Yöntem makalesi

Drosophila Kullanarak Hastalıkla İlişkili Nadir İnsan Varyantlarının Vivo Fonksiyonel Çalışmasında

DOI:

10.3791/59658

⸱

20 Ağustos 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Section of Neurology and Developmental Neuroscience, Baylor College of Medicine, 4Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children's Hospital, 5Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün amacı, insan hastalıkları ile ilişkili nadir gen varyantlarının fonksiyonel sonuçlarını değerlendirmek için Drosophila melanogaster'deki in vivo deneylerin tasarımını ve performansını ana hatlarını ortaya çıkarmaktır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sıralama teknolojisindeki gelişmeler, hem klinik tanı hem de son teknoloji insan genetiği araştırmaları için tüm genom ve tüm eknom veri kümelerini daha erişilebilir hale getirmiştir. Bu veri kümelerinde tanımlanan varyantların patojenitesini tahmin etmek için silico algoritmalarında bir dizi siliko algoritma geliştirilmiş olsa da, fonksiyonel çalışmalar, özellikle yanlış anlama için, spesifik genomik varyantların protein fonksiyonunu nasıl etkilediğini belirlemek için kritik öneme sahiptir. Türev -leri. Tanı konulmamış Hastalıklar Ağı 'nda (UDN) ve diğer nadir hastalık araştırma konsorsiyumlarında, Drosophila, C. elegans, zebra balığı ve fareler dahil olmak üzere model organizmalar (MO) aktif olarak putatif insan hastalığına neden olan fonksiyonu değerlendirmek için kullanılır Türev -leri. Bu protokol, UDN'nin Model Organizmalar Tarama Merkezi Drosophila Core'da kullanılan nadir insan varyantlarının fonksiyonel değerlendirilmesi için bir yöntem tanımlamaktadır. İş akışı, birden fazla genel veritabanlarından insan ve MO bilgilerini toplamak, marrvel web kaynağını kullanarak varyantın hastanın durumuna katkıda bulunup bulunmadığını değerlendirmek ve mevcut temele dayalı etkili deneyler tasarlamak ile başlar. bilgi ve kaynaklar. Daha sonra, genetik araçlar (örneğin, T2A-GAL4 ve UAS-insan cDNA hatları) Drosophilailgi varyantlarının işlevlerini değerlendirmek için oluşturulur. Bu reaktiflerin geliştirilmesi üzerine, varyant işlevini değerlendirmek için kurtarma ve aşırı ifade deneylerine dayalı iki uçlu fonksiyonel tahliller yapılabilir. Kurtarma dalında, endojen sinek genleri referans veya varyant insan transgenleri ile ortolog Drosophila gen yerine "insancıl" vardır. Aşırı ifade dalında, referans ve varyant insan proteinleri dışsal dokuların çeşitli tahrik vardır. Her iki durumda da, herhangi bir çatlanabilir fenotip (örneğin, öldürücülük, göz morfolojisi, elektrofizyoloji) ilgi hastalığı ne olursa olsun, bir okuma olarak kullanılabilir. Referans ve varyant aleller arasında gözlenen farklılıklar varyanta özgü bir etki ve dolayısıyla büyük olasılıkla patojenite yi düşündürmektedir. Bu protokol, bilinen ve bilinmeyen işlevleri olan genlerin putatif insan hastalığına neden olan varyantlarının hızlı ve in vivo değerlendirmelerine olanak sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nadir hastalığı olan hastalar genellikle doğru bir tanı elde etmek için "tanı odyssey" olarak adlandırılan zorlu bir yolculuk geçmesi1. En nadir hastalıkların güçlü bir genetik kökene sahip olduğu düşünülmektedir, klinik çalışma kritik unsurları genetik / genomik analizler yapma. Aday gen paneli dizileme ve kromozom mikrodizileri, bütün ekzom (WES) ve tüm genom dizileme (WGS) teknolojileri dayalı kopya numarası varyasyon analizi ek olarak son on yıl içinde giderek daha değerli araçlar haline gelmiştir2, 3 . Şu anda, WES ve WGS bilinen bir patojenik varyant ı belirlemek için tanı oranı ~ 25% (pediatrik vakalarda daha yüksek)4,5. Klinik WES/WGS'den sonra tanı konmamış olan vakaların çoğunda, yaygın bir sorun birçok aday gen ve varyantolmasıdır. Yeni nesil sıralama genellikle birçok gende yeni veya ultra nadir varyantları tanımlar ve bu varyantların hastalık fenomenilerine katkıda bulunup bulunmadığını yorumlamak zordur. Örneğin, genlerdeki çoğu saçma veya kare kayma mutasyonunun, kodlanmış transkriptin saçma aracılı çürümesi nedeniyle fonksiyon kaybı (LOF) alelleri olduğu düşünülse de, son ekonlarda bulunan kesilen mutasyonlar bu süreçten kaçar ve iyi huylu veya fonksiyon kazancı (GOF)alel6 .

Ayrıca, yanlış algılamalı alelin etkilerini tahmin etmek yıldırıcı bir görevdir, çünkü ilk olarak Herman Muller tarafından 1930'larda (yani, amorf, hipomorf, hipermorf, antimorf, neomorf veya izomorf) açıklandığı gibi farklı genetik senaryolar bir dizi neden olabilir 7 . Evrimsel koruma, amino asit değişiminin türü, fonksiyonel etki alanı içindeki konumu, genel popülasyondaki alel frekansı, ve diğer parametreler8. Ancak, bu programlar varyant yorumlama karmaşık sorunu çözmek için kapsamlı bir çözüm değildir. İlginçtir, yeni bir çalışmada beş yaygın olarak kullanılan varyant patojenik tahmin algoritmaları (Polyphen9, SIFT10, CADD11, PROVEAN12, Mutasyon Taster) patojenite ~ 8% katılıyorum gösterdi . Özellikle, tüm algoritmalar kabul etse bile, patojenite nin %11'ine kadar yanlış bir tahminde bulunurlar. Bu sadece kusurlu klinik yorumlanmasına yol açmakla kalmıyor, aynı zamanda araştırmacıları yanlış bir şekilde iyi huylu olarak listeleyerek yeni varyantları takip etmekten caydırabilir. Silico modellemede mevcut sınırlamayı tamamlamanın bir yolu, varyant fonksiyonunun in vitro, ex vivo (örn. kültürlü hücreler, organoidler) veya in vivo etkisini gösteren deneysel veriler sağlamaktır.

MO nadir hastalık ilişkili varyantları in vivo fonksiyonel çalışmalar benzersiz güçlü13 var ve Amerika Birleşik Devletleri'nde Tanı konulmamış Hastalıklar Ağı (UDN) ve Nadir dahil olmak üzere dünya çapında birçok nadir hastalık araştırma girişimleri tarafından kabul edilmiştir Hastalıklar Modelleri ve Mekanizmaları (RDMM) Ağları Kanada, Japonya, Avrupa ve Avustralya14. MO araştırmacılarını ulusal ölçekte nadir hastalık tanısı ve mekanistik çalışmaların iş akışına entegre etmek için yapılan bu eşgüdümlü çabalara ek olarak, klinik ve MO araştırmacıları arasında yapılan bir dizi bireysel işbirliği çalışması keşfe yol açmıştır. ve birçok yeni insan hastalığı neden gen ve varyantları82,83,84karakterizasyonu .

UDN'de, merkezi bir Model Organizmalar Tarama Merkezi (MOSC) aday gen ve varyantların sunumlarını hastanın durumunun tanımıyla alır ve varyantın enformatik araçlar kullanılarak patojenik olup olmadığını değerlendirir ve in vivo Deney. UDN'nin Faz I'inde (2015-2018) MOSC, vakaları değerlendirmek için işbirliği içinde çalışan Drosophila Core [Baylor College of Medicine (BCM)] ve Zebrafish Core'dan (Oregon Üniversitesi) oluşuyordu. Drosophila ve zebrabalığı nda bilişim analizi ve farklı deneysel stratejiler bir dizi kullanarak, MOSC şimdiye kadar 132 hastanın tanısına katkıda bulunmuştur, 31 yeni sendromlar belirlenmesi55, birkaç yeni insan keşfi hastalık genleri (örneğin, EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) ve bilinen hastalığın fenotipik genişlemesi genler (örneğin, CACNA1A21, ACOX122).

MOSC Drosophila Core araştırmacıları, UDN içindeki projelere ek olarak, Mendelian Genomik Merkezleri ve diğer girişimlerle işbirliği içinde yeni hastalık gen keşiflerine katkıda bulunmuştur (örn. ANKLE223, TM2D3 24, NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, DNMBP29) bilişim ve genetik aynı seti kullanarak UDN için geliştirilen stratejiler. Nadir hastalık tanısı üzerine MO çalışmalarının önemi göz önüne alındığında, MOSC UDN Faz II (2018-2022) için bir C. elegans Core ve ikinci Zebrafish çekirdek (Her ikisi de Washington Üniversitesi'nde St Louis) içerecek şekilde genişletildi.

Bu el yazması, udn MOSC Drosophila Core'da aktif olarak kullanılan in vivo fonksiyonel çalışma protokolünü açıklar. Protein. Bu protokolün amacı, MO araştırmacılarının klinik araştırma gruplarıyla işbirliği içinde çalışarak, ilgi çeken bir gendeki bir aday varyantın fonksiyonel sonuçları olduğuna dair deneysel kanıtlar sunarak klinik tanıyı kolaylaştırmaktır. Bu protokol en çok, drosophila araştırmacısının, ilgi çeken bir gende belirli bir aday varyantı olan nadir bir hastalık hastası olan bir klinik araştırmacı tarafından yaklaşıldığı bir senaryoda yararlıdır.

Bu protokol üç unsura ayrılabilir: (1) hasta fenotip ve Drosophilafonksiyonel bir çalışmanın fizibilite sorumlu olan ilgi varyantı olasılığını değerlendirmek için bilgi toplama , (2) toplama mevcut genetik araçlar ve yenilerini kurmak ve (3) in vivo fonksiyonel çalışmalar yapmak. Üçüncü öğe, bir ilgi varyantının işlevinin nasıl değerlendirilebileceğine (kurtarma deneyi veya aşırı ifade tabanlı stratejiler) göre iki alt öğeye ayrılabilir. Bu protokolün nadir monojenik hastalık araştırmaları dışında birçok senaryoya uyarlanabildiği ve optimize edilebildiği unutulmamalıdır (örn. yaygın hastalıklar, gen-çevre etkileşimleri ve terapötik hedefleri belirlemek için farmakolojik/genetik ekranlar). Varyantların işlevselliğini ve patojenliğini belirleyebilme becerisi sadece doğru moleküler tanı sağlayarak ilgi çeken hastaya fayda sağlamakla kalmamış, aynı zamanda hem çevirisel hem de temel bilimsel araştırmalar üzerinde daha geniş etkilere de yol açacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Değerlendirmek için İnsan ve MO Bilgi Toplama: Bir İlgi Varyantı Hastalık Fenotipler ve Drosophila Fonksiyonel Çalışmaların Fizibilite Sorumlu Olma Olasılığı

  1. İlgi çekici hastanın fenotipini açıklamak için belirli genve türevlerin iyi adaylar olup olmadığını belirlemek için kapsamlı veritabanı ve literatür aramaları gerçekleştirin. Özellikle, aşağıdaki bilgileri toplayın.
    1. İlgi geninin daha önce diğer genetik bozukluklara (bilinen hastalık geninin henotipik genişlemesi) mi karıştığını veya bunun tamamen yeni bir hastalık adayı gen [belirsiz önemi gen varyantı (GVUS)] olup olmadığını değerlendirin.
    2. Hastalık veya kontrol nüfus veritabanları ilgi varyantı alel sıklığını değerlendirin.
    3. Hastalıkta bu geni içeren kopya numarası varyasyonları (CNV' ler) olup olmadığını değerlendirin veya nüfus veritabanlarını kontrol edin.
    4. Fare, zebra balığı, Drosophila, C. elegans ve maya gibi farklı MO türlerinde ortolog genlerin ne olduğunu değerlendirin, daha sonra bu ortolog genlerin bilinen işlevlerini ve ifade kalıplarını daha fazla araştırın.
    5. İlgi varyantının proteinin fonksiyonel etki alanında mevcut olup olmadığını ve ilginin amino asitinin evrimsel olarak korunup korunmadığını değerlendirin.
      NOT: Bu beş sorunun yanıtları (1.1.1-1.1.5 adımları) bir dizi insan ve MO veritabanlarına tek tek erişerek veya MARRVEL (Nadir Varyant Keşfi için Model organizma Toplu Kaynaklar) web kaynağı kullanılarak elde edilebilir (Bkz. Tablo 1 online kaynaklar için)30, hangi eşlik eden bir makalede derinlemesine açıklanan31. Belirli örnekler için temsili sonuçlar bölümüne bakın. Monarch Girişimi web sitesi32 ve Gene2Function33 de yararlı bilgiler sağlar.
  2. Varyantın bir protein fonksiyonu ndan ve yapı-of-view iyi bir hastalık adayı olup olmadığını daha fazla değerlendirmek için ek bilgi toplamak.
    1. Silico tahmin algoritmalarına dayalı olarak ilgi nin varyantının zarar verici olduğu tahmin edilip edilmeyeceğini değerlendirin.
      NOT: Varyant patojenite algoritmaları son ~15 yıl içinde birçok araştırma grubu tarafından geliştirilmiştir ve bazıları da MARRVEL arama sonuçlarında gösterilmiştir. Aşağıda listelenen iki program da dahil olmak üzere daha yeni programlar, patojenite skoru oluşturmak için birden fazla varyant patojenasyon rediction algoritmaları ve makine öğrenme yaklaşımları birleştirir. Varyant tahmin algoritmaları ve performansları hakkında daha fazla bilgi içinGhosh, ve ark. 8'e bakın. (i) CADD (kombine ek açıklama bağımlı tükenme): insan SNVs yanı sıra kısa eklemeler ve silme 11 için puanları sağlar 60'tanfazla genomik özellikleri, inşa tümleştirici ek açıklama aracı. (ii) REVEL (nadir exome varyant topluluk öğrenci): entegre bir puan sağlamak için birden fazla varyant patojenite algoritmaları (MutPred, FATHMM, VEST, PolyPhen, SIFT, PROVEAN, MutasyonAssessor, MutasyonTaster, LRT, GERP, SiPhy, phyloP ve phastCons) birleştirir tüm olası insan yanlış algı varyantlarıiçin 34.
    2. İlgi çekici insan geni/proteininin veya MO ortholojisinin daha önce genetik hastalıklarla bağlantılı genlerle/proteinlerle genetik veya fiziksel olarak etkileşime girildiğini belirleyin. Eğer öyleyse, ilgi hasta bu bozukluklar ile örtüşen fenotipler sergiler eğer değerlendirin.
      NOT: MO yayınlarına dayalı genetik ve protein-protein etkileşimlerini ve birden fazla tür ekranından gelen büyük ölçekli proteomikleri analiz etmek için çeşitli araçlar geliştirilmiştir. STRING (komşu genlerin yinelenen örnekleri için arama aracı)35: bilinen ve tahmin protein-protein etkileşimleri için bir veritabanı. Genetik etkileşim ve ortak ifade veri kümelerinin yanı sıra çeşitli organizmalarda birlikte çalışabilen gen ve proteinleri tanımlamak için metin madenciliği araçlarını da entegre eder. MIST (moleküler etkileşim arama aracı)36: çekirdek genetik MOs (maya, C. elegans, Drosophila,zebrabalığı, kurbağa, sıçan, fare) ve insanlardan gelen genetik ve protein-protein etkileşim verilerini birleştiren bir veritabanı. Ortologgenlerden/proteinlerden (interlogs) kaynaklanan etkileşimlerin tahmini de görüntülenir.
    3. İlgi çekici proteinin 3-B yapısının çözülüp çözülmediğini veya modellendiğini belirleyin. Bu durumda, önemli işlevsel etki alanlarıile göre ilgi alanı nın varyantının nerede olduğunu belirleyin.
      NOT: X-ışını kristalografisi, nükleer manyetik rezonans (NMR) ve kriyo-elektron mikroskobu ile çözülen protein yapıları PDB (protein veri bankası) ve EMDatabank37dahil olmak üzere genel veritabanlarında bulunabilir. Tahmin edilen/modellenmiş protein yapıları için tek bir veritabanı olmamasına rağmen, kullanıcıların protein modellemesi yapabilmeleri için bir dizi algoritma (yani, SWISS-MODEL38, Model39ve Phyre240)mevcuttur.
  3. Bölüm 1.1-1.2'deki bilişim analizlerinden elde edilen bilgileri tartışmak için klinik işbirlikçilerle iletişim kurun. Klinik işbirlikçiler de varyant ve ilgi gen hastada görülen fenotipleri açıklamak için iyi adaylar olduğunu düşünüyorsanız, bölüm 2'ye devam edin. Hastanın genotip ve fenotip hakkında özel sorular varsa, ilerlemeden önce klinik işbirlikçileri ile bunları tartışın.
    NOT: İlgi varyantının ilginin fenotipini açıklama olasılığının düşük olduğu hissedilirse (örneğin, kontrol popülasyonunda yüksek frekansta bulunan özdeş varyant), varyantın iyi olup olmadığını belirlemek için bunu klinik işbirlikçilerle görüşür klinik fenotipleri yorumlamak için uygun uzmanlık olmayabilir.

2. Mevcut Genetik Araçların Toplanması ve İlginin Belirli Bir Varyantını İncelemek Için Yeni Reaktiflerin Oluşturulması

NOT: İlgi varyantı belirlendikten sonra deneysel olarak takip etmek, vivo fonksiyonel çalışmalar yapmak için reaktif toplamak veya oluşturmak için iyi bir aday dır. Bu protokolde açıklanan fonksiyonel çalışmalar için, bazı anahtar Drosophila melanogaster reaktiflere ihtiyaç vardır: 1) referans veya varyant dizisini taşıyan upstream aktivasyon dizisi düzenlenmiş insan cDNA transgenik suşları, 2) fonksiyon kaybı ilgi bir sinek gen in alel ve 3) kurtarma deneyleri için kullanılabilecek bir GAL4 hattı.

  1. UAS-insan cDNA yapıları ve transgenik sineklerin üretimi
    1. Uygun insan cDNA yapılarını tanımlayın ve elde edin. Birçok klonlar MGC mevcuttur (memeli gen koleksiyonu)43 ve seçilen venders satın alınabilir. Alternatif olarak birleştirilmiş genler için, hangi isoform cDNA'nın Ensembl veya RefSeq kullanılarak karşılık geldiğini kontrol edin.
      NOT: Birçok cDNA rekombinaz aracılı klonlama sistemi uyumlu reaktifler mevcuttur44, hangi subklonlama adımı kolaylaştırır. cDNA'lar "açık (stop kodonu yok)" veya "kapalı (endojen veya yapay stop kodonu ile)" biçiminde gelebilir. Açık klonlar biyokimyasal (örneğin, batı leke) ve hücre biyolojik (örneğin, immünboyama) için yararlı proteinlerin C'-etiketleme izin ilgi protein ekspresyonu izlemek için, bazı durumlarda protein fonksiyonu ile müdahale edebilir.
    2. Drosophila transgenik vektöriçine referans ve varyant cDNA alt klon. ΦC31 aracılı transgenez sistemini kullanın, çünkü bu referans ve varyant cDNA'ların genom45'teaynı konuma entegre edilmesine izin verir. Bu proje için, MOSC Drosophila Core rutin pGW-HA.attB vektör46kullanır.
      NOT: Eğer insan cDNA'sı rekombinaz aracılı klonlama sistemi uyumlu vektörlerde (örneğin, pDONR221, pENTR221) varsa, cDNA'ları pGW-HA.attB'ye sokmak için LR reaksiyonlarını açıklayan bölüm 2.1.4'e atlayın.
      1. Eğer insan cDNA'sı rekombinaz aracılı klonlama sistemi uyumlu plazmid de değilse, standart moleküler biyolojik teknikler kullanarak insan CD'lerini Gateway giriş vektörüne sokmayın (bu protokolün bir örneği aşağıda belgelenmiştir).
        1. AttB1 ve attB2 kollarını tanıtmak için bir çıkıntı PCR gerçekleştirin. İleri astar attB1 dizisi 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAAAAAGCAGGCTTCACC-3' hedef cDNA ilk 22 nükleotit ler takip olmalıdır. Ters astar attB2 dizisi 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTA-3' ilgi cDNA son 25 nükleotit ters kompleman takip olmalıdır. CDNA'nın dur kodonunu hariç tonu, bir klon "açmak" isteniyorsa C' etiketi ekleyin veya bir klon "kapatmak" için bir stop kodonu ekleyin.
        2. 50 μL yüksek kaliteli PCR ana karışımı, 36 μL distile su, adım 2.1.2.1.1 ile seyreltilmiş 2.1.2.1.1 adımda listelenen her bir ileri ve ters astardan oluşan 100 μL'lik yüksek kaliteli PCR karışımı (150 ng/μL) hazırlayın.
        3. İlgi cDNA üzerine attB1 ve attB2 silah eklemek için standart mutagenez protokolü kullanarak PCR gerçekleştirin. Koşullar, yapıya ve ilginin varyantlarına bağlı olarak değişir.
        4. Jel elektroforez ve jel ekstraksiyon uğrama yoluyla ilave homoloji kolları ile hedef cDNA izole. % 1 agarose jel oluşturun ve standart yöntemlerle elektroforez gerçekleştirin. CDNA'nın büyüklüğüne ve homoloji kollarının ek uzunluğuna karşılık gelen bandı boşaltın. Standart yöntemlerle jelDNA ayıklayın95. Ticari jel çıkarma kitleri çeşitli şirketlerden temin edilebilir.
        5. Kullanılan sisteme göre rekombinaz aracılı klonlama protokolüne dayalı in vitro rekombinaz reaksiyonu gerçekleştirin.
        6. BP reaksiyon karışımını kimyasal olarak yetkin E. coli hücrelerine dönüştürün. Yetkili hücreler şirket içinde yapılabilir veya ticari satıcılardan satın alınabilir. Kültür koloni seçimi için uygun antibiyotikler içeren bir LB plaka üzerinde bir gecede dönüştürülmüş hücreleri. Ertesi gün, birkaç koloni seçin ve bir gecede bağımsız sıvı kültürlerde onları büyümek.
        7. DNA'yı miniprep aracılığıyla gece kültürlerinden izole edin. Sanger dizisi pozitif klonlar cDNA doğru sıra96 olduğundan emin olmak için . -80 °C'de depolanan %25 gliserolde istenilen diziiçin pozitif olan kültürlerden hücreleri koruyun.
    3. Referans insan cDNA97ile Gateway plazmid içine ilgi varyantı tanıtmak için site yönettiği mutagenezi gerçekleştirin. Bu yöntem için ayrıntılı bir protokol satıcının web sitesinde bulunabilir48,49. Bu mutagenez adımı ile tanıtılan ek varyantlar olmadığından emin olmak için tüm açık okuma çerçevesi (ORF) Sanger sıralama yoluyla mutasyona uğramış plazmid varyantvarlığını doğrulayın.
    4. Bir LR klonaz reaksiyonu ile transgenik plazmid (örneğin, pGW-HA.attB attR1 ve attR2 siteleri) içine donör plazmid (attL1 ve attL2 siteleri ile Gateway plazmid) referans ve varyant insan cDNA'ları subclone.
      NOT: Konvansiyonel konstrasyon enzim bazlı subklonlama (örneğin, pUAST.attB50) için tasarlanmış UAS φC31 vektörleri vardır.
    5. UAS-insan cDNA transgenlerini entegre etmek için φC31 yerleştirme alanlarını seçin. Yerleştirme siteleri bir dizi çeşitli laboratuvarlar tarafından oluşturulan ve stok merkezleri50,52,53kamuya açıktır.
      NOT: İlgi geninin sinek ortoloğunu içermeyen bir kromozomüzerinde insan transgeninin olması uygun olduğundan, sinek ortologu X'te yken ikinci bir kromozom yerleştirme alanı [VK37 (BDSC stok #24872] kullanılması tavsiye edilir. , üçüncü veya dördüncü kromozomlar, ve sinek ortholog ikinci kromozom üzerinde ise üçüncü bir kromozom yerleştirme sitesi [VK33 (BDSC stok #24871] kullanın.
    6. UAS-insan cDNA yapılarını mikroplarında φC31 integrase ifade eden sineklere enjekte edin (örn. vas-φC31, nos-φC31).
      NOT: Mikroenjeksiyon şirket içinde yapılabilir veya transgenez için çekirdek tesislere veya ticari kuruluşlara gönderilebilir. Transgenik sinekler üretmek için ayrıntılı protokol atıf kitap bölüm51bulunabilir.
    7. Enjekte edilen embriyolardan kararlı transgenik suşlar oluşturmak. Yapı94başına ~100-200 embriyo enjekte edin. İkinci bir kromozom yerleştirme alanına (VK37) transgen yerleştirme için temsili bir geçiş şeması Şekil 1A'da gösterilmiştir. Temel Drosophila genetik bilgi için atıf kitaplar54,55 bakın.
  2. Kurtarma tabanlı fonksiyonel tahlilleri kolaylaştıran bir T2A-GAL4 hattı edinin veya oluşturun (bkz. Şekil 2 ve bölüm 3.1).
    NOT: Bu satır iki amacla hizmet edecektir. İlk olarak, test edilen çoğu T2A-GAL4 hattı gen kapanı alel olarak çalışarak güçlü LOF alelleri gibi çalışır. İkinci olarak, T2A-GAL4 hatları, ilgi geninin endojen düzenleme elemanları altında UAS yapılarının (örneğin UAS-GFP, UAS-human CNA'ları) ifade sini sağlayan bir GAL4 sürücüsü olarak işlev görür56,57 (Şekil 2A-C).
    1. Drosophila Gen Bozulması Projesi (GSYİh)58 hangi ~ 1.000 T2A-GAL4 hatları59oluşturulmuş olan dahil olmak üzere mevcut T2A-GAL4 hatları için kamu stok koleksiyonları arayın. Bu suşlar şu anda Bloomington Drosophila Stok Merkezi (BDSC) mevcuttur ve GSYİh ve BDSC web siteleri hem de aranabilir.
    2. İlgi çeken sinek geni için bir T2A-GAL4 hattı yoksa, rekombinasearacılı kaset değişimi (RMCE) kullanılarak T2A-GAL4 hattına dönüştürülmek için uygun bir kodlama intronic MiMIC (Minos-aracılı entegrasyon kaseti) hattının kullanılabilir olup olmadığını kontrol edin )60 (Şekil 2A).
      NOT: RMCE, iki kodlama ekzosu arasında yer alan intronik MiMIC elemanlarının bir donör yapının mikroenjeksiyonu ile T2A-GAL4 hattına dönüştürülmesini sağlar (Şekil 1B'de bir geçiş şeması örneği gösterilir) veya haçlar, ayrıntılı olarak açıklandığı gibi57,59.
    3. Bir T2A-GAL4 hattı mevcut değilse ve uygun bir kodlama intronic MiMIC yoksa, CRIMIC (CRISPR aracılı entegrasyon kaseti) sistemi 59üzerinden bir T2A-GAL4 hattı oluşturma olasılığını keşfedin.
      NOT: Bu metodoloji, mimic benzeri bir kaseti ilgi çeken bir gende kodlama intronuna entegre etmek için CRISPR aracılı DNA dekoltesi ve homoloji ye yönelik onarımı (HDR) kullanır.
    4. İlgi geni büyük bir intron yoksunsa (>150 bp) veya intronları yoksa, açıklandığı gibi HDR 20 ,61,62kullanarak CRISPR/Cas9 sistemi ile bir GAL4 transgeni sinek genine çarpmaya çalış .
      NOT: Bir T2A-GAL4 veya GAL4 knock-in alel üretimi zorsa,92 (REF) tanımlandığı gibi bu önceden varolan aleller veya RNAi hatları ve her yerde veya dokuya özgü GAL4 sürücüleri kullanarak kurtarma deneyleri yapmaya çalışın.

3. Drosophila'da Vivo'daki İnsan Varyantının Fonksiyonel Analizinin Analizi

NOT: Drosophila'davivo'ya ilgi nin varyantının sonuçlarını değerlendirmek için bölüm 2'de toplanan veya oluşturulan araçları kullanarak kurtarma tabanlı analiz (bölüm 3.1) ve aşırı ifade çalışmaları (bölüm 3.2) gerçekleştirin. Her iki yaklaşımdan da yararlanmayı düşünün, çünkü ikisi birbirini tamamlıyor.

  1. Kurtarma tabanlı deneyler le fonksiyonel analiz yapmak
    Not: Heterolog kurtarma tabanlı deneylerDrosophilainsan proteinlerinin kullanılması, iki ortolog genin moleküler işlevinin ~500 milyon yıllık evrimin içinde korunup korunmadığını belirler. Ayrıca insan proteini bağlamında varyantın işlevini de değerlendirirler.63. Yüzlerce gen çiftini inceleyen sistematik bir analiz rapor edilmese de, birkaç düzine insan ve memeli (örneğin, fare) genlerininDrosophilaGen13.
    1. Kurtarma tabanlı yaklaşımda, varyantların işlevlerini değerlendirmeden önce, ilk olarak sinek ortologundaki LOF mutantlarında açık, korunabilir ve tekrarlanabilir fenotipler olup olmadığını belirleyin.
      NOT: Sinek geni ile ilgili önceki literatür, önce veri madeni için iyi bir yerdir ve FlyBase ve PubMed gibi veritabanları kullanılarak bulunabilir. MARRVEL, Monarch Initiative ve Gene2Funcion gibi ek veritabanları da bu bilgilerin toplanmasında yararlıdır.
    2. Homozigot ve hemizygous (T2A-GAL4 alel moleküler tanımlanmış kromozom eksikliği hayvanlar üzerinde, özellikle T2A-GAL4 alel belirli bir gen için karakterize ilk mutasyon ise, korunabilir fenotipler küresel bir anket gerçekleştirin. Öldürücülük, kısırlık, uzun ömür, morfolojik (örneğin, gözün büyüklüğü ve morfolojisi) ve davranışı (örn. kur yapma, uçuş, tırmanma ve patlama hassasiyeti kusurları) gibi fenotipleri değerlendirin.
      NOT: Bu primer ekrandan saptanan majör fenotip yoksa, elektrofizyolojik kayıtlarla ölçülen nörolojik bozukluklar gibi daha ince fenotipler, yüksek oranda tekrarlanabilir ve spesifik ise kullanılabilir. Örnek olarak, elektroretinogram (ERG) kullanılarak yapılan fonksiyonel çalışmalar 3.2.3. Herhangi bir çatlanabilir fenotip tespit edilememesi durumunda, bölüm 3.2'ye geçin ve aşırı ifade tabanlı fonksiyonel çalışmayı gerçekleştirin.
    3. Bir kez scorable fenotip sinek LOF mutant tespit edilir, referans insan cDNA mutant sinek hattı kurtarmak için insan cDNA kullanmaya çalışarak sinek ortholog işlevini değiştirip değiştiremeyeceğini test edin. Burada yapılacak olan henotibik tahkikat, 3.1.2.adımın sonuçlarına bağlıdır ve incelenmekte olan genin spesifik olacaktır.
      NOT: Sinek geninin "insancıllaşması" başarılı olursa, artık referans muadili ile karşılaştırıldığında ilgi varyantı için kurtarma verimliliğini karşılaştırmak için bir platform vardır. Referans insan cDNA ile görülen kurtarma mükemmel olmak zorunda değildir. Bir insan cDNA kullanarak sinek mutant fenotip kısmi kurtarma hala varyant insan cDNA suş kullanarak karşılaştırmalı çalışmalar yapmak için bir referans noktası sağlar.
    4. Adım 3.1.2'de seçilen test sistemini kullanarak, gözlenen kurtarma ile gözlenen kurtarma yı, ilgi nin varyantının ilgi geni üzerinde sonuçları olup olmadığını belirlemek için insan cDNA'sı ile gözlenen kurtarma ile karşılaştırın.
      NOT: Varyant insan cDNA referans alel daha kötü gerçekleştirir, bu ilgi varyantı protein fonksiyonu için zararlı olduğunu göstermektedir. Varyant ve referans işlevsel olarak ayırt edilemiyorsa, o zaman 1) alel bir izomorf (protein fonksiyonunu etkilemeyen bir varyant) veya 2) tetkik ince farklılıkları tespit etmek için yeterince hassas değildir.
    5. Varyant zararlı bir alel olduğu tespit edilirse, daha sonra daha fazla ifade ve batı leke, immünükopesans boyama, ya da diğer yöntemler le vivo ilgi referans ve varyant proteinlerin hücre içi lokalizasyon değerlendirmek93.
      NOT: Eğer UAS-insan cDNA bir pGW-HA.attB vektörü açık bir klon dan oluşturulur, bu biyokimyasal ve hücresel tahlilleri gerçekleştirmek için bir anti-HA antikor kullanın. Orijinal klon kapalı bir klon ise, insan proteinlerine karşı ticari antikorlar bu tahliller için kullanılabilir olup olmadığını test edin. İfade düzeyleri ve hücre içi lokalizasyon farkı, ilgi varyantının protein fonksiyonunu nasıl etkilediğini ortaya çıkarabilir.
  2. Aşırı ifade çalışmaları ile fonksiyonel analiz yapmak
    NOT: Aksi takdirde yabani sineklerde insan CD'lerinin her yerde veya dokuya özgü aşırı ekspresyonu, bölüm 3.1'de tartışılan kurtarma temelli deneyleri tamamlayıcı olan bilgiler sağlayabilir. Kurtarma tabanlı tahliller öncelikle LOF varyantlarını (amorfik, hipomofik) saptamak için tasarlanmış olsa da, aşırı ekspresyon tabanlı tahliller de değerlendirmek daha zor olan işlev kazanım (GOF) varyantları ortaya çıkarabilir (hipermorfik, antimorfik, neomorfik).
    1. İlgi çekici insan cdNA'larını aşırı ifade etmek için gal4 sürücüleri kümesini seçin. Her yerde bulunan ve dokuya/evreye özgü GAL4 sürücüleri, bazıları diğerlerinden daha sık kullanılan kamu stok merkezlerinden (örneğin, BDSC) temin edilebilir. Önce her yerde bulunan sürücülere ve kolayca çatlabilen fenotiplere (öldürücülük, sterilite, morfolojik fenotipler) odaklanın, sonra dokuya özgü sürücülere ve daha spesifik fenotiplere geçin.
      NOT: Denemelerde kullanılmadan önce ifade desenlerini onaylamak için GAL4 sürücülerinin ifadesini bir muhabir satırıyla (örneğin, UAS-GFP) doğrulayın.
    2. Aynı koşulda aynı sürücüyü kullanarak referans ve varyant insan CDNA'larını (örn. sıcaklık) GAL4 hattından 3-5 bakire dişiyi geçerek (örn. göz hayali disk ekspresyonu için ey-GAL4) UAS hatlarından 3-5 erkek sinek ile ifade edin [örn. Bölüm 4.2'de gösterilen örnek için Tek bir şişede UAS-TBX2(+) veya UAS-TBX2(p.R305H).
      1. Tek bir haç tan eclosing birçok hayvan için her 2-3 günde bir haç transfer.
    3. Bir diseksiyon mikroskobu altında döllenmiş soyundan gelenleri inceleyin ve referans ve varyant suşları (örneğin, göz morfolojisi) arasındaki farkları tespit edin. Fenotip belgelemek için bir diseksiyon mikroskobuna bağlı bir kamera kullanarak sinekler görüntü.
      NOT: Bir fenotip sadece referansta görülürse, ancak varyant satırında görülmezse, varyant amorfik veya güçlü bir hipomorfik alel olabilir. Fenotip her iki genotipte de görülürse ancak referans daha güçlü bir defekte neden oluyorsa, varyant hafif-zayıf hipomorfik alel olabilir. Başvuru fenotip göstermiyorsa veya sadece zayıf bir fenotip gösteriyorsa, ancak varyant güçlü bir kusur gösteriyorsa, varyant GOF alel olabilir.
    4. Standart kültür koşullarında (RT veya 25 °C'de) bir fenotip görülmüyorsa, UAS/GAL4 sisteminin ısıya duyarlıolduğubilindiği için haçları 18-29 °C arasında değişen farklı sıcaklıklardaayarlayın. Tipik olarak, UAS transgenes ekspresyonu daha yüksek sıcaklıklarda daha yüksektir.
  3. Genler ve ilgi proteinile ilgili ek fonksiyonel çalışmalar yapın.
    Not: Genel kusurların incelenmesine ek olarak, gen ve varyantın moleküler fonksiyonlarını araştırmak için bir bir araştırma sistemi seçilebilir. Temsili sonuçlarda tartışılan bir örnekte (TBX2olgu), ERG kayıtları, varyantın fotoreseptör fonksiyonu üzerindeki etkilerini belirlemek için kullanılmıştır, çünkü ilgi nin sinek geni (bifid) görsel sistem gelişimi bağlamında kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. ERG için ayrıntılı protokollerDrosophiladaha önce yayınlanmış olarak bulunabilir66,67,68.
    1. Görsel sistemdeki işlevsel hataları test etmek için sinekler oluşturun. R1-R6 fotoreseptörlerinde insan proteinlerini ifade etmek için referans veya varyant UAS-insan cDNA transgenes ile erkeklere Rodopsin 1 (Rh1)-GAL4 hattından çapraz bakire dişiler.
      NOT: 3-5 bakire dişiden 3-5 erkek tek bir şişede sinekler ile çapraz uçarak her 2-3 günde bir haçları tek bir haçtan eclosing için aktarın. Tutarlı sonuçlar elde etmek için tüm haçlar deneysel sıcaklıkta bir kuvözde tutulmalıdır.
    2. Sinekler kapanmaya başladıktan sonra (ilk haçı ayarladıktan 10 gün sonra 25 °C'de, ~10 gün sonra) soyundan gelenleri toplarlar(Rh1-GAL4/+; UAS-insan cDNA /+) taze şişeler içine ve görme sisteminin olgunlaşması için ek bir 3 gün boyunca deneysel sıcaklıkta belirlenen inkübatör e tekrar yerleştirin.
      NOT: ERG 1-2 günlük sineklerde yapılabilse de, yeni e-kapalı sineklerin ERG sinyallerinde büyük dalgalanmalar olabilir. Yaşa bağlı bir fenotip incelemek isteniyorsa, bu sinekler düzenli olarak (örneğin, her ~5 günde bir) ıslak gıdalarda boğulmayı önlemek için yeni bir şişeye aktarıldığı sürece birkaç hafta yaşlanabilir.
    3. Sinekleri ILK olarak CO2 kullanarak veya buz üzerinde bir şişeye yerleştirerek ERG kaydı için hazırlayın. Yavaşça onları hareketsizleştirmek için bir cam mikroskop slayt üzerine sinek bir tarafı yapıştırın.
      NOT: Çoklu referans ve varyant sinekler tek bir slayt üzerine yapıştırılmış olabilir. Kayıt elektrotiçin tek göz erişilebilir olan yaklaşık aynı yönde tüm sinekler yerleştirin. Göze tutkal almak ve hortum ücretsiz bırakmak için dikkatli olun.
    4. Kayıt ve referans elektrotlarını hazırlayın. Bir iğne çekmeceiçine 1,2 mm cam kılcal yerleştirin ve etkinleştirin. İki keskin konik elektrot elde etmek için kılcal tüpü kırın. Ortaya çıkan elektrotlar boş olmalı ve son çapları <0.5 mm olmalıdır.
    5. Kılcal damarları tuzlu çözelti (100 mM NaCl) ile doldurun ve hava kabarcıkları olmadığından emin olun. Cam kılcal damarları gümüş tel elektrotların üzerine kaydırın (hem kayıt elektrodu hem de referans elektrot, bkz. Şekil4) ve kılcal damarları yerinde sabitle.
    6. Uyarıcı ve amplifikatör yapılandırır. Ayrıntılı bir kurulum Lauwers, ve ark.67 bulunabilir. UDN Drosophila MOSC kurulumu, malzeme bölümünde listelenen ekipmanlardan oluşmaktadır.
      1. Amplifikatörün 0,1 Hz yüksek geçiş filtresi, 300 Hz düşük geçiş filtresi ve 100 kazanç olarak ayarlayın.
      2. Uyarıcıyı 1 s periyodu, 500 ms darbe genişliği, 500 ms darbe gecikmesi, çalışma modu ve 7 Amp'e ayarlayın.
      3. Işık kaynağını fotostimülasyona hazırlayın. Sinek fotoreseptörlerini etkinleştirmek için halojen ışık kaynağı kullanın.
      4. Kayıt yazılımını ERG kurulumuna bağlı bir bilgisayarda hazırlayın. Edinme modeli "sabit uzunlukta olaylar" ve 20 s süresi ile bir uyarım protokolü oluşturun.
    7. ERG kayıtlarını başlatmadan önce sinekleri karanlığı tamamlamak için alıştırın. Denemeye başlamadan önce sinekleri en az 10 dakika boyunca karanlığa yerleştirin.
      NOT: Sinekler kırmızı ışığı algılayamadığıiçin, karanlık alışma döneminde kırmızı ışık kaynağı kullanın.
    8. Sinekleri içeren kaydırağı kayıt cihazına yerleştirin ve referans ve kayıt elektrotlarını taşıyan mikromanipülatörleri slayttaki ilgi sineğine yakın bir noktaya taşıyın. Elektrotun ucunu izleyin ve referans elektrotunu dikkatlice sineğin toraksına yerleştirin (miteyi delin). Referans elektrot sert bir şekilde yerleştirildikten sonra, kayıt elektrotunun göz yüzeyine yerleştirin.
      NOT: Bu referans elektrotun tam konumu ERG sinyali üzerinde büyük bir etkiye sahip değildir. ERG hücre içi kayıt tan ziyade bir alan potansiyeli kaydı olduğundan kayıt elektrodu gözün yüzeyine yerleştirilmelidir. Kayıt elektrotuna uygulanan uygun basınç miktarı göze girmeden küçük bir gamzeye neden olur.
    9. Karanlık ortama sinekler acclimate için başka bir 3 dakika için tüm ışıkları kapatın.
    10. Kayıt yazılımını ayarlayın ve sinyali kaydetmeye başlayın. Manuel deklanşörlü halojen ışık kaynağı kullanıyorsanız, deklanşör kapalı ışık kaynağını açın. Sinyali kaydetmeye başla.
    11. Tek bir koşunun 20 s süresi boyunca deklanşörü her 1'de bir açıp kapatarak sinek gözlerini ışığa maruz bırak.
      NOT: Halojen ışık kaynağının açık/kapalı kullanımı manuel olarak kontrol edilebilir veya beyaz LED ışık kaynağı kullanılarak otomatikleştirilmeye programlanabilir. Daha sağlam ve güvenilir ERG beyaz ışık LED ile karşılaştırıldığında bir halojen ışık kaynağı kullanılarak elde edilebilir, halojen ışık kaynağından yayılan geniş ışık spektrumu nedeniyle büyük olasılıkla.
    12. Cam kaydırağa monte edilen tüm sineklerden ERG'leri kaydedin. Durum başına genotip başına 15 sinekten ERG'leri gerçekleştirin.
      NOT: Referans ve varyant CDNA'ları arasında sağlam farklar gösteren bir durum bulmak için değiştirilebilen bazı parametreler sıcaklık, yaş veya çevre koşullarını içerebilir (örn. açık-koyu çevrimde veya sabit ışık/karanlıkta yetiştirilen).
    13. Veri analizi gerçekleştirin: Fark olup olmadığını belirlemek için referans, varyant ve denetimlerden ERG'leri karşılaştırın. ErG verilerini geçici değişiklikler, depocuizasyon, geçici olmayan lar ve repolarizasyon69 için değerlendirin (Şekil 4B).
      NOT: Depolarizasyon ve repolarizasyon fotoreseptörler içinde fototransdüksiyon kaskad aktivasyonu ve inaktivasyonu yansıtır, on- ve off-transients sinyalleri alan post-sinaptik hücrelerin faaliyetlerinin ölçüleri ise fotoreseptörler. Repolarizasyonda azalmış genlik ve değiştirilmiş kinetikler genellikle fotoreseptör fonksiyonu ve sağlığı ile ilgili bozukluklarda bulunurken, transeksyen ve geçici bozukluklar kusurlu sinaps gelişimi, fonksiyonu veya bakımı olan mutantlarda bulunur. 70'e kadar.
    14. ERG fenotiplerindeki farklılıkların referans ve varyant insan cDNA'larının aşırı ekspresyonu ile belirlenmesi üzerine, bu elektrofizyolojik fenotipin fotoreseptörlerdeki yapısal ve ultrayapısal bozukluklarla ilişkili olup olmadığını ve histolojik analiz ve iletim elektron mikroskopisi yaparak sinapslar.
      NOT: ERG kusurlarının yorumlanması ve yapısal/ultrayapısal analiz ler hakkında daha fazla tartışma daha önce69olarak tanımlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nörogelişimsel Fenotilere Bağlı EBF3'te De novo Missense Varyantının Fonksiyonel Çalışması
Hipotoni, ataksi, küresel gelişimsel gecikme ve anlamlı konuşma bozukluğu gibi nörogelişimsel fenotipleri olan 7 yaşındaki bir erkek, Ulusal Sağlık Enstitüleri Tanı konulmamış Hastalıklar Projesi'nde (UDP) hekimler ve insan genetikçileri EBF3'te (Erken B-Hücre Faktörü3) 15'te bir de novo missense varyantı (p.R163Q) saptandırılır, coe (Collier/Olfactory-1/Early B...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster kullanarak deneysel çalışmalar hastalık la ilişkili insan varyantları sonuçlarını değerlendirmek için sağlam bir araştırma sistemi sağlar. Bu bilgi ve son yüzyılda sinek alanında birçok araştırmacı tarafından oluşturulan çeşitli genetik araçların büyük vücut kaynaklanmaktadır89. Diğer deneysel sistem gibi, ancak, var olan uyarılar ve sınırlamalar kabul etmek önemlidir.

Veri Madenciliği ile İlişkili Uyarılar
Bu protoko...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jose Salazar, Julia Wang ve Dr. Karen Schulze'ye el yazmasının eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Dr. Ning Liu ve Xi Luo'yu burada tartışılan TBX2 varyantlarının fonksiyonel karakterizasyonu için kabul ediyoruz. Teşhis Edilemeyen Hastalıklar Ağ Modeli Organizmatarama Merkezi, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Ortak Fonu (U54 NS093793) aracılığıyla desteklendi. H. T. C. daha NIH [CNCDP-K12 ve NINDS (1K12 NS098482)], Amerikan Nöroloji Akademisi (Nörobilim Araştırma hibe), Burroughs Wellcome Fonu (Kariyer Ödülü Tıp Bilim Adamları için Kariyer Ödülü), Çocuk Nöroloji Derneği ve Çocuk Nöroloji Vakfı tarafından desteklendi ( PERF Elterman hibe ve NIH Direktörü Erken Bağımsızlık Ödülü (DP5 OD026426). M. F. W. simons Vakfı (SFARI Ödülü: 368479) tarafından daha da desteklenmiştir. S. Y. daha NIH (R01 DC014932), Simons Vakfı (SFARI Ödülü: 368479), Alzheimer Derneği (Yeni Araştırmacı Araştırma Hibe: 15-364099), Naman Aile Fonu Temel Araştırma ve Caroline Wiess Hukuk Fonu araştırma tarafından desteklendi Moleküler Tıp. BCM'de konfokal mikroskopi kısmen NIH Grant U54HD083092 tarafından Entelektüel ve Gelişimsel Engelliler Araştırma Merkezi (IDDRC) Nörogörüntüleme Çekirdeği'ne desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Drosophila UAS-insan cDNA transgenezi için stoklar
Transgenez için enjeksiyon suşları (D. melanogaster)BDSC#24871Spesifik Reaktif: VK33 (3. kromozom) Transgenez için enjeksiyon hattı
Enjeksiyon suşları (D. melanogaster)BDSC#24872Spesifik Reaktif: VK37 (2. kromozom) Enjeksiyon hattı
Plazmid DNA
Klonlama vektörüThermo Fisher#12536-017Spesifik Reaktif: pDONR221
Drosophila transgenez vektörüDr. Johannes Bischof ve Konrad Basler'den Hediye (Bischof ve diğerleri, 2013 PNAS)Spesifik Reaktif: pGW-HA.attB
Moleküler biyoloji kitleri ve reaktifleri < / güçlü >
AgaroseSigma-Aldrich#A2790Spesifik Reaktif: Agaroz (moleküler biyoloji sınıfı)
Kimyasal Olarak Yetkin Hücreler ( coli < / em >)Thermo Fisher# 18265017Spesifik Reaktif: DH5 ve alfa;
DNA Jel Ekstraksiyon kitiThermo Fisher#K210012Spesifik Reaktif: PureLink Jel Ekstraksiyon Kiti
DNA İzolasyonu ve saflaştırma kitiQiagen# 27104Spesifik Reaktif: QIAprep Spin Miniprep Kiti
Yüksek Sadakatli PolimerazNEB#M0491Spesifik Reaktif: Q5 Polimeraz kiti
Rekombinaz aracılı klonlama sistemiThermo Fisher# 11789020Spesifik Reaktif: Ağ Geçidi BP Klonaz kiti
Rekombinaz aracılı klonlama sistemiThermo Fisher# 11791100Spesifik Reaktif: Ağ Geçidi LR Klonaz II Enzim kiti
Siteye Yönlendirilmiş Mutajenez kitiAgilent# 200523Spesifik Reaktif: Hızlı Değişim II Mutajenez kiti
< güçlü > Elektroretinogram Teçhizatı ile ilgili ekipman< / güçlü >
ERG AnaliziMoleküler CihazlarN/ASpesifik Reaktif: Axon pCLAMP 10 Veri Yazılım Paketi
ERG Veri ToplamaLabX#R150358Spesifik Reaktif: ISO-DAM İzole Biyolojik Amplifikatör
ERG StimülatörüAstro-Med#S48Spesifik Reaktif: Kare Nabız Stimülatörü

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boycott, K. M., et al. International Cooperation to Enable the Diagnosis of All Rare Genetic Diseases. The American Journal of Human Genetics. 100 (5), 695-705 (2017).
  2. Lupski, J. R., et al. Whole-Genome Sequencing in a Patient with Charcot-Marie-Tooth Neuropathy. New England Journal of Medicine. 362 (13), 1181-1191 (2010).
  3. Boycott, K. M., Vanstone, M. R., Bulman, D. E., MacKenzie, A. E. Rare-disease genetics in the era of next-generation sequencing: discovery to translation. Nature Reviews Genetics. 14 (10), 681-691 (2013).
  4. Yang, Y., et al. Molecular Findings Among Patients Referred for Clinical Whole-Exome Sequencing. JAMA. 312 (18), 1870(2014).
  5. Lee, H., et al. Clinical Exome Sequencing for Genetic Identification of Rare Mendelian Disorders. JAMA. 312 (18), 1880(2014).
  6. Coban-Akdemir, Z., et al. Identifying Genes Whose Mutant Transcripts Cause Dominant Disease Traits by Potential Gain-of-Function Alleles. The American Journal of Human Genetics. 103 (2), 171-187 (2018).
  7. Muller, H. J. Further studies on the nature and causes of gene mutations. Proceedings of the Sixth International Congress of Genetics. , 213-255 (1932).
  8. Ghosh, R., Oak, N., Plon, S. E. Evaluation of in silico algorithms for use with ACMG/AMP clinical variant interpretation guidelines. Genome Biology. 18 (1), 225(2017).
  9. Adzhubei, I. A., et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nature Methods. 7 (4), 248-249 (2010).
  10. Vaser, R., Adusumalli, S., Leng, S. N., Sikic, M., Ng, P. C. SIFT missense predictions for genomes. Nature Protocols. 11 (1), 1-9 (2016).
  11. Rentzsch, P., Witten, D., Cooper, G. M., Shendure, J. l, Kircher, M. CADD: predicting the deleteriousness of variants throughout the human genome. Nucleic Acids Research. , (2018).
  12. Choi, Y., Sims, G. E., Murphy, S., Miller, J. R., Chan, A. P. Predicting the functional effect of amino acid substitutions and indels. PloS ONE. 7 (10), 46688(2012).
  13. Wangler, M. F., et al. Model Organisms Facilitate Rare Disease Diagnosis and Therapeutic Research. Genetics. 207 (1), 9-27 (2017).
  14. Oriel, C., Lasko, P. Recent Developments in Using Drosophila as a Model for Human Genetic Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2041(2018).
  15. Chao, H. T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  16. Oláhová, M., et al. Biallelic Mutations in ATP5F1D, which Encodes a Subunit of ATP Synthase, Cause a Metabolic Disorder. American Journal of Human Genetics. 102 (3), 494-504 (2018).
  17. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  18. Marcogliese, P. C., et al. IRF2BPL Is Associated with Neurological Phenotypes. American Journal of Human Genetics. 103 (2), 245-260 (2018).
  19. Ferreira, C. R., et al. A Recurrent De Novo Heterozygous COG4 Substitution Leads to Saul-Wilson Syndrome, Disrupted Vesicular Trafficking, and Altered Proteoglycan Glycosylation. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 553-567 (2018).
  20. Kanca, O., et al. De novo variants in WDR37 are associated with epilepsy, colobomas and cerebellar hypoplasia. Americal Journal of Human Genetics. , Forthcoming (2019).
  21. Luo, X., et al. Clinically severe CACNA1A alleles affect synaptic function and neurodegeneration differentially. PLOS Genetics. 13 (7), 1006905(2017).
  22. Chung, H., et al. ACOX1 induces autoimmunity whereas a de novo gain of function variant induces elevated ROS and glial loss in humans and flies. Cell Metabolism. , Forthcoming (2019).
  23. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159 (1), 200-214 (2014).
  24. Jakobsdottir, J., et al. Rare Functional Variant in TM2D3 is Associated with Late-Onset Alzheimer's Disease. PLoS Genetics. 12 (10), 1006327(2016).
  25. Yoon, W. H., et al. Loss of Nardilysin, a Mitochondrial Co-chaperone for α-Ketoglutarate Dehydrogenase, Promotes mTORC1 Activation and Neurodegeneration. Neuron. 93 (1), 115-131 (2017).
  26. Harel, T., et al. Recurrent De Novo and Biallelic Variation of ATAD3A, Encoding a Mitochondrial Membrane Protein, Results in Distinct Neurological Syndromes. American Journal of Human Genetics. 99 (4), 831-845 (2016).
  27. Tan, K. L., et al. Ari-1 Regulates Myonuclear Organization Together with Parkin and Is Associated with Aortic Aneurysms. Developmental Cell. 45 (2), 226-244 (2018).
  28. Ansar, M., et al. Visual impairment and progressive phthisis bulbi caused by recessive pathogenic variant in MARK3. Human Molecular Genetics. 27 (15), 2703-2711 (2018).
  29. Ansar, M., et al. Bi-allelic Loss-of-Function Variants in DNMBP Cause Infantile Cataracts. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 568-578 (2018).
  30. Wang, J., et al. MARRVEL: Integration of Human and Model Organism Genetic Resources to Facilitate Functional Annotation of the Human Genome. The American Journal of Human Genetics. 100 (6), 843-853 (2017).
  31. Wang, J., Liu, Z., Bellen, H., Yamamoto, S. MARRVEL, a web-based tool that integrates human and model organism genomics information. Journal of Visualized Experiments. , Forthcoming (2019).
  32. Mungall, C. J., et al. The Monarch Initiative: an integrative data and analytic platform connecting phenotypes to genotypes across species. Nucleic Acids Research. 45, 712-722 (2017).
  33. Hu, Y., Comjean, A., Mohr, S. E., Perrimon, N., Perrimon, N. Gene2Function: An Integrated Online Resource for Gene Function Discovery. Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2855-2858 (2017).
  34. Ioannidis, N. M., et al. An Ensemble Method for Predicting the Pathogenicity of Rare Missense Variants. The American Journal of Human Genetics. 99 (4), 877-885 (2016).
  35. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein–protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Research. 45 (1), 362-368 (2017).
  36. Hu, Y., et al. Molecular Interaction Search Tool (MIST): an integrated resource for mining gene and protein interaction data. Nucleic Acids Research. 46 (1), 567-574 (2018).
  37. Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Research. 44 (1), 396-403 (2016).
  38. Bienert, S., et al. The SWISS-MODEL Repository-new features and functionality. Nucleic Acids Research. 45 (1), 313-319 (2017).
  39. Webb, B., Sali, A. Comparative Protein Structure Modeling Using MODELLER. Current Protocols in Bioinformatics. 54, 1-37 (2016).
  40. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. E. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).
  41. Bamshad, M. J., et al. The Centers for Mendelian Genomics: A new large-scale initiative to identify the genes underlying rare Mendelian conditions. American Journal of Medical Genetics Part A. 158 (7), 1523-1525 (2012).
  42. Sobreira, N. L. M., et al. Matchmaker Exchange. Current Protocols in Human Genetics. 95, 1-15 (2017).
  43. Temple, G., et al. The completion of the Mammalian Gene Collection (MGC). Genome Research. 19 (12), 2324-2333 (2009).
  44. Katzen, F. Gateway ®Recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opinion on Drug Discovery. 2 (4), 571-589 (2007).
  45. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  46. Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), Cambridge, England. 2434-2442 (2013).
  47. Bischof, J., Sheils, E. M., Björklund, M., Basler, K. Generation of a transgenic ORFeome library in Drosophila. Nature Protocols. 9 (7), 1607-1620 (2014).
  48. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), e1135(2009).
  49. Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2189(2010).
  50. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific C31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3312-3317 (2007).
  51. Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 561, Clifton, N.J. 3-19 (2009).
  52. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  53. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).
  54. Greenspan, R. Fly Pushing: The Thory and Practice of Drosophila Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2004).
  55. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2005).
  56. Diao, F., White, B. H. A Novel Approach for Directing Transgene Expression in Drosophila: T2A-Gal4 In-Frame Fusion. Genetics. 190 (3), 1139-1144 (2012).
  57. Diao, F., et al. Plug-and-Play Genetic Access to Drosophila Cell Types using Exchangeable Exon Cassettes. Cell Reports. 10 (8), 1410-1421 (2015).
  58. Bellen, H. J., et al. The Drosophila Gene Disruption Project: Progress Using Transposons With Distinctive Site Specificities. Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).
  59. Lee, P. -T., et al. A gene-specific T2A-GAL4 library for Drosophila. eLife. 7, (2018).
  60. Venken, K. J. T., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nature Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
  61. Li-Kroeger, D., et al. An expanded toolkit for gene tagging based on MiMIC and scarless CRISPR tagging in Drosophila. eLife. 7, (2018).
  62. Salazar, J. L., Yamamoto, S. Integration of Drosophila and Human Genetics to Understand Notch Signaling Related Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1066, 141-185 (2018).
  63. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit Flies in Biomedical Research. Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).
  64. Duffy, J. B. GAL4 system indrosophila: A fly geneticist's swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  65. Nagarkar-Jaiswal, S., et al. A library of MiMICs allows tagging of genes and reversible, spatial and temporal knockdown of proteins in Drosophila. eLife. 4, (2015).
  66. Dolph, P., Nair, A., Raghu, P. Electroretinogram Recordings of Drosophila. (1), Cold Spring Harbor Protocols. (2011).
  67. Lauwers, E., Verstreken, P. Assaying Mutants of Clathrin-Mediated Endocytosis in the Fly Eye. Methods in Molecular Biology. 1847, Clifton, N.J. 109-119 (2018).
  68. Rhodes-Mordov, E., Samra, H., Minke, B. Electroretinogram (ERG) Recordings from Drosophila. Bio-Protocol. 5 (21), (2015).
  69. Deal, S., Yamamoto, S. Unraveling novel mechanisms of neurodegeneration through a large-scale forward genetic screen in Drosophila. Frontiers in Genetics. , Forthcoming (2019).
  70. Chouhan, A. K., et al. Uncoupling neuronal death and dysfunction in Drosophila models of neurodegenerative disease. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 62(2016).
  71. Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
  72. Liberg, D., Sigvardsson, M., Akerblad, P. The EBF/Olf/Collier family of transcription factors: regulators of differentiation in cells originating from all three embryonal germ layers. Molecular and Cellular Biology. 22 (24), 8389-8397 (2002).
  73. Prasad, B. C., et al. Unc-3, a gene required for axonal guidance in Caenorhabditis elegans, encodes a member of the O/E family of transcription factors. Development. 125 (8), Cambridge, England. 1561-1568 (1998).
  74. Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and Cut Control Different Aspects of Dendrite Cytoskeleton and Synergize to Define Final Arbor Shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
  75. Pozzoli, O., Bosetti, A., Croci, L., Consalez, G. G., Vetter, M. L. Xebf3 is a regulator of neuronal differentiation during primary neurogenesis in Xenopus. Developmental Biology. 233 (2), 495-512 (2001).
  76. Wang, S. S., Lewcock, J. W., Feinstein, P., Mombaerts, P., Reed, R. R. Genetic disruptions of O/E2 and O/E3 genes reveal involvement in olfactory receptor neuron projection. Development. 131 (6), 1377-1388 (2004).
  77. Fulp, C. T., et al. Identification of Arx transcriptional targets in the developing basal forebrain. Human Molecular Genetics. 17 (23), 3740-3760 (2008).
  78. Gécz, J., Cloosterman, D., Partington, M. ARX: a gene for all seasons. Current Opinion in Genetics & Development. 16 (3), 308-316 (2006).
  79. Dubois, L., Vincent, A. The COE--Collier/Olf1/EBF--transcription factors: structural conservation and diversity of developmental functions. Mechanisms of Development. 108 (1-2), 3-12 (2001).
  80. Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), 21(2012).
  81. Chao, H. -T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  82. Sleven, H., et al. De Novo Mutations in EBF3 Cause a Neurodevelopmental Syndrome. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 138-150 (2017).
  83. Harms, F. L., et al. Mutations in EBF3 Disturb Transcriptional Profiles and Cause Intellectual Disability, Ataxia, and Facial Dysmorphism. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 117-127 (2017).
  84. Tanaka, A. J., et al. De novo variants in EBF3 are associated with hypotonia, developmental delay, intellectual disability, and autism. Molecular Case Studies. 3 (6), 002097(2017).
  85. Blackburn, P. R., et al. Novel de novo variant in EBF3 is likely to impact DNA binding in a patient with a neurodevelopmental disorder and expanded phenotypes: patient report, in silico functional assessment, and review of published cases. Molecular Case Studies. 3 (3), 001743(2017).
  86. Lopes, F., Soares, G., Gonçalves-Rocha, M., Pinto-Basto, J., Maciel, P. Whole Gene Deletion of EBF3 Supporting Haploinsufficiency of This Gene as a Mechanism of Neurodevelopmental Disease. Frontiers in Genetics. 8, 143(2017).
  87. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  88. Mesbah, K., et al. Identification of a Tbx1/Tbx2/Tbx3 genetic pathway governing pharyngeal and arterial pole morphogenesis. Human Molecular Genetics. 21 (6), 1217-1229 (2012).
  89. Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan's legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163 (1), 12-14 (2015).
  90. Richards, S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genetics in Medicine. 17 (5), 405-423 (2015).
  91. McGary, K. L., Park, T. J., Woods, J. O., Cha, H. J., Wallingford, J. B., Marcotte, E. M. Systematic discovery of nonobvious human disease models through orthologous phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6544-6549 (2010).
  92. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159, 200-214 (2014).
  93. Ausubel, F. M. Current Protocols in Molecular Biology. , Greene Publishing and Wiley-Interscience. New York. (1989).
  94. Rubin, G., Spradling, A. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
  95. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, Cost-Free Method of Purification of DNA Fragments from Agarose Gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  96. Ronaghi, M. DNA Sequencing :A Sequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate. Science. 281 (5375), 363-365 (1998).
  97. Ho, S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pullen, J. K., Pease, L. R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene. 77 (1), 51-59 (1989).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Drosophila Fonksiyonel Analizinsan Varyant AnaliziKurtarma A r Ekspresyon DeneyleriElektroretinogram KaydGenetik Ara retimiMARRVEL Web KaynaIn Vivo De erlendirmeNadir Hastal k Ara t rmalarModel Organizma TaramasFenotipik Analiz

İlgili makaleler