Method Article

Gelişmiş Crosslinking Immünoprecipitation (eCLIP) fare testis protein bağlı RNA verimli tanımlaması için yöntem

DOI:

10.3791/59681

⸱

May 10th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Reproductive Medicine, Nanjing Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, testis 'teki RBP adaylarının büyük RNA hedeflerini belirlemek için bir eCLIP Protokolü sunuyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spermatogenesis, memelilerde erkek germ hücresi farklılaşma yüksek sipariş edilen bir süreç tanımlar. Testis, transkripsiyon ve çeviri unoupled, RBPs tarafından düzenlenmiş Gen ifadesinin Post-transcriptional düzenleme önemini vurgulayarak. Bir RBP 'nin mekanik rollerini yenilemek için, endojen doğrudan RNA hedeflerini yakalamak ve gerçek etkileşim sitelerini tanımlamak için çapraz bağlama immünopresipitasyon (CLIP) metodolojisi kullanılabilir. Gelişmiş CLıP (eCLIP), geleneksel klipler üzerinde çeşitli avantajlar sunan yeni geliştirilen bir yöntemdir. Ancak, eCLIP kullanımı şimdiye kadar genişletilmiş uygulamalar için arama, hücre hatları ile sınırlı olmuştur. Burada, biz MOV10 ve MOV10L1, iki RNA-bağlayıcı helicases, fare testis okumak için eCLIP istihdam. Beklendiği gibi, biz MOV10 ağırlıklı olarak mRNA 3 ' tercüme edilmemiş bölgelere (UTRs) bağlar ve MOV10L1 seçmeli olarak Piwi-etkileşim RNA (piRNA) öncüsü transkriptler bağlar bulabilirsiniz. ECLIP yöntemimiz, alt klonların küçük ölçekli sıralaması ve böylece nitelikli kütüphanelerin kullanılabilirliği ile çeşitli RBPs 'lerin bağlı olduğu büyük RNA türlerinin hızlı bir şekilde belirlenmesini sağlar ve bu da derin sıralamaya devam etmek için bir emir olarak kullanılabilir. Bu çalışma, memeliyen testis içinde eCLIP için geçerli bir temel kurar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mammalian testis bir karmaşık hücre farklılaşma programı cyclically çok sayıda spermatozoa verim çalışır burada mükemmel bir gelişimsel model temsil eder. Bu modelin benzersiz bir değeri, genellikle Mayoz bölünmenin seks kromozom inaktivasyonu (MSCI)1,2 ve yuvarlak spermatids geçmesi zaman oluşur spermatogenesis belirli aşamalarında transkripsiyonel inaktivasyonu ortaya çıkması yatıyor spermiogenesis sırasında şiddetli nükleer sıkıştırma3. Bu ardışık transkripsiyonel olaylar, RNA bağlayıcı proteinlerin (rbps) transscriptome şekillendirme ve Erkek fertilitesini sürdürmek için önemli bir ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yapılan tüm hayvan deneyleri Nanjing Tıp Üniversitesi Komitesi tarafından onaylanmıştır. Erkek C57BL/6 fareler kontrollü fotoperiyodun koşullarında tutulur ve gıda ve su ile birlikte verildi.

1. doku hasat ve UV Crosslinking

  1. 1-2 dk veya solunum durur kadar karbondioksit (CO2) kullanarak 2 yetişkin fareler euthanize. Ardından, her fare üzerinde servikal çıkığı gerçekleştirin.
  2. Her immünoprecipitation deney için uygun yaş fareler (Bu çalışmada bir yetişkin testis) gelen testis yaklaşık 100 mg hasat ve buz-soğuk fosfat tamponlu tuzlu (PBS) dokuları yerleştirin.
  3. İnce uçlu cımbız bir çift ile hafifçe tunik....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eclip prosedürü ve sonuçları Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4' te gösterilmiştir. Fareler karbondioksit ile ötenize edildi ve cerrahi makas kullanılarak alt karın içinde küçük bir kesi yapılmıştır (Şekil 2a,B). Fare testle.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hem biyolojik hem de patolojik bağlamlar altında rbps evrensel rolünü anlamak artan, klip yöntemleri yaygın rbps moleküler fonksiyonunu ortaya çıkarmak için kullanılmıştır20,32,33, 34,35. Burada açıklanan protokol, fare testis için eCLIP yönteminin uyarlanmış bir uygulamasını temsil eder.

Testis içinde Eclip gerçekleştirme bir meyd.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz orijinal protokol ile yararlı rehberlik için Eric L Van Nostrand ve gene W Yeo teşekkür ederiz. K.Z. Ulusal anahtar R & D programı Çin (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) ve Ulusal Doğal Bilim Vakfı Çin (31771653) tarafından desteklenmektedir. Ly Ulusal Doğal Bilim Vakfı Çin (81471502, 31871503) ve yenilikçi ve girişimcilik programı Jiangsu Eyaleti tarafından desteklenmektedir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Antikorlar< / güçlü >
anti-fare MOV10 ve nbsp antikoruProteintech, Çin10370-1-AP
Anti-fare MOV10L1 antikoruZheng ve ark.20109< / sup>poliklonal antiserum UP2175, P. Jeremy Wang laboratuvarı, Pennsylvania Üniversitesi
HRP Keçi Anti-Tavşan IgG ve nbsp;ABclonalAS014
Tavşan IgGBeyotime, ÇinA7016
Ekipman
SantrifüjüEppendorf, Hamburg, Almanya5242R
Dijital sonifierBRANSON, ABDBBV12081048A450 Watt; 50/60 Hz
DynaMag-2 Mıknatıs Canlandırıcı, ABD12321D
Mini Blot ModülüInvitrogen,ABDB1000
Mini Jel TankıInvitrogen,ABDA25977
Çalkalama inkübatörüEppendorf, Hamburg, AlmanyaThermomixer konforu 
Doku Öğütücü, DouncePYREX, ABDyalnızca 1234F35  bu protokolde "gevşek" havaneli kullanılır
Profesyonel standart 96 GradientBiometra, Almanyaseri no.: 2604323
Tüp Revolver Kristal, ABDseri numarası: 3406051
UV ışıklı çapraz bağlayıcıUVP, ABDCL-1000
Malzemeler
TC ile işlenmiş Kültür KabıCorning, ABD430167100 mm 
TüplerCorning, ABD43079115 mL
Mikrotüpler tüplerAXYGEN, ABDMCT-150-C1.5 mL 
Reaktifler  < / güçlü >
Asit fenol / kloroform / izoamil alkol & nbsp;Solarbio, ÇinP101125:24:01
AffinityScript EnzymeAgilent, ABD600107
AntioksidanInvitrogen, ABDNP0005
DH5 ve alfa; yetkili bakterilerThermo Scientific, ABDBuekonomik hücrelerin >1 x 106 transformatörleri verdiğini 18265017 mikro; 50 & başına g kontrol DNA'sı; L reaksiyonu.
DMSOSigma-Aldrich, ABDD8418
DNA Merdivenİnvitrojeni, ABD10416014
dNTPSigma-Aldrich, ABDDNTP100-1KT
Dynabeads Protein A Invitrogen, ABD10002D
ECL reaktifiVazyme, ÇinE411-04
EDTAInvitrogen, ABDAM9260G
EDTA içermeyen proteaz inhibitörü kokteyliRoche, ABD04693132001taze
Exo-SAP-ITAffymetrix, ABD78201PCR Ürün Temizleme Reaktifi 
FastAP enzimiThermo Scientific, ABDEF0652
LDS Örnek TamponuThermo Scientific, ABDNP0007
MetaPhor Agarose lonza, İsviçre50180
MgCl2Invitrogen, ABDAM9530G
MiniElute jel EkstraksiyonuQIAGEN, Almanya28604sütunda 4 ?; tampon QG = jel çözme tamponu; tampon PE = yıkama tamponu (adım 14 için)
MyONE Silan boncuklarThermo Scientific, ABD37002Dnükleik asitler ekstraksiyon manyetik boncukları
NaClInvitrogen, ABDAM9759
 
NP-40Amresco, ABDM158-500ML
NuPAGE Bis-Tris Protein JelleriInvitrogen, ABDNP0336BOX%4 & %12, 1,5 mm, 15 kuyulu
NuPAGE MOPS SDS Tampon KitiInvitrogen, ABDNP0050
PBSGibco, ABD10010023
Faz Kilitli Jel (PLG) ağır tüp   TIANGEN, ÇinWM5-2302831
PowerUp SYBR Green Master Mix UygulamalıBiyosistemler, ABDA25742
Proteinaz KNEB, New England P8107S
Q5 PCR ana karışımı NEB, New England M0492L
RLT tamponuQIAGEN, Almanya79216RNA saflaştırma lizis tamponu 
RNA Temiz & Yoğunlaştırıcı-5 sütun ZYMO RESEARCH, ABDR1016RNA saflaştırma ve konsantrasyon kolonları
RNaz I Invitrogen, ABDAM2295
RNase İnhibitörüPromega, ABDN251B
RQ1 DNasePromega, ABDM610A
Numune Azaltıcı AjanInvitrogen, ABDNP0009
SDS ÇözeltisiInvitrogen, ABD15553027% 10
Sodyum deoksikolatSigma-Aldrich, ABD30970koruyun hafif
T4 PNK enzimiNEB, New England & nbsp;M0201L
T4 RNA ligaz 1 yüksek koncNEB, New England M0437M
TA / Kör-Sıfır KlonlamaKarışımı Vazyme, ÇinC601-01
TBEInvitrogen, ABDAM9863
Tris-HCI TamponInvitrogen, ABD15567027
Triton X-100Sangon Biotech, ÇinA600198 
Tween-20Sangon Biotech, ÇinA600560
UreaSigma-Aldrich, ABDU5378
X-ray FilmleriCaresteam, Kanada6535876

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Turner, J. M., Mahadevaiah, S. K., Ellis, P. J., Mitchell, M. J., Burgoyne, P. S. Pachytene asynapsis drives meiotic sex chromosome inactivation and leads to substantial postmeiotic repression in spermatids. Developmental Cell. 10 (4), 521-529 (2006).
  2. Turner, J. M. A.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Enhanced CLIPProtein bound RNAMouse TestisRNA binding ProteinsCrosslinking ImmunoprecipitationSpermatogenesisGerm CellsMOV10 MOV10L1Piwi interacting RNA3 UTR Targets

Related Articles