatik ekranlı gradyan PCR cihazıLongGeneA200Hedef gen amplifikasyonu
AscI kısıtlama enzimleriNew England BiolabsR0558VHedef vektörleri kesme
BbsI kısıtlama enzimiNew England BiolabsR0539SHedef vektörleri kesme
Temiz çalışma tezgahıAIRTECHSW-CJ-2FD/VS-1300L-UYerel bir yüksek temiz hava ortamı DH5 & alpha yaratan dikey laminer akış şeklinde kısmi bir arıtma cihazı
; Yetkili HücrelerTaKaRaK613Plazmid vektör dönüşümü
Çift Luciferas Raportör Test SistemiPromegaE1910Çift luciferas raportör testi
Elektrikli termostatik su banyosuSanfa Scientific InstrumentsDK-S24Su banyosunda sabit sıcaklıkta ısıtma reaktifi
ElektroforezBeijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.DYY-6CKontrol voltajı, akım vb.
Eppendorf Referans 2Eppendorf Çin Ltd.Referans 2'nin izlerini doğru bir şekilde çizin ve aktarın
.WD-9413BElektroforez jel görüntülerinin analizi için
GloMax 20/20 LuminometrePromegaE5311Çift lusiferaz aktivitesini tespit
Yüksek hızlı soğutmalı santrifüjBMHsigma 3K15Nükleik asit ekstraksiyonu ve saflaştırılması
Akıllı biyokimyasal inkübatörSanfa Scientific InstrumentsSHP-160Enzim sindirim deneyi için uygun bir sıcaklık ortamı sağlayın
LB Et Suyu AgarSangon BiotechA507003-0250E.coli
Lipofectamine 3000 Transfeksiyon Reaktif KitiThermo FisherL3000015DNA Transfeksiyon
SalI kısıtlama enzimlerininNew England BiolabsR3138VHedef vektörlerin kesilmesi
SanPrep Sütun DNA Jeli Ekstraksiyon KitiSangon BiotechB518131-0050DNA parçalarının geri dönüşümü
SanPrep Kolonu Plazmid Mini Hazırlık KitiSangon BiotechB518191-0100Plazmid DNA
T4 DNA Ligase'ınNew England BiolabsM0202VLink DNA parçası
TaKaRa MiniBEST DNA Parçası Saflaştırma Kiti Ver.4.0TaKaRa9761DNA saflaştırma
Dikey basınçlı buhar sterilizatörüJIBIMEDLS-50LDLaboratuvar ekipmanlarında bakteri, mantar ve diğer mikroorganizmaları öldürmek için yüksek sıcaklık ve otoklav
Su banyosu termostatıChangzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd.SHZ-82Bakterilerin titremeye devam etmesine izin verin, bu da hava ile temas için iyidir.
Sıvı Jel görüntüleme analizörü Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. edin yetiştirilmesi için Ekstraksiyonu

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, H., et al. A surrogate reporter system for multiplexable evaluation of CRISPR/Cas9 in targeted mutagenesis. Scientific Reports. 8 (1), 1042(2018).
  2. Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
  3. Dang, Y., et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biology. 16, 280(2015).
  4. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
  5. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
  6. Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nature Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
  7. Yang, L., Yang, J. L., Byrne, S., Pan, J., Church, G. M. CRISPR/Cas9-Directed Genome Editing of Cultured Cells. Current Protocols in Molecular Biology. 107, 1-17 (2014).
  8. Yang, L., Mali, P., Kim-Kiselak, C., Church, G. CRISPR-Cas-mediated targeted genome editing in human cells. Methods in Molecular Biology. 1114, 245-267 (2014).
  9. Vidigal, J. A., Ventura, A. Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries. Nature Communications. 6, 8083(2015).
  10. Mazon, G., Mimitou, E. P., Symington, L. S. SnapShot: Homologous recombination in DNA double-strand break repair. Cell. 142 (4), 646(2010).
  11. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  12. Lee, J. K., et al. Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity. Nature Communications. 9 (1), 3048(2018).
  13. Sung, Y. H., et al. Highly efficient gene knockout in mice and zebrafish with RNA-guided endonucleases. Genome Research. 24 (1), 125-131 (2014).
  14. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  15. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  16. Ruan, J., et al. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated transgene knockin at the H11 locus in pigs. Scientific Reports. 5, 14253(2015).
  17. An plasmid with double fluorescent groups and its application as standard substance. China patent. , 201210509946.1 (2012).
  18. Li, H., et al. Characterization of the porcine p65 subunit of NF-kappaB and its association with virus antibody levels. Molecular Immunology. 48 (6-7), 914-923 (2011).
  19. A pair of sgRNAs targeting porcine RELA gene. China patent. , 201510398717.0 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CRISPR PlasmidssgRNA ConstructionDual Luciferase ReporterKnockout EfficiencyMammalian CellsxCas9 VectorBbs1 DigestionColony PCR ScreeningLuciferase AssayT7EI Assay

Related Articles