Yöntem makalesi

Santral hücreleri ve bitki dokularının mekanik özelliklerini ve Turgor basıncını ölçmek için Atomic Force Microkopi kullanımı

11.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/59674

⸱

15 Temmuz 2019

 ,  , 
1SFR Biosciences, Université de Lyon, 2Laboratoire de Reproduction et Développement des Plantes, Université de Lyon, ENS de Lyon, UCBL, INRA, CNRS

Bu makalede

Özet

Burada, hücre ve dokularda nano ve mikro girinti aracı olarak işletilen atomik kuvvet mikroskobu (AFM) sunuyoruz. Cihaz, numunenin 3D yüzey topografisini ve hücre duvarı Young 'ın modüllerinin yanı sıra Turgor basıncını da içeren mekanik özelliklerini eşzamanlı olarak satın almayı sağlar.

Özet

Burada atom kuvveti mikroskobu kullanımı bitki dokularına girinti ve mekanik özelliklerini kurtarmak için sunuyoruz. Girintileme modunda iki farklı mikroskopları kullanarak, bir elastik modülün nasıl ölçüleceği ve hücre duvarının mekanik özelliklerini değerlendirmek için nasıl kullanılacağını gösteririz. Buna ek olarak, Turgor basıncını nasıl değerlendireceğiz de açıklanmaktadır. Atomik kuvvet mikroskopinin ana avantajları, non-invaziv, nispeten hızlı (5 ~ 20 dakika) ve yüzeysel olarak düz olan yaşam bitki dokusunun neredeyse her türlü tedaviye gerek kalmadan analiz edilebilir olmasıdır. Çözünürlük, uç boyutuna ve birim alanı başına ölçüm sayısına bağlı olarak çok iyi olabilir. Bu yöntemin bir sınırlama sadece yüzeysel hücre katmanına doğrudan erişim sağlar olmasıdır.

Giriş

Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) tarama prob mikroskobu (SPM) ailesine aittir, genellikle birkaç nanometrelerin yarıçapı olan bir uç bir numunenin yüzeyini tarar. Bir yüzeyin tespiti, optik veya elektron bazlı yöntemlerle değil, uç ile örnek yüzey arasındaki etkileşim güçleri aracılığıyla elde edilmez. Böylece, bu teknik örnek bir yüzeyin topografik karakterizasyonu ile sınırlı değildir (birkaç nanometreye kadar gidebilir 3D çözünürlük), aynı zamanda elektrostatik, Van der Waals veya kontak kuvvetleri gibi etkileşim kuvvetlerinin her türlü ölçümünü sağlar. Ayrıca, uç biyolojik bir numunenin yüzeyine kuvvet uygulamak ve ortaya çıkan deformasyonu ölçmek için kullanılabilir, sözde "girinti", mekanik özelliklerini belirlemek için (örneğin, Young 's modulus, viskoelastik özellikleri).

Bitki hücresi duvarlarının mekanik özellikleri, gelişim süreçlerinin temelindeki mekanizmaları anlamaya çalışırken dikkate alınması gerekli olan1,2,3. Nitekim, bu özellikleri sıkıca geliştirme sırasında kontrol edilir, hücre duvar yumuşatıcı hücrelerin büyümesine izin vermek için gerekli olduğundan özellikle. AFM, bu özellikleri ölçmek ve organlar, dokular veya gelişimsel aşamaları arasında değişme şeklini incelemek için kullanılabilir.

Bu yazıda, hem hücre duvarı mekanik özelliklerini hem de Turgor basıncını ölçmek için AFM 'nin nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır. Bu iki uygulama iki farklı AFM mikroskoplar üzerinde gösterilmiştir ve sonra burada ayrıntılı olarak gösterilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. ölçü hücre duvar mekanik özellikleri

Not: Arabidopsis 'in gelişmekte olan dokunaçlarını örneği sunulmuştur.

  1. Biyolojik numunelerin hazırlanması
    1. Arabidopsis4için yayınlanan aşamaları belirlenmesine göre 9 ila 10 (yaklaşık 0,5 mm uzunluğunda) aşamasında kapalı bir çiçek tomurcuk toplayın. Bir binoküler altında, ince Cımbız kullanarak, dikkatle geliştirme aşamasını kontrol etmek ve çiçek merkezinde bulunan dokunaçlarını toplamak için tomurcuk açın.
    2. Küçük bir petri tabağı (5 cm çapı) kapağının ortasına yerleştirilen çift taraflı teyp dokunaçlarını koyun.
      Not: Alternatif olarak, biyouyumlu tutkal da girintileme üzerine numunenin daha verimli immobilizasyonu için kullanılabilir.
    3. Numune tamamen kapılana kadar hızla su ekleyin. Bu, dehidrasyon önler ve örnek için ucu yapışma azaltır. Alternatif olarak, örneğin Arabidopsis Apex kültür orta5gibi sıvı ortamda örnek daldırın.
  2. AFM kalibrasyonu
    1. Örnek yüzeyin istenilen girintileme kadar deformasyonuna izin verecek kadar yüksek, ancak hassasiyet kaybını önlemek için çok yüksek olmayan, konsol Yay sabiti k değerini ayarlayın.
      Not: Başparmak kaba bir kural olarak, Eğer genç modülünün örnek biliniyorsa, bahar sabiti büyüklüğü sırası k≈E * δolarak seçilebilir, burada δ istenilen girintileme olduğunu.
    2. 15 μm uç-konsol mesafesine sahip R = 400 nm küresel uçlu uç kullanın.
      Not: Uç yarıçapı doğrudan lateral çözünürlüğe bağlı. Genellikle, biyolojik malzemelerin girintileme için, yuvarlak ipuçları seçin (R büyüktür 10-20 Nm) veya kolloidal problar. Küçük kolloidal problar, örnek yüzeye dokunabilir uç ucu ve konsol arasındaki küçük mesafe nedeniyle kullanmak zor olabilir.
    3. Yazılımı açın ve kafa yatay olarak en az 2-3 h deneme önce yerleştirin: Bu termalize baş sağlayacak ve termal kaynaklı konsol-lazer göreli hareketler kaçınacaktır. Mikroskop bir CellHesion modülü ile donatılırsa (kullanılabilir Z piezo aralığını 15 μm yerine 100 μm ' ye uzatarak), önce kumandasını açın ve ardından yazılımı başlattığınızda CellHesion modunu seçin.
    4. Cam blok üzerinde konsol Mount ve kafasına blok monte. Ucu suya daldırılır zaman hava kabarcıkları oluşumunu önlemek için ucu ultra saf su birkaç mikrolitresindeki bir damlacık yerleştirin.
    5. Sabit bir örnek (temizlenmiş cam slayt veya safir) yerleştirin ve 30-50 μL ultra saf su ekleyin.
      Not: Burada açıklanan kalibrasyon prosedürü, bazen denilen kontak kalibrasyonuyla aynıdır. İlk olarak, sert ve düz bir yüzeyde bir kuvvet eğrisi yapılır ve daha sonra Yay sabiti hesaplamak için ısı heyecanlı konsol osilasyon spektrum kaydedilir. Diğer kalibrasyon protokolleri var ve kısaca tartışma paragrafında tarif edilecektir.
    6. Başını sahneye yerleştirin (Z motorlarını yeterince yüksek kaldırmamaya dikkat edin). Lazer konsol üzerinde kabaca yerleştirmek için optik görüntü kullanın.
      1. Lazeri, fotodiyot üzerindeki toplam sinyali izleyen ana eksen boyunca hareket ettirin.
        Not: Standart konsol kullanıldığında, 0,5 V 'den büyük bir toplamı elde edilmelidir.
      2. Lazer diğer yönde hareket ettirin ve konsol ortasında lazer konumlandırmak için toplam sinyali maksimize. Bu yan ve dikey saptırma arasındaki çapraz konuşma en aza indirmek olacaktır.
    7. Saptırma hassasiyetinin ölçülmesi
      Not: Fotodiyot Lazer Deplasman okur ve voltlar bir sinyal sağlar. Metrik ünitede sapmayı ölçmek için saptırma hassasiyeti ölçülmelidir.
      1. Kontak → Force spektroskopisindecihazı ayarlayın. Bağıl bir ayar noktası olarak 2 V, z uzunluğa 0,5 μm olarak ayarlayın ve hızı 2 μm/s 'ye (örnekleme hızı 10000 Hz) uzatır ve Z kapalı döngüsünüseçin.
      2. Kalibrasyon yöneticisini açın ve doğrusal bir uyum sağlamak için kuvvet eğrisinin (doğrusal olması gereken) temas parçasını seçin: eğim tersi saptırma hassasiyetini verir. Fotodiyot okuma artık metrik ünitede kalibre edilmiştir.
    8. Bahar sabiti belirlenmesi. Kalibrasyon Yöneticisi'nde, bir termal spektrum edinme çalıştırmak için bahar sabiti seçin. Sinyali daha uzun bir süre için Ortalama olarak, ∞ sembolünü seçin. Termal heyecanlı konsol güç spektrumunun çeşitli doruklarına gösterebilir; sığması için en düşük frekansa yerleştirilen bir seçim çizin.
      Not: Termal Tune sıvı olarak gerçekleştirildiğinde rezonans zirvesinde daha geniş olacaktır ve frekans nominal bir seviyeye göre azaltılır.
  3. Kuvvet spektroskopisi deneme kurma ve edinme
    1. Numuneyi AFM aşamasına yerleştirin ve kafası numunenin üzerine yerleştirin.
      Not: Baş ve örnek yüzey arasında sert bir temas önlemek için yeterince geri çekildiğinden emin olun.
    2. İzin ver, birkaç dakika boyunca termalize edelim.
    3. QI modu, 50 nn bir SetPoint kuvvet ile yaklaşım.
    4. 4 μm ' lik bir Z uzunluğu ve 80 x 80 μm2 ' ye kadar bir tarama alanı ile 40 x 40 ' e kadar bir dizi piksel ayarlayın. Gelişmiş görüntüleme ayarları panelinde, modu sabit hızda ayarlayın. Hızı 200 μm/s ve numune oranlarına 25 kHz 'e uzatır ve geri çekin.
    5. Taramayı başlatın ve örnek hareket ederse kontrol etmek için bu hızlı düşük kuvvet tarama kullanın. Taranan alanın enkaz veya deflected hücrelerden serbest olduğunu doğrulayın ve ölçümleri gerçekleştirmek için olabildiğince düz bir ilgi bölgesini bulun.
      Not: Gerçek numune eğimini takdir etmek için, hat seviyelendirme kapalı veya sabitolarak ayarlanmalıdır. Girintileme ekseni ile yüzey arasındaki aşırı eğim açısı, ölçülen Young modülü5üzerinde bir etkiye sahip olacaktır.
    6. Bir ilgi alanı bulunduktan sonra, 40 x 40-60 x 60 μm2 civarında bir bölge seçin ve 2 piksele/μm ' ye ulaşmak için piksel numarasını artırın. 500 mil girintileme elde etmek Gerekirse, denemenin başlangıcında bu değeri ayarlayın. Z uzunluğunu 2 μm ' ye azaltın. 100 μm/s hızına uzatmayı ve geri çekilmeyi azaltın ve numune hızını 50 kHz 'e yükseltin.
    7. Taramayı başlatın ve çıktıyı kaydedin (genellikle bir görüntü ve veri dosyası tarafından oluşur).
    8. Ölçüm günün sonunda, uç tutucuyu çıkarın ve ultra saf su ve% 70 EtOH ile yavaşça durulayın.
    9. Kuru ve konsol çıkarın. Aynı ucu ile daha fazla deneyler için, bir ıslak temizleme protokolü ile temizlik düşünün ve mümkünse, bir takip plazma O2 tedavi. Tuz kristalizasyonu önlemek için su, konsol ve/veya ucu tutucu üzerinde kuru izin vermeyin.
  4. Veri Analizi (6. x veri Işleme yazılımı sürümü için)
    1. Veri Işleme yazılımını açın ve veri dosyasını yükleyin.
    2. Haritanın tüm eğrileri üzerinde aynı analiz parametrelerini kullanmak için toplu işleme düğmesi için bu haritayı kullanın tıklayın.
    3. Önceden tanımlanmış yük Işleminde Hertz Sığdır'ı seçin.
    4. Kalibrasyon parametrelerini doğrulamak veya değiştirmek için ilk sekmeyi kullanın.
    5. İkinci sekmede, ortalama değerini 0 olarak ayarlamak için bir uzaklığı (veya ofset artı bir eğim) taban çizgisine kaldırın.
    6. Üçüncü sekmede, uzatma eğrisi boyunca ayar noktası değerinden geldiğinde 0 kuvvetini geçen ilk nokta olarak dikkate alarak ilgili kişi (POC) konumunu tahmin edin.
    7. Sekme Dikey ipucu konumu , yükseklik ölçülmesi 'nden konsol sapmasını çıkararak ipucu hareketini hesaplar. Bu adımda, ilgili onay kutusunu işaretleyerek aşağıdaki Sığdır için Unsmoothed yüksekliği (ham veri) kullanın.
    8. Elastikiyete Sığdır sekmesinde, uygun uyum modelini seçin. Geri eğrilerinde hiçbir veya zayıf yapışma görünüyorsa (ayar noktası kuvvetinin% 10 ' dan az veya seçili girinti derinliğinde en fazla ortalama kuvvet için karşılık gelen), model türü Hertz/Sneddon olarak ayarlanmalıdır ve eğrinin kullanılması gerekir. Güçlü yapışma durumunda, DMT modeli, Derjaguin-Muller-Toporov modeli için standları, tercih edilmelidir ve sığar eğriler üzerinde yapılmalıdır (mevcut kontakt modelleri ve ilgili formüller hakkında ayrıntılar için manuel bakın).
      1. Nominal uç şekline göre ipucu geometrik parametrelerini ayarlayın. Burada, Ipucu şekli küre ve ucu Radius 400 nm olduğunu.
      2. Biyolojik malzeme (sıkıştırılamaz malzemeye karşılık gelen) için geleneksel olarak yapılır gibi 0,5 için Poisson oranı ayarlayın.
    9. Belirli girintileme kadar sığdır. Varsayılan olarak, sığdır tüm eğri üzerinde gerçekleştirilir. Sığdır belirli bir girintileme kadar yapılması gerekiyorsa, önce Shift Curve onay kutusunu işaretleyin; Bu, yeni belirlenen temel ve POC değerlerine dayalı olarak eğri kaynağını kaydıracaktır.
      1. Ana pencerede simgeye tıklayarak ikinci bir elastikiyet Sığdır rutin ekleyin.
      2. Tüm uyum parametrelerini yeniden ayarlayın ve istenen Girintiyi X min olarak belirtin. POC konumunun belirlenmesini ve daha sonra hesaplanan girinti derinliğini iyileştirmek için gerekli sayıda adım (2 ila 3 adım yeterli olmalıdır) ekleyin. Bu noktada işlem kaydedilebilir.
    10. Tıklayın tutmak ve tüm eşleme tüm eğrileri üzerinde önceki adımları yinelemek için uygulayın.
    11. Sonuçları kaydedin. Bir görüntü ve. tsv dosyaları elde edilecektir.

2. Turgor basıncı ölçüsü

Not: Arabidopsis 'in oryzalin tedavi edilen çiçeklenme meristem bir örnek sunulmuştur.

  1. Biyolojik numunenin hazırlanması
    1. Toplamak Arabidopsis çiçeklenme meristem (IM) in vitro bağlanırlar gelen mikrotubule depolymerizing ilaç oryzalin ile orta Polar oksin vardır taşıma inhibitörü 1-N-naphthylphthalamic asit (NPA) yayımlanan yöntemi aşağıdaki içeren yetiştirilen 6' ya kadar.
    2. İki seçenekten birini izleyerek ım örneği montaj
      1. Uzun süreli izleme için: numuneyi, kontaminasyonu önlemek için Arabidopsis Apex kültür ortamı (ACM)7,8 ve 0,1% bitki koruma karışımı (ppm) içeren petri-dish içinde bağlayın. ACM yüzeyinin üstündeki anlık ileti ucunu askıya alın ve 2% agarose bir damla ile ım tabanı destek.
      2. Hızlı çözelti değişimleri ile ölçüm için: örnek bir petri-tabak yapışkan mastik küçük bir parça tutarak monte ve hızlı bir şekilde biyolojik uyumlu tutkal ile mastik ve numune tabanı arasındaki boşluğu mühürlemek. Tutkal (2 dk daha az), daha sonra% 0,1 ppm içeren sıvı ACM içinde örnek daldırın kuvvetlendirmek bekleyin.
        Not: Numune tabanının sabitlenmesi sırasında örnek yüzeyin agaroz veya tutkal ile kaplanmamış olduğundan emin olun. Turgor basıncının AFM ölçümü, numunenin istikrarlı bir şekilde monte edilmesini gerektirir ve önceki montaj yöntemleri kabul edilebilir stabilite sağlar. Örneğe bağlı olarak, Çift taraflı teyp, poli-lizin vb. gibi diğer montaj yöntemleri kullanılabilir.
  2. AFM kalibrasyonu
    1. AFM edinme yazılımını açın ve Peakforce QNM (büyük genlik) ölçüm modunu seçin.
    2. 2,1 ile 2,6 arasındaki adımlarda açıklanan aynı ilkeyi izleyerek kalibrasyon gerçekleştirin.
    3. Denetim parametreleri penceresinde, Tarama boyutu 0 olarak ayarlayın. Rampa penceresinde, 200 nm ile 500 Nm arasında rampa boyutunu ayarlayın, 2 v Ile 5 v arasında Trig eşik ve 2048 veya daha yüksek numune sayısı .
    4. Kalibrasyon örneği ile konsol ucunu hizalayın ve yaklaşımıtıklayın.
    5. Temas üzerine, rampa penceresine gidin ve düğme sürekli rampatıklayın. Eğrinin doğrusal rejiminde, güncelleme duyarlılığı düğmesine tıklayarak eğimi belirleyin. Sapma hassasiyeti ölçümünü birkaç kez tekrarlayın ve menü kalibrasyonundan sekme dedektörünü açarak kalibrasyonu ölçüm ortalaması ile manuel olarak güncelleyin .
    6. AFM kafasını geri çekin ve kalibrasyon örneğini çıkarın.
      Not: Tamamen örnek değişikliği üzerine kazara sert temas önlemek için sekme sahne → Initialize seçerek AFM başını geri çekmek için önerilmektedir.
  3. Kuvvet spektroskopisi deneme kurma ve edinme
    1. Örnek henüz daldırın değilse, ppm içeren sıvı ACM ile alt birleştir.
    2. Edinme yazılımında, ölçüm parametrelerini aşağıdaki gibi belirtin:
      1. Kontrol parametresi penceresinde, bahar sabiti için konsol üretilen Yay sabiti veya belirlenen yay sabiti olarak adım 2,8 olarak ayarlayın. Bu örnekte, 42 N/m 'de ayarlanır.
      2. Bu örnekte uç yarıçapı 400 nm 'ye ayarlayın.
      3. Set örnek Poisson oranı 0,5 için, su ağırlıklı olarak Turgor basıncı katkıda beri.
      4. Set Sample/Line 128 hızlı edinme sağlamak için.
      5. Tarama hızını 0,2 Hz 'ye ayarlayın.
      6. Tarama boyutunu 1 μm olarak ayarlayın.
        Not: Tarama hızını ve küçük tarama boyutunu ayarlamak, AFM tarama tetikleyen örnek hasarı etkili bir şekilde engelleyebilir. Herhangi bir örnek değişiklik üzerine bu iki parametre azaltma önerilir.
      7. Rampa penceresinde, rampa boyutunu 5 μm olarak ayarlayın.
        Not: Daha iyi temel edinme için daha iyi ayar rampa boyutu amaçlanan girinti derinliği daha büyük.
      8. Trig eşiğini maksimuma ayarlayın.
      9. 4608 için numune sayısını ayarlayın.
      10. İsteğe bağlı olarak, mikroskop → nişan parametreleri sekmesinde, güçlü temas kaynaklı örnek hasarı önlemek için aşağıdaki parametreleri azaltın. Ayarlar Peak Force Engage SetPoint 0,3 v (varsayılan 0,5 v) için. 0,5 (varsayılan 0,75) için Engage Int. Gain ayarlayın. Set SPM 4 μm (varsayılan 15 μm) adımına girerler.
    3. Örneği AFM kafası altında yerleştirin ve hizalayın ve konsol batana kadar yaklaşın, örnek yüzeye temas etmeyin.
      Not: Yaklaşan iken, hafifçe sıvı ACM yüzeyinde darbe bir sıvı köprü olarak konsol ve sıvı yüzey arasında meydana kadar. Bu genellikle sert temas önler.
    4. Bakım ile, elle örnek doğru yaklaşım. Prob nispeten örnek yüzeye yakın olduğunda, yaklaşım' ı tıklatın.
    5. Temas üzerine, kademeli olarak Tarama boyutu ve/veya tarama oranı örnek ve/veya konsol zarar vermeden istenen bir denge kadar artırın.
      Not: Tarama boyutu, numunenin yüzey eğriliği ve pürüzlülüğü ile sınırlıdır. Oryzalin-tedavi ım durumunda, 50 x 50 μm2 tarama alanı 0,3 Hz tarama hızı ile elde edilebilir.
    6. Tarama sırasında ölçüm bölgesinin istediğiniz gibi olup olmadığını belirleyin. Gerekirse yeniden konumlandırın. Memnun zaman, düğme noktası ve ateş nokta ve ateş penceresi başlatmak için tıklayın.
    7. Taraması kaydetmeden önce, hücre konturlarını net bir şekilde tanımlamanıza olanak sağlayan uygun bir görüntü kanalı seçin. Genellikle, tepe kuvvet hatası, DMT modulus, LogDMT Modulus veya dağılımı uygundur. Dizin ve dosya adını kaydet belirtin. Sonra kayıt başlatmak için sonraki tarama rampa tıklayın.
      Not: Bir nokta ve üç sayı bir dize otomatik olarak atanan dosya adından sonra eklenir (gibi. 000). Bu sayı, kaydedilmiş her tarama tekrarı üzerine 1 ile otomatik olarak artar.
    8. Tarama tamamlandığında, yazılım arayüzü otomatik olarak Ramp penceresine yönlendirilecektir. Girintili pozisyonları belirtmek için taranan resme tıklayın.
      Not: Girintileri kaydetmeden önce, parametre değişimi gerekliyse ( rampa boyutu, piezo pozisyonu, vb.), sadece Ramptıklayarak test girintileri gerçekleştirmek için birkaç simge seçimi daha iyi olur. Girinti derinliği hücre duvar kalınlığından daha büyük olması gerekir (ideal olarak iletim elektron mikroskobu tarafından ayrı olarak belirlenir).
    9. Barycenter yakınındaki hücre başına en az üç girinti sitesi seçin ve girinti, site başına üç kez yineleyin. Bu daha fazla analiz için hücre başına en az dokuz kuvvet eğrileri verim. Girinti site yerleşimi ile memnun olduğunuzda, rampa ve yakalama'yı tıklatın. Kuvvet girintileme eğrileri otomatik olarak belirlenmiş dizine kaydedilir.
    10. Rampalar tamamlandığında, döşeme ölçümü için farklı bir konuma konumlandırın veya tarama kafasını geri çekin ve örneği değiştirin.
    11. Bittiğinde, adımları 1.3.8 ve 1.3.9 olarak konsol temizleyin.
  4. Veri Analizi
    1. Analiz yazılımında, *. MCA dosyasını açın. Bu, taranan görüntüde her kuvvet eğrisinin konumunu gösterir. İstenirse, analiz için kuvvet eğrilerini önceden seçin.
    2. Genellikle x0000y. 00Zbiçiminde analiz edilecek bir kuvvet eğrisini açın, burada x, y ve z Dizin kaydetme dizininde belirtilen dosya adıdır ve girinti sırası ve tarama numarasını belirten otomatik olarak kaydedilir.
    3. Temel düzeltme düğmesini tıklatın ve kaynak taban çizgisi başlangıcını Genişlet ve kaynak temel durağının % 0 ve 80% olarak genişletilinceye kadar kuvvet eğrisindeki mavi tire satırlarını sürükleyin. ' I tıklatın Execute.
      Not: Alternatif olarak, kaynak taban çizgisi durmasını Genişlet , hala taban çizgisi içinde olduğu ve ilgili kişi noktasının ötesinde olmadığı sürece farklı değerlerde ayarlanabilir.
    4. Boxcar filtre düğmesini tıklatın ve düzgün kuvvet eğrisi için Yürüt ' ü tıklatın.
    5. Girinti düğmesini tıklatın.
      1. Giriş penceresinde, etkin eğri genişletmekiçin ayarlayın.
      2. Fit yöntemini Doğruyma modeline ayarlayın ve Evet'e yapışma kuvveti ekleyin .
      3. Maksimum kuvvet sınırını % 99 ve Min kuvvet sığdır sınırına % 75 olarak ayarlayın.
      4. Sığdır modelini sertliği (doğrusal) olarak ayarlayın.
        Not: Bu kurulum, Turgor basınç kesintisi için belirgin sertlik k hesaplayacaktır. Bu örnekte, fit sınırları yaklaşık 1,5 μm girintileme derinliğine uygun bir sertlik yansıtmaktadır.
    6. Kuvvet eğrileri toplu olarak analiz edilebilir. Çalışma geçmişi düğmesini tıklatın, rapor dizinini belirtin ve aynı işlemi gerektiren diğer tüm kuvvet eğrilerini ekleyin. Memnun olduğunda, Çalıştır' ı tıklatın. Varsayılan olarak, sığdır *. txt dosyası olarak depolanır.
    7. K toplu monte edildiğinde, girinti penceresine dönmek için History → 5 girintileme seçeneğini tıklatın.
      1. % 10 ve Min Force fit sınırına % 0 ' a kadar maksimum kuvvet sınırı değiştirin.
      2. Fit modelini hertzian 'a (küresel) ayarlayın.
        Not: Bu hücre duvarı Hesaplamalı genç 'in modüus E Turgor basınç kesintisi için. Bu örnekte, uygun sınırlar yaklaşık 0,4 μm girintileme derinliğinin Hertzian uyum (küresel prob kullanarak) yansıtır.
    8. Eiçin toplu uyum için adım 2.4.6 yineleyin.
    9. Farklı tarama kanallarını görüntülemek için *. 00Z dosyasını (z otomatik olarak kayıtlı tarama numarasıdır) açın. Yükseklik kanalı penceresinde bölüm düğmesi 'ni tıklatın. Bu, Turgor basınç kesintisi için gerekli olan numunenin yüzey eğriliği ölçümüne izin verecektir.
      1. Bir hücrenin uzun ekseni boyunca bir çizgi çizin, çizgi çizgi sınırlarını hücre kenarlarına taşıyın ve RADIUS değeri r1' i kaydedin. R2yarıçapı almak için kısa eksen için bunu tekrarlayın. Hücrenin yüzey ortalama eğrilik κM ve Gauss eğriliği κG iki yarıçapın ölçümü aşağıdaki gibi kullanarak hesaplayın:
        figure-protocol-1Vefigure-protocol-2 
    10. Deduce Turgor basınç P 9 yayımlanan ince kabuk modelini kullanarak aşağıdaki gibidir:
      figure-protocol-3 
      Ile
      figure-protocol-4
      nerede t hücre duvar kalınlığı örneğin elektron mikroskobu tarafından belirlenir.
      Not: Turgor basıncının kesintisi, yinelemelerin gerekli olduğu uygun bir süreçtir. Dört yineleme genellikle istikrarlı ürün yeniden oluşturabilirsiniz, ancak daha fazla yineleme yapılabilir (örneğin 100 kez).
    11. Hücre başına ortalama E, k ve P hesaplayın. Ayrıca, belgeler için hücre içi değişkenliği (örn. standart sapma) kaydedin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1a ve Şekil 1B , QI haritasını elde etmek için ilgi alanı bulmak için kullanılan protokolün 1.3.6 için bir adım, 1.3.4 adımlarının sonucunu gösteren bir ekran görüntüsü gösterir. Bu ilgi bölgenin (yani, mümkün olduğunca düz) eğimli bir yüzey üzerinde olmak için seçilmiş olduğu söz eder. Aslında, routier ve al.5tarafından fark edilirken, girinti ekseni yüzeye dik değilse, Young 'ın ölçüm modülü hafife...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bitkilerin şekillerin ortaya çıkması esas olarak zaman ve uzay sırasında koordine oranı ve büyüme yönü ile belirlenir. Bitki hücreleri, onları bir araya yapıştıran bir polisakkaridik matrisden yapılmış sert bir hücre duvarında kaplı. Sonuç olarak, hücre genişleme hücre duvarı çekerek Turgor basıncı arasındaki denge tarafından kontrol edilir, ve bu basınca dayanıklı hücre duvarının sertlik. Kalkınma temel mekanizmaları anlamak için, farklı dokularda veya belirli bir organ hücrelerinde hem hücre duvarı mekanik özellikleri ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Biz kendi teknik destek için PLıM ekibi teşekkür etmek istiyorum, yanı sıra Arezki Boudaoud ve yararlı tartışmalar için RDP laboratuarında Biophysic ekibinin üyeleri.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Büyüme ortamı
1.000x vimatin stok çözeltisiACM yapmak için kullanılır, bileşim bakınız Stanislas ve diğerleri, 2017. Otoklavlamadan sonra, dökmeden önce ACM'ye ekleyin.
1-N-Nafttalamik asit (NPA)Sigma-Aldrich / Merck132-66-1Arabidopsis ortamına, 10 & M'ye ekleyin. Otoklavlamadan sonra, dökmeden önce ekleyin.
Agar-agarSigma-Aldrich/Merck9002-18-0, Arabidopsis ortamına %1 w/v ekleyin.
AgaroseMerck Millipore9012-36-6, %0,8 w/v katı ACM yapmak için kullanılır.
Arabidopsis ortaDuchefa BiochimieDU0742.0025İn vitro arabidopsis kültürü için, 11.82g/L.
Kalsiyum nitrat tetrahidratSigma-Aldrich/Merck13477-34-4, Arabidopsis ortamına 2 mM eklenir.
MURASHIGE & SKOOG MEDIUMDuchefa BiochimieM0221.0025ACM yapmak için kullanılan bazal tuz karışımı, 2,2 g/L.
N6-benziladenin (BAP)Sigma-Aldrich/Merck1214-39-7, ACM, 555 nM yapmak için kullanılır. Otoklavlamadan sonra, dökmeden önce ACM'ye ekleyin.
OryzalinSigma-Aldrich / Merck19044-88-3oryzalin tedavisi için, 10 & mu; g/mL'dir.
Bitki koruma karışımı (PPM)Bitki Hücresi Teknolojisi,% 0.1 v / v. Otoklavlamadan sonra, dökmeden önce ACM'ye ekleyin.
Potasyum hidroksitDuchefa Biochimie1310-58-3, her ikisi de pH 5.8 olan Arabidopsis ortamı ve ACM yapmak için kullanılır.
SucroseDuchefa Biochimie57-50-1, ACM yapmak için kullanılır, %1 w/v.
Tools / strong>
BioScope Katalizörü BioAFMBrukerBu protokolde turgor basıncı ölçümü için kullanılan AFM.
Nanowizard III + CellHesionJPK (Bruker)Mekaniközellikleri ölçmek için kullanılan AFM.
PatafixUHUD1620
Referans elasitik yapıNanoIdea2Z00026
Reprorubber-İnce DökmeFlexbar16135biyouyumlu yapıştırıcı.
Küresel AFM uçlarıNanoandmoreSD-SPHERE-NCH-S-10Mekanik özellikleri ölçmek için kullanılan uçlar.
, ACM yapmak için kullanılan

Kaynaklar

  1. Du, F., Guan, C., Jiao, Y. Molecular mechanisms of leaf morphogenesis. Molecular Plant. 11, 1117-1134 (2018).
  2. Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 850-861 (2005).
  3. Dumais, J. Can mechanics control pattern formation in plants? Current Opinion in Plant Biology. 10, 58-62 (2007).
  4. Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. The Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
  5. Routier-Kierzkowska, A. L., et al. Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics. Plant Physiology. 158 (4), 1514-1522 (2012).
  6. Corson, F., et al. Turning a plant tissue into a living cell froth through isotropic growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 8453-8458 (2009).
  7. Hervieux, N., et al. A mechanical feedback restricts sepal growth and shape in Arabidopsis. Current Biology. 26, 1019-1028 (2016).
  8. Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J. Chapter 11 - In-vivo analysis of morphogenesis in plants. Methods in Cell. Lecuit, T. 139, Academic Press. 203-223 (2017).
  9. Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
  10. Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. P. Non-Hertzian Approach to Analyzing Mechanical Properties of Endothelial Cells Probed by Atomic Force Microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 128 (2), 176-184 (2006).
  11. Beauzamy, L., Louveaux, M., Hamant, O., Boudaoud, A. Mechanically, the shoot apical meristem of Arabidopsis behaves like a shell inflated by a pressure of about 1MPa. Frontiers in Plant science. 6 (1038), 1-10 (2015).
  12. Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
  13. Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176, 1547-1558 (2018).
  14. Farahi, R. H., et al. Plasticity, elasticity, and adhesion energy of plant cell walls: nanometrology of lignin loss using atomic force microscopy. Scientific Reports. 7, 152(2017).
  15. Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21, 1720-1726 (2011).
  16. Cosgrove, D. J. Diffuse growth of plant cell walls. Plant Physiology. 176, 16-27 (2018).
  17. Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3789-3798 (1995).
  18. Sader, J. E., Chon, J. W. M., Mulvaney, P. Calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 70 (10), 3967-3969 (1999).
  19. Sikora, A. Quantitative Normal Force Measurements by Means of Atomic Force Microscopy Towards the Accurate and Easy Spring Constant Determination. Nanoscience and Nanometrology. 2 (1), 8-29 (2016).
  20. Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Bitki H cre Mekani iTurgor Bas nc l mElastisite Mod l Analizindentasyon ModuKuvvet E risi AnaliziNumune SabitlemeBitki Dokusu G r nt lemeHertz Modeli

İlgili makaleler