Yöntem makalesi

Rapamisin/mTOR etkileşimini incelemek için Yarı Kantitatif İlaç Affinity Responsive Target Stability (DARTS)

DOI:

10.3791/59656

⸱

27 Ağustos 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, New York University Medical Center, 2Department of Cell Biology, New York University School of Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, protein stabilitesindeki değişiklikleri izleyerek ve protein-ligand etkileşimlerinin yakınlığını tahmin ederek DARTS deneyinin veri analizi yeteneklerini geliştirdik. Etkileşimler iki eğriye çizilebilir: proteolitik eğri ve doz bağımlılığı eğrisi. MTOR-rapamisin etkileşimini örnek bir vaka olarak kullandık.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İlaç Affinity Responsive Target Stability (DARTS) yeni küçük molekül protein hedeflerinin tespiti için sağlam bir yöntemdir. Bilinen küçük molekül-protein etkileşimlerini doğrulamak ve doğal ürünler için potansiyel protein hedeflerini bulmak için kullanılabilir. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, DARTS yerli, değiştirilmemiş, küçük moleküller kullanır ve basit ve kullanımı kolaydır. Bu çalışmada, protein stabilitesindeki değişiklikleri izleyerek ve protein-ligand etkileşimlerinin yakınlığını tahmin ederek DARTS deneyinin veri analizi yeteneklerini daha da geliştirtik. Protein-ligand etkileşimleri iki eğriye dönüştürülebilir: proteolitik eğri ve doz bağımlılığı eğrisi. MTOR-rapamisin etkileşimini protokolümüzün kurulması için örnek bir örnek olarak kullandık. Proteolitik eğriden pronase tarafından mTOR proteozisinin rapamisin varlığı ile inhibe edildiğini gördük. Doz bağımlılığı eğrisi bize rapamisin ve mTOR bağlayıcı yakınlık tahmin etmek için izin verdi. Bu yöntem, yeni hedef proteinlerin doğru bir şekilde tanımlanması ve uyuşturucu hedef etkileşiminin optimizasyonu için güçlü ve basit bir yöntem olması muhtemeldir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Küçük molekül hedef proteinlerin belirlenmesi mekanistik anlayış ve potansiyel terapötik ilaçların gelişimi için gereklidir1,2,3. Affinity kromatografisi, küçük moleküllerin hedef proteinlerini tanımlamak için klasik bir yöntem olarak, iyi sonuçlar vermiştir4,5. Ancak, bu yöntem, küçük moleküllerin kimyasal modifikasyongenellikle azaltılmış veya değiştirilmiş bağlayıcı özgüllük veya yakınlık ile sonuçlanır, sınırlamalar vardır. Bu sınırlamaları aşmak için, son zamanlarda küçük moleküllerin kimyasal modifikasyonu olmadan küçük molekül hedeflerini belirlemek için çeşitli yeni stratejiler geliştirilmiş ve uygulanmıştır. Etiketsiz küçük moleküllerin hedef tanımlaması için bu doğrudan yöntemler arasında ilaç afiniteduyarlı hedef stabilitesi (DARTS)6, oksidasyon oranlarından proteinlerin stabilitesi (SPROX)7, hücresel termal değişim töz (CETSA)8 ,9, ve termal proteom profilleme (TPP)10. Doğal, değiştirilmemiş küçük moleküller kullandıkları ve hedef proteinleri bulmak için sadece doğrudan bağlayıcıetkileşimlere güvendikleri için bu yöntemler son derece avantajlıdır 11.

Bu yeni yöntemler arasında, DARTS kolayca en laboratuvarları12,13tarafından kabul edilebilir nispeten basit bir metodolojidir. DARTS, ligand bağlı proteinlerin bağlanmamış proteinlere göre enzimatik bozulmaya karşı modifiye duyarlılığı gösterdiği kavramına bağlıdır. Yeni hedef protein sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS/MS) ile SDS-PAGE jelindeki değiştirilmiş bandın incelenmesi ile saptanabilir. Bu yaklaşım başarıyla doğal ürün ve ilaçların daha önce bilinmeyen hedeflerinin belirlenmesi için uygulanmıştır14,15,16,17,18, 19. Aynı zamanda belirli bir protein20,21bileşiklerin bağlayıcı doğrulamak veya ekrana bir araç olarak güçlüdür. Bu çalışmada, protein stabilitesindeki değişiklikleri küçük moleküllerle izleyerek ve protein-ligand bağlayıcı afiyetleri tanımlayarak deneyde bir iyileşme sayılmayı savuruyoruz. Yaklaşımımızı göstermek için mTOR-rapamycin etkileşimini örnek olarak kullanıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücreleri toplama ve düzenlil

  1. % 10 fetal sığır serumu, 2 mM glutamin ve% 1 antibiyotik ile Dulbecco modifiye Eagle orta (DMEM) kullanarak 293T hücreleri büyümek. 37 °C'de %5 CO2'nin altında kuluçka kültürleri .
    NOT: Hücrelerin büyüme durumu sonraki deneylerin kararlılığını etkileyebilir.
  2. 80\u201290% biraraya ulaşana kadar kültür hücreleri genişletin.
  3. 345 μL hücre lisis reaktifini (Malzeme Tablosunabakın) 25 μL 20x proteaz inhibitör kokteyli, 25 μL 1 M sodyum florür, 50 μL 100 mM β-glikofosfat, 50 μL 50 mM sodyum pirofosfat ve 5 000 mM sodyum orthovanadate ile karıştırın. Lysis tamponu buz üzerinde soğutulmuş tutun.
    NOT: Çeşitli deterjanlı diğer lysis tamponları (örneğin, Triton X-100 veya NP-40) DARTS ile non-denaturing olduğu sürece kullanılabilir. Membran proteinleri veya nükleer proteinler hücre lysate% 0.4 Triton X-100 veya% 0.4 NP-40 ekleyerek elde edilebilir.
  4. Hücreleri soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez yıkayın.
  5. Hücreleri uygun miktarda hücre lisis tamponu içinde toplamak ve lysing hücreleri 1,5 mL tüp içine aktarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.
    NOT: Her DARTS deneyi için gereken hücre sayısı, çeşitli hücre hatlarından ne kadar protein çıkarılabildiğine bağlı olarak değişir. Genel olarak kullanılan lysat protein konsantrasyonu 4\u20126 μg/μL arasındadır. 85\u201290% 293T hücrelerinin bir 10 cm plaka, lysis tampon 300 μL ile lysed genellikle ~ 5 μg/ μL protein konsantrasyonu ile bir lysate ile sonuçlanır.
  6. Lysis tampon/lysing hücrelerini iyice karıştırın ve tüpü 10 dakika boyunca buzüzerinde kuluçkaya yatırın.
  7. Tüpü 18.000 × g'de 10 dakika 4 °C'de santrifüj edin.
  8. Supernatant'ı yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın ve buzüzerinde soğutulun.
  9. Lysates protein konsantrasyonu yaklaşık bca tayini gerçekleştirin.

2. Küçük molekül ile inküm protein lisates

  1. Lysatların 99 μL'sini 1,5 mL'lik iki tüpe bölün.
  2. 10 mM küçük molekülün başlangıç stok konsantrasyonu yapın. DART Yaparken, en iyi bağlamayı sağlamak için küçük molekülün (5\u201210x EC50 değeri) daha yüksek konsantrasyonu ile başlayabilir.
    1. Küçük molekülün çözünür olduğunu 1 μL çözücü veya lysate her aliquot için küçük molekül stok çözeltileri 1 μL ekleyin. Sallayarak oda sıcaklığında 30\u201260 dk çözeltileri ile inkübasyon hücre lysate.
  3. Buzüzerinde, 1x TNC'de taze çözülmüş pronase çözeltisinin seri seyreltmeleri (1:200, 1:400, 1:800 ve 1:1600) (10x TNC tamponunun 1 mL'si için, 100 μL 5 M sodyum klorür 100 μL, 100 μL sodyum klorür, 100 μL 1 M kalsiyum klorür karışımı ve 500 μL 1 M Tris-HCl, pH 8.0).
  4. Pronase'nin hedef(ler) üzerindeki adım-akıllıca etkisinin gözlemlenebilirliğini garanti etmek için pronase:protein oranlarını (örn. 1:100 ile 1:2000 arasında) geniş bir yelpazede inceleyin.
    NOT: Pronase konsantrasyonlarını hesaplamak için (örnek): 5 μg/μL protein konsantrasyonu x 20 μL örnek = 100 μg protein. Bir pronase:protein oranı için 1:100 0.5 g/μL (100 μg ÷ 100 ÷ 2 μL) pronase çözeltisi gerekir. Bu deney, uygun bir pronase: protein oranları elde etmek için birkaç kez tekrarlanmalıdır.

3. Proteolysis gerçekleştirin

NOT: Proteoziz için, aksi belirtilmedikçe adımlar oda sıcaklığında gerçekleştirilir

  1. Küçük molekülle kuluçkadan sonra, her aliquot'u 20 μL'lik numuneye bölün.
  2. Her numunede belirli aralıklarla (her 30 s) pronase çözeltisi aralığının 2 μL'sini ekleyin. Sindirilmemiş bir kontrol örneği oluşturmak için eşit hacimli 1x TNC arabelleği kullanın.
  3. 5\u201220 dk sonra, 2 μL soğuk 20x proteaz inhibitör kokteyli her 30 s. Mix iyi ve 10 dakika buz üzerinde kuluçka eklenmesi ile sindirimi durdurun.
  4. Örnekleri uygun hacimde 5x SDS-PAGE yükleme tamponu ile seyreltin ve 95 °C'de 5 dk kaynatın.
  5. Deneyin bir sonraki kısmını gerçekleştirin veya protein örneğini −80 °C'de saklayın.

4. Niceleme ve analiz

  1. DARTS sonra, daha önce yayınlanan protokol22göre Coomassie mavi boyama gerçekleştirin.
  2. Lekeli protein bantları destaining sonra çok açık olmalıdır. Kullanılan destain çözeltisi dökün ve jel kapsayacak şekilde taze% 1 asetik asit çözeltisi ekleyin. (Örnek grup) veya (kontrol grubu) küçük molekül olmadan gruplar arasında önemli farklılıklar olan bantları gözlemlemek için jeli ışığın altına koyun.
  3. Jelden karşılık gelen iki bandı steril bir aletle kesin ve hemen LC-MS/MS'i tarayın.
    NOT: Jeldeki proteinler sürekli olarak bozulacağı için LC-MS/MS'nin mümkün olan en kısa sürede yapılması gerekir.
  4. Bantları sindirin, peptidleri ayıklayın ve LC-MS/MS analizini yapın23.
    1. LC-MS/MS verilerini analiz etmek için öncelikle banttaki tüm proteinleri tanımlayın. İkinci olarak, her proteinin bolluğunu temsil etmek için peptit spektrum eşleşmesi (PSM) kullanın.
      NOT: PSM, protein için tanımlanan peptid dizilerinin toplam sayısını sağlar, gereksiz olarak tanımlananlar da dahil olmak üzere. Genel olarak, bir peptidin ne sıklıkta tanımlanabileceği/sıralanmış olduğu örnekte proteinin ne kadar bol olduğuna ilgili kabaca bir tahmin olarak kullanılabilir. Kontrol grubu üzerinde örneklem grubunda zenginleştirilmiş proteinler ilgi çekici proteinlerdir.
  5. Seçilen proteinlerin birincil antikorlarını temin edin. Küçük molekülün potansiyel hedef proteinlere doğrudan bağlanabilen24'üdoğrulamak için batı lekesini gerçekleştirin.
    1. Uygun bir molekül ağırlık belirteci ile birlikte% 8 SDS-PAGE jel kuyularına protein eşit miktarda yükleyin. Jeli 80 V'da 30 dk çalıştırın, sonra voltajı 120 V'a ayarlayın ve 1\u20122 h boyunca çalışmaya devam edin.
  6. Görüntü işleme ve analiz yazılımını kullanarak farklı hedef protein bantlarını ölçün (Bkz. MalzemelerTablosu).
  7. Verileri analiz edin ve eğrileri çizin.
    1. Hedef protein için proteolitik eğrinin belirlenmesi
      1. Pronase:protein oranı proteozis yaparken değişir. Sindirilmemiş bantlara karşılık gelen bant yoğunluğu değerlerini %100'e atfederek görüntü analizinden elde edilen verileri normalleştirin.
      2. Göreceli bant yoğunluğu ve pronase:protein oranları için normalleştirilmiş verilerin bir eğrisini çizmek için istatistiksel analiz ve çizim yazılımının doğrusal olmayan regresyon analizini kullanın.
      3. İlk olarak, yazılımı açın, tablo ve grafik türünü XY olarak seçin ve yan yana alt sütunlarda 3 çoğaltma değerine izin verin. Daha sonra x ve y'nin altındaki boşluğa karşılık gelen verileri girin. x'in altında, 0, 1, 2, 3, 4, 5 (karşılık gelen pronase:protein oranlarına karşılık gelen yer tutucular olarak) sayılarını girin.
      4. y sütununa, göreli bant yoğunlukları için normalleştirilmiş verileri girin. "Doğrusal olmayan regresyon" gerçekleştirin ve "Log (agonist) karşı yanıt-Değişken eğim (dört parametre)" denklemini kullanarak bir "Doz-yanıt-Stimülasyon" uygulayın.
      5. Eğrideki X ekseninin ek açıklamalarını karşılık gelen pronase:protein oranlarına dönüştürün.
    2. Hedef protein için doz bağımlılığı eğrisinin belirlenmesi
      NOT: Doz bağımlılığı analizi için küçük molekülün azılılığı örnekler arasında farklılık gösterir. Kararlı pronase:protein oranı proteozez verilerinin analizi ile bilgilendirilmelidir. Proteyolitik eğri sırasında hedef protein yoğunluğunda maksimal fark gösteren pronase:protein oranı doz bağımlılığı deneyi için kullanılmalıdır.
      1. Bir görüntü analizi yazılımı kullanarak farklı hedef protein bantlarını ölçün. Doz bağımlılığı eğrisinin oluşumunda olduğu gibi, en az sindirilmiş banda karşılık gelen bant yoğunluğu değerlerini %100'e atfederek görüntü analizinden elde edilen verileri normalleştirin.
      2. İstatistiksel analiz ve çizim yazılımı içinde doğrusal olmayan regresyon analizini normalleştirilmiş verilere uygulayın. İlk olarak, yazılımı açın, xy olarak tablo ve grafik türünü seçin ve yan yana alt sütunlarda 3 çoğaltma değerleri girin.
      3. Daha sonra, x ve y'nin altındaki boşluğa karşılık gelen verileri girin. 'x' değişkeni için, küçük molekülün farklı konsantrasyonlarını girdirin; 'y' göreli bant yoğunluğu için karşılık gelen normalleştirilmiş verileri içerir.
      4. X = Log(X) kullanarak x değerlerini dönüştürün. Son olarak, doğrusal olmayan regresyon istihdam ve "Log (agonist) karşı yanıt-Değişken eğim (dört parametre)" denklemi kullanarak bir doz-yanıt stimülasyonu uygulayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deneyin akış şeması Şekil1'de özetlenmiştir. Coomassie mavi boyama sonucu Şekil2'de gösterilmiştir. Küçük molekül ile kuluçka proteoziz karşı koruma sağlar. Araç kontrolü üzerinde rapamisin ile kuluçka ile korunuyor gibi görünen üç bant bulunur. Proteolitik eğri deneyinden beklenen sonuçlar Şekil3'te gösterilmiştir. Bir kanıtı olarak, biz iyi çalışılmış protein mTOR, hangi ilaç rapamyciniçin hedef 25 inceledi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DARTS, protein bağlamanın bozulmaya karşı koruyucu etkisinden yararlanarak küçük molekül hedeflerinin belirlenmesini sağlar. DARTS herhangi bir kimyasal modifikasyon veya küçük molekül26immobilizasyon gerektirmez. Bu küçük moleküllerin doğrudan bağlayıcı protein hedeflerini belirlemek için kullanılmasını sağlar. Klasik DARTS yöntemi için standart değerlendirme kriterleri jel boyama, kütle spektrometresi ve batı leke12,13içerir. Klasik meto...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma kısmen NIH araştırma hibe R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484 ve DOD araştırma hibe W81XWH-16-16-0482 tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
100X Proteaz inhibitörü kokteyliSigma-AldrichP8340Ultra saf su ile 20X'e seyreltin
10 FBS293T hücre hattıATCCCRL-3216
Sigma-AldrichA6283
BCA Protein Test KitiThermo Fisher23225
Kalsiyum klorürSigma-AldrichC1016
Hücre kazıyıcıThermo Fisher179693
Coomassie Brilliant Blue R-250 Boyama ÇözeltisiBio-Rad1610436
Dimetil sülfoksit (DMSO)Sigma-AldrichD2650
GraphPad PrizmaGraphPad YazılımSürümü 6.0istatistiksel analiz ve çizim yazılımı
Hidroklorik asitSigma-AldrichH1758
ImageJUlusal Sağlık EnstitüleriSürüm 1.52görüntü işleme ve analiz yazılımı
M-PER Hücre Lizis ReaktifiThermo Fisher78501
Fosfat tamponlu salin (PBS)CorningR21-040-CV
PronazRochePRON-RO10 mg / ml
Sodyum klorürSigma-AldrichS7653
Sodyum florürSigma-AldrichS7920
Sodyum ortovanadatSigma-Aldrich450243
Sodyum pirofosfatSigma-Aldrich221368
Trizma tabanıSigma-AldrichT1503pH 8.0
ve beta; - gliserofosfatSigma-AldrichG9422'ye
%Asetik asit içeren DMEM ortamı, ayarlanır

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).
  2. O'Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R. Chemical genetics. Chemical Society Reviews. 40 (8), 4332-4345 (2011).
  3. McFedries, A., Schwaid, A., Saghatelian, A. Methods for the elucidation of protein-small molecule interactions. Chemistry & Biology. 20 (5), 667-673 (2013).
  4. Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T., Uesugi, M. Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies. Chemistry & Biology. 17 (6), 616-623 (2010).
  5. Sleno, L., Emili, A. Proteomic methods for drug target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1), 46-54 (2008).
  6. Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).
  7. Strickland, E. C., et al. Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation. Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).
  8. Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
  9. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
  10. Savitski, M. M., et al. Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome. Science. 346 (6205), 1255784(2014).
  11. Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification. Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).
  12. Pai, M. Y., et al. Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification. Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).
  13. Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).
  14. Xu, L., et al. Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility. Nature Communications. 9 (1), 2454(2018).
  15. Lim, H., et al. A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes. Nature Communications. 9 (1), 1438(2018).
  16. Schulte, M. L., et al. Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models. Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).
  17. Skrott, Z., et al. Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4. Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).
  18. Zhang, C., et al. Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).
  19. Chin, R. M., et al. The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR. Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).
  20. Robinson, T. J., et al. High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors. Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).
  21. Aghajan, M., et al. Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase. Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).
  22. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
  23. Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
  24. Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
  25. Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin. Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).
  26. Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. Identification of direct protein targets of small molecules. ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).
  27. Park, Y. D., et al. Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening. MBio. 7 (4), (2016).
  28. Qu, Y., et al. Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer. Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

DARTS assayProtein stabilityProteolytic curveDose dependence curvemTOR rapamycin interactionWestern blotBCA assayPronase digestionCell lysisSDS PAGE gel

İlgili makaleler