Burada, İmmünohistokimya ve yüksek çözünürlüklü beyin bölgelerinin proteinleri için tarama ile birlikte yakın kızılötesi boyalar kullanan bir protokol sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kemirgen beyninde protein Ifadesini ölçmek için yakın kızılötesi floresan ve yüksek çözünürlüklü tarama kullanma
Bu makalede
Özet
Özet
Nörobilim, beyindeki hücrelerin çeşitli fonksiyonları nasıl Arabulmaya çalışışıdır. Hücresel fonksiyon hücre proteinlerinin bileşimi ve aktivitesi ile belirlendiği için nöronlar ve glia 'da protein ifadesinin ölçülmesi Nörobilim çalışması için önemlidir. Bu yazıda, immünosittokimya 'nın farklı beyin bölgelerinde yarı niceliksel bir protein ifadesi sağlamak için yakın kızılötesi yüksek çözünürlüklü taramayla nasıl birleştirildiğini açıklayacağız. Bu teknik aynı beyin bölgesinde tek veya çift protein ifadesi için kullanılabilir. Bu moda proteinleri ölçme deneysel manipülasyon ile protein ifadesinde göreceli bir değişiklik elde etmek için kullanılabilir, öğrenme ve bellek moleküler imza, moleküler yollardan aktivite, ve birden fazla beyin bölgelerinde nöral aktivite. Doğru proteinleri ve istatistiksel analizi kullanarak, beyin bölgeleri arasında fonksiyonel bağlantı da tespit edilebilir. İmmünosittokimya bir laboratuvarda uygulama kolaylığı göz önüne alındığında, yakın kızılötesi yüksek çözünürlüklü tarama ile immünsitokimya kullanarak bir sistem düzeyinde nörobiyolojik süreçleri incelemek için Nörobilim yeteneği genişletebilirsiniz.
Giriş
Nörobilim çalışma beyin hücrelerin belirli fonksiyonları aracı nasıl bir soruşturma endişeleri1. Bu nasıl glia hücrelerinin merkezi sinir sisteminde dokunulmazlık görüşmek gibi doğada hücresel olabilir ya da dorsal hipokampus nöronların aktivitesinin mekansal navigasyon neden açıklamak amacı deneyler içerebilir. Geniş anlamda, hücresel fonksiyon, bir hücrede ifade edilen proteinler ve bu proteinlerin aktivitesi2ile belirlenir. Sonuç olarak, beyin hücrelerinde proteinlerin ifade ve/veya etkinliğini ölçmek Nörobilim çalışması için önemlidir.
Beyindeki protein ifadesini ölçmek için bir dizi tekni....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Aşağıdaki protokol Delaware Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (IAUC) tarafından onaylanmıştır. Bu protokol için yaklaşık 55 – 75 gün eski erkek Sprague Dawley fareler kullanıldı.
1. beyin ekstraksiyon ve doku hazırlama
- Anestezi indüksiyon odasında isofluran ile sıçan artık ayak tutam bir yanıt sergiler kadar fare anestezize.
- Bir Giyotin kullanarak hızlı deplitasyon ile fareler feda.
- Kafatası arka ön ve kafatası üst açık deri kes.
- Dikkatli bir şekilde kafatası arka parçasını kaldırmak için rongeurs kullanın ve sonra küçük Diseksiyon makas kullanarak kafatası orta çizgi aşağı kesm....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
İmmunhistokimya için yüksek çözünürlüklü tarama kullanmadan önce, bir protokol çalıştığını doğrulamak gerekir. Bu aynı hayvanın beyin bölümleri birincil ve ikincil antikorlar, ikincil antikor tek başına, ya da ne birincil ne de ikincil antikor ile inkübe bir doğrulama tahlil kullanılarak gerçekleştirilebilir. Böyle bir doğrulama tahlil sonuçları Şekil 2' de gösterilir. Bu reaksiyonda, dorsal hipokampus ve amigdala 'da hemen erken gen c-Jun tespit edildi. C-Ju.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu makalede sunulan sonuçlar, yüksek çözünürlüklü tarama ile birlikte yakın kızılötesi immünsitokimya beyin dokusunda protein ifadesi yarı niceliksel önlemler elde etmek için kullanılabilir olduğunu göstermektedir. Aynı beyin bölgesinde aynı anda iki proteini etiketlemek için de kullanılabilir. Daha önce birden fazla beyin bölgelerinde hemen erken gen ifadesi ölçmek için yakın kızılötesi immünhistokimya kullandık9,10. Hemen erken genler nöral aktivite ölçüsü olar.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Bu raporda yapılan araştırmalar, NIGMS 'den (1P20GM103653) DK 'ya verilen bir hedef hibe tarafından finanse edildi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Beyin Ekstraksiyonu | |||
| Anestezi İndüksiyon Odası | Kent Scientific | VetFlo-0530SM | |
| Kleine Giyotin | Harvard Aparatı | 73-1920 | |
| Friedman Rongeur | Güzel Bilim Araçları | 16000-14 | kafatasının arkasını çıkarmak için kullanılır |
| Hassas Diseksiyon Makası | Fischer Scientific | 08-951-5 | kafatasının orta hattı boyunca yukarı doğru kesmek için kullanılır |
| Mikro Spatula | Fischer Scientific | 21-401-5 | beyni çıkarmak için kullanılır |
| Cam Mikroskop Slaytları | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| İmmünohistokimyasal Reaksiyon | |||
| Triton X-100 | Paraformaldehit içinde sabitlendikten sonra hücrelere nüfuz etmek için hafif bir deterjan olarak kullanılır, ayrıca konakçı serum ve ikincil antikor ile kombinasyon halinde hafif deterjan olarak kullanılır; | ||
| Tween-20 | ile kayma slaytlarından sonra TBS-T'yi elde etmek için TBS 'ye eklenen az miktarda deterjan olarak kullanılır | ||
| . | |||
| Görüntü | Stüdyosu Licor Biyoteknoloji A.Ş. |
Kaynaklar
- Kandel, E. R. Principles of Neural Science. , McGraw Hill. New York. (2013).
- Byrne, J. H., Roberts, J. L. From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience. , Academic Press/Elsevier. (2009).
- Salami, A., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
