Yöntem makalesi

Bölgeye Özgü İnflamatuar mRNA ve Proteini Tespit Etmek İçin Sıçan Epidermis ve Dermis'in Termolysin ile Ayrılması

DOI:

10.3791/59708

⸱

29 Eylül 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, Oklahoma State University Center for Health Sciences, 2Institute for Shock Physics, Washington State University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan, enflamatuar mediatör üretimini değerlendirmek için epidermisin dermisten ayrılması için bir protokoldür. İltihaplanmadan sonra, sıçan arka pençe epidermisi 4 ° C'de termolysin ile dermisten ayrılır. Epidermis daha sonra RT-PCR ile mRNA analizi ve batı blot ve immünostokimyası tarafından protein değerlendirmesi için kullanılır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cilt hasarı, iltihaplanma ve/veya duyarlılık sırasında enflamatuar mediatörlerin ve nörotrofinlerin bölgeye özgü üretimini belirlemek için kullanımı kolay ve ucuz tekniklere ihtiyaç vardır. Bu çalışmanın amacı, 4 °C'de aktif olan bir proteinaz olan termolysin kullanılarak epidermal-dermal ayırma protokolünü tanımlamaktır. Bu prosedürü göstermek için, Sprague Dawley sıçanları uyuşturulur ve sağ arka pençelere karragenan enjekte edilir. Enjeksiyondan altı ve on iki saat sonra, iltihaplı ve naif sıçanlara sahip sıçanlar ötenaziye tabir edilir ve soğuk Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı'na bir parça arka pençe, glabrous derisi yerleştirilir. Epidermis daha sonra bodrum zarında pbs'de termolysin ile dermisten kalsiyum klorür ile ayrılır. Daha sonra, dermis mikrodiseksiyon tokmaları ile sabitlendirilir ve epidermis hafifçe alay edilir. Doku bölümlerinin toluidin mavisi lekesi, epidermisin bodrum zarındaki dermisten temiz bir şekilde ayrıldığını göstermektedir. Tüm keratinosit hücre katmanları bozulmadan kalır ve epidermal rete sırtları ve dermal papilladan girintiler açıkça gözlenir. Sinir büyüme faktörünü ve interlökin-6 ekspresyon düzeylerini belirlemek için nitel ve gerçek zamanlı RT-PCR kullanılır. Batı şişkinliği ve immünostokimya nihayet sinir büyüme faktörü miktarlarını tespit etmek için gerçekleştirilir. Bu rapor, soğuk termolysin sindiriminin, iltihaplanma sırasında mRNA ve protein değişikliklerinin değerlendirilmesi için epidermisi dermisten ayırmak için etkili bir yöntem olduğunu göstermektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İltihaplı dermis ve epidermis 1,2,3'tebulunan hücre tiplerinin heterojenliği nedeniyleinflamatuar mediatörlerin ve nörotrofik faktörlerin deriden değerlendirilmesi sınırlanabilir. İki katmanın ayrılmasını veya değerlendirme için hücre ayrıştırmasını içeren çeşitli enzimler, kimyasal, termal veya mekanik teknikler yakın zamanda gözden geçirilmiştir4. Asit, alkali, nötr tuz ve ısı epidermisi dermisten hızlı bir şekilde ayırabilir, ancak hücresel ve hücre dışı şişlik genellikle5,6. Tripsin, pankreas, elastaz, keratinaz, kollajenaz, pronaz, dispaz ve termolysin epidermal-dermal ayırma için kullanılan enzimlerdir4,7. Tripsin ve diğer geniş ölçekli proteolitik enzimler 37-40 °C'de aktiftir, ancak epidermal tabakaların ayrışmasını önlemek için dikkatlice izlenmelidir. Dispaz epidermisi lamina densa'da ayırır, ancak soğukta ayırma için 24 saat gerektirir4,8 veya daha kısa zaman noktalarında 37 °C4,9. Tüm bu tekniklerin sınırlayıcı bir özelliği, doku morfolojisinin potansiyel bozulması ve mRNA ve proteinin bütünlüğünü kaybetmesidir.

mRNA ve protein bütünlüğünü korumak için soğukta kısa bir süre cilt ayırma yöntemi yapılmalıdır. İltihaplanma çalışmaları için cilt ayırma tekniklerinin değerlendirilmesinde, termolisin epidermisi soğuk sıcaklıklarda dermisten ayırmak için etkili bir enzimdir4. Thermolysin 4 °C'de aktiftir, epidermal hemidezmosomes'ı lamina lucida'dan ayırır ve epidermisi 1–3 h 4,8,10içinde dermisten ayırır. Bu raporun amacı, iltihaplı mediatörler ve nörotrofik faktörler için mRNA ve protein seviyelerini tespit etmek için iltihaplı sıçan epidermisinin dermisten ayrılması için termolizin kullanımını optimize etmektir. Çeşitli ön raporlar11 , 12,13,14,15. Bu makalenin amacı termolisin kullanarak optimal bir cilt ayırma tekniğini tanımlamak ve 1) inflamasyon belirteçlerinin, 2) interlökin-6 (IL-6) mRNA'nın ve 3) karragenan kaynaklı inflamasyon (C-II)16,17olan sıçanların epiderminde sinir büyüme faktörü (NGF) mRNA ve proteinin tespitini göstermektir. Freund'un adjuvan modelinin tamamını kullanan bir ön rapor, NGF mRNA ve protein seviyelerinin iltihaplanma sırasında erken arttığını gösterir15. Farelerde, oksazolonun topikal uygulaması ile cilt duyarlılığı, in situ hibridizasyon36kullanarak IL-6 mRNA'da erken bir artışa neden olur. Hem IL-6 hem de NGF, C-II18,19'akarışmıştır,ancak C-II'nin akut aşamalarında özellikle epidermisin epidermisinden IL-6 veya NGF için mRNA veya protein seviyelerini açıklayan hiçbir rapor olmamıştır.

Termolysin tekniği ucuz ve basittir. Ayrıca, epidermisin dermisten termoliz ayrılması, iltihaplanma sürecinde mRNA, batı lekesi ve inflamatuar mediatörlerin ve nörotrofik faktörlerin immünohistokimyasal analizine izin verir15. Araştırmacılar bu tekniği cilt iltihabının hem klinik öncesi hem de klinik çalışmalarında kolayca kullanabilmelidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol Oklahoma Eyalet Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi IACUC'nin (#2016-03) hayvan bakım yönergelerini takip etmektedir.

1. Karragenan kaynaklı inflamasyon (C-II)

  1. Erkek ve/veya dişi Sprague Dawley sıçanlarını (200-250 g; 8-9 haftalık) izofluran (veya enjekte edilebilir anestezi) ile uyuşturmak.
  2. Korneaya dokunarak ve sol arka pençeyi hafifçe kıstırarak anestezinin derinliğini kontrol edin. Hayvan uygun şekilde uyuşturuldığında, kornea veya pençe yanıtı gözlenmez.
  3. Deri altından sağ glabrous, arka pençeyi fosfat tamponlu salin (PBS) 20 ile seyreltilmiş% 1 (w / v) φ-karragenan100μL ile enjekte edin.
    1. Bu raporda izofluran içermeyen naif sıçanlar gibi uygun kontrollerin kullanıldığından emin olun. İlk çalışmalar, izofluranlı veya izofluransız naif sıçanların epidermal IL-6 ve NGF'nin aynı bazal ifadesine sahip olduğunu göstermektedir.
      NOT: Deri altı salin veya PBS lokal inflamasyona neden olduğundan naif sıçanlar inflamasyon çalışmaları için tercih edilen kontrollerdir23,37.
  4. Karragenanın etkinliğini garanti etmek için C-II sıçanlarının ödemini değerlendirin (Şekil 1)20. Arka pençe metatarsal kalınlığını kaliperlerle ölçerek ödem miktarını belirleyin.
  5. 6-12 saat içinde, SıÇANLARA CO2 (veya enjekte edilebilir anestezik aşırı doz) ile ötenazi yapın ve keskin neşterle 1 mm x 2 mm glabrous arka pençe derisi parçaları kesin. Kıllı bir cilt kullanılıyorsa, 1 mm x 2 mm'lik deri parçalarını kesmeden önce tıraş edin.
    NOT: Belirli çalışmalara göre uygun zaman noktalarının seçildiğinden emin olun.
  6. Mikrodiseksiyon forseps kullanarak, cildi buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüpünde 1 mL soğuk Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamına (DMEM) aktarın ve 15-60 dakika soğuk tutun.

2. Epidermis ve dermisin termolysin ayrımı

  1. Termolysin hazırlayın ve etkinleştirin.
    1. pH = 8 'de (konsantrasyon 500 μg/mL) 10 mL PBS'ye 5 mg Geobacillus stearothermophilus ekleyerek bir termolisin çözeltisi hazırlayın.
    2. Damıtılmış H 2 O'nun10 mL'sine 1,11 g ekleyerek 1 M kalsiyum klorür çözeltisi (CaCl2susuz) hazırlayın.
    3. Termolizin otolizini önlemek için, 10 mL termolisin çözeltisine 10 μL kalsiyum klorür ekleyin. Kalsiyum klorür son konsantrasyonu 1 mM olacaktır.
    4. Aliquot 1 mL aktif termolysin buz üzerinde 24 kuyu hücre kültür plakasının 10 kuyuya.
  2. Epidermisi dermisten ayırmak için termolisin enzim sindirimini kullanın.
    1. Mikrodiseksiyonlu emişler kullanarak, aktif termolisin her kuyusuna bir cilt örneği aktarın. Cildi termolysin çözeltisine batırmamaya dikkat edin.
    2. Termolysin çözeltisi üzerinde yüzmek için forsepslerden cilt örneğinin serbest bırakılmasına yardımcı olmak için kuyunun kenarındaki cilde hafifçe dokunun.
    3. Cildi, stratum korneum (dış epidermis) tarafı yukarı ve dermis aşağı bakacak şekilde termolysin çözeltisine yüzdürün. Dermis'in yüzüstü yüzmesi, aksi doğru ayrımın gerçekleşmemesi kritik öneme sahiptir.
      NOT: Termolysin inkübasyonu için gereken süre son kullanıcı tarafından ampirik olarak belirlenmelidir. Sprague Dawley sıçanlarından (200-250 g; 8-9 haftalık) arka pençe derisi olan glabrous, genellikle ayırma için 2.0-2.5 saat gerektirir. Kuluçka süresinin türlere ve yaşa göre değişmesi bekmektedir.
    4. Termolysin'de uygun kuluçka süresinden sonra, bir cilt örneğini 7-8 mL soğuk (4 °C) DMEM'li 6 kuyu hücreli kültür plakasının kuyusuna aktarmak için mikrodiseksiyonlu tokmaklar kullanın. Bu, epidermisin dermisten ayrılması için daha fazla yer sağlar.
    5. Cildi DMEM'e daldır.
    6. Epidermisi, sınırlarda yarı saydam epidermisin neredeyse yarı saydam olduğu gözlenene kadar cildin çevresindeki epentlerle hafifçe fırçalayın. Bu sağlanamazsa, cilt örneğini 15-30 dakika daha termolysin çözeltisine geri verin.
    7. Epidermis dermisten belirgin bir şekilde ayrıldığında, mikrodiseksiyon toparlamaları ile hem epidermisi hem de dermisi dikkatlice tutun ve epidermisi dermisten çok yavaşça çekin.
    8. İzole epidermisin yarı saydamlıklarını değerlendirin ve optik olarak tutarlı olduğundan emin olun. 1 mm x 2 mm fare epidermisi örneği için Şekil 2'ye bakın. Yarı saydamlıkta bir varyasyon varsa, uygun ayırma gerçekleşmedi.
  3. Epidermis ve dermisin ayrılmış parçalarında etileniaminetetraasetik asit (EDTA) kullanarak termolisin inaktive edin.
    DİkKAT: Epidermisin ve dermiste kalan termolisin hala aktiftir ve inaktive edilmezse katmanlara zarar verebilir.
    1. 0,5 M EDTA stok çözümü hazırlayın. Bunu yapmak için, 5 mL çift damıtılmış suya yavaşça 0,93 g EDTA ekleyin. Temizleninceye kadar çözeltiye sodyum hidroksit ekleyin. Çözümün pH'ının ~8.0 olduğundan emin olun.
    2. DMEM'de 5 mM EDTA çözümü yapın. 25 mL DMEM'e 0,25 mL 0,5 M EDTA stok çözeltisi ekleyin.
    3. Termolisin aktivitesini devre dışı bırakmak için ayrılmış epidermisi ve dermisi 4 °C'de 5 mM EDTA/DMEM çözeltisine 30 dakika yerleştirin.
  4. Epidermisi tinctorial histoloji8, 9,10ile değerlendirin.
    1. Epidermisin bir kısmını% 10 nötr formalin, % 4 paraformaldehit veya% 0.25 paraformaldehitte, oda sıcaklığında (RT) 1 saat boyunca% 0.8 pilik asit çözeltisi ile ajitasyonla sabitlayın.
    2. Sabit epidermisin PBS'de % 10 sakkaroza ajitasyon ile RT'de 1 saat yerleştirin.
    3. Epidermisi, bölümleme için bir doku gömme matrisinde dondurun. Jelatin kaplı cam mikroskop slaytlarına kriyostat ve çözülmüş bölümler kullanarak 14 μm kesit kesin.
    4. Bir slayt ısıtıcısı üzerinde kuru bölümler ve 90 s için toluidin mavisi (TB; % 1 sodyum klorürde% 10 TB) çalışma çözeltisi ile lekeleyin. Sulu bir montaj ortamı ile aplike örtüler.
    5. Epidermisi 50x-250x'te parlak alan mikroskopisi ile gözlemleyin.
      NOT: Uygun ayırma meydana gelmişse, epidermis dermisten temiz bir şekilde bölünecek ve beş katman tespit edilecektir: stratum bazale, stratum spinosum, stratum granülozum, stratum lucidum ve stratum korneum. Şekil 3'teayrılmış sıçan derisi epidermisinin bir örneği görülebilir.

3. Protein ekstraksiyonu ve batı leke analizi

  1. Daha önce yayınlananprotokol 21'ikullanarak ayrılmış doku örneklerinde batı lekeleme gerçekleştirin.
  2. Fosfataz ve proteaz inhibitör kokteyli içeren 50 μL lizis tamponunda (25m Tris HCl, pH = 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, %5 gliserol ve %1 Triton X-100) epidermisi homojenize edin.
  3. 4 °C'de maksimum 15 dakika boyunca maksimum hızda numuneler santrifüj ve bir protein test kiti kullanarak süpernatantı protein konsantrasyonu için değerlendirir.
  4. SDS jellerine eşit konsantrasyonlarda protein (30 μg) yükleyin, elektroforezi gerçekleştirin ve ardından proteinleri nitroselüloz veya PVDF membranlarına aktarın.
  5. Membranları 2 saat boyunca% 5 sütle bloke edin ve primer antikorda bir gecede kuluçkaya yatırın (fare anti-NGF, E12, 1:1000).
  6. PBS ile 3x'i her biri 10 dakika boyunca% 0,3 arayla yıkayın ve etiketli ikincil antikorla (örneğin, tavşan faresi karşıtı IgG etiketli alkali fosfataz) kuluçkaya yatırın.
  7. Batı blot sinyalini değerlendirmek için bir tarama sistemi kullanın (örneğin, ECF substratı ve görüntüleme platformu).

4. İmmünohistokinoloji

  1. Doku örneklerini optimal immünoreaktivite için bir fiksatife yerleştirin: 0.1 M sodyum fosfat tamponunda% 0.96 (w/ v) poksit ve% 0.2 (w / v) formaldehit, pH = 7.321,22,RT'de 4 h için23. PBS'de bir gecede% 10 sakkaroza aktarın.
  2. Doku bölümleri21, 22,23üzerinde standart immünhistokimya gerçekleştirin.
  3. Hayvanlardan epidermisi gömme matrisinde tek bir donmuş bloğa gömün ve bir kriyostat üzerinde 10-30 μm bölüm kesin. Bölümleri jelatin kaplı, cam mikroskop slaytlarına monte edin ve 2 saat boyunca 37 °C'de kurutun.
  4. Bölümleri PBS'de üç, 10 dakika durulama için yıkayın ve birincil antiserada 24-96 saat kuluçkaya yatırın, [örneğin, fare anti-NGF (E12, 1:2000)] ve tavşan anti-protein gen ürünü 9.9 (PGP 9.5, 1:2000) %0,3 (w/v) Triton X-100 (PBS-T) PBS-T içeren PBS'de %0,5 sığır serum albümini (BSA) ve %0,5 polivinilipirrolidon (PVP) ile seyreltilmiştir.
  5. Birincil antiserum inkübasyondan sonra, BÖLÜMLERI PBS'de 10 dakika boyunca üç kez durulayın ve PBS-T'de seyreltilmiş Alexa Fluor 488 eşek anti-tavşan IgG (1:1000) ve Alexa Fluor 555 eşek fare karşıtı IgG'de (1:1000) RT'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
  6. Bölümleri PBS'de 10 dakika boyunca üç kez durulayın ve immünofluoresansın geri solukluğuna solmayan montaj ortamı ile kapak kapakları yapıştırın.

5. RNA izolasyonu ve cDNA sentezi

  1. Cilt örneklerinde standart ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) gerçekleştirin21. Fenol, guanidin izotiyosiyanat çözeltisi kullanarak toplam RNA'yı izole edin.
  2. Moloney murine lösemi virüsü ters transkriptaz tarafından tamamlayıcı DNA sentezi gerçekleştirin.
  3. NGF ve IL-6 amplifikasyonu için aşağıdaki astar dizilerini kullanın:
    NGF (Duyu) - GTGGACCCCAAACTGTTTAAGAAACGG
    NGF (Antisense) – GTGAGTCCTGTTGAAGGAGATTGTACCATG
    IL-6 (Duyu) - GCAATTCTGATTGTATGAACAGCGATGATGC;
    IL-6 (Antisense) – GTAGAAACGGAACTCCAGAGAGAGAG
  4. NGF ve IL-6 mRNA seviyelerini β-actin temizlik geni ile karşılaştırın:
    β-ACTIN (Duyu) - TGCGTGACATTAAAGAGAAGCTGTGCTATGG
    β-ACTIN (Antisense) – GAACCGCTCATTGCCGATAGTGATGA
  5. Bir qRT-PCR sistemi kullanarak termal cycler ve nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) kullanarak nitel RT-PCR ile değerlendirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sıçan arka pençesine karragenan enjeksiyonu kızarıklık ve ödem gibi klasik iltihap belirtilerine neden oldu16,17. Arka pençenin şişmesi mekanik kaliperlerle ölçüldü20. Karragenan işlemden önce her sıçan için pençe kalınlığının temel değeri elde edildi ve tekrar 6 saat ve 12 saat olarak ölçüldü. Pençe kalınlığı taban çizgisi değerlerine göre önemli ölçüde arttırılmıştır (Şekil 1).

Sı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma, sıçan arka pençesi glabrous derisinin epiderminin PBS'de termolysin (0,5 mG/mL) kullanılarak dermisten 2,5 saat boyunca 4 °C'de 1 mM kalsiyum klorür ile kolayca ayrıldığını belirledi. Histolojik değerlendirmede epidermisin bodrum zarındaki dermisin arasından ayrıldığı ve epidermal rete sırtlarının sağlam olduğu belirtilmiştir. Thermolysin, Gram-positive (Geo)Bacillus thermoproteolyticus24tarafından üretilen hücre dışı bir metalloendopeptidazdır. Aktivitesi 4 °C'de stabil...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların hiçbir açıklaması yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma için fon Ulusal Sağlık Enstitüleri NIH-AR047410 (KEM) tarafından sağlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
λ-İrlanda yosunuMillipore Sigma22049deri altı enjeksiyonu iltihaplanmaya neden olur
7500 Hızlı Gerçek Zamanlı PCR SistemiRT-PCR analizi içinThermo Fisher Scientific4351107
Kalsiyum klorür (CaCl2), susuzMillipore Sigma499609Termolizin Kristal Dağı Sulu Montaj Ortamının
otolizini önlerMillipore SigmaC0612Toluidin mavisi boyamadan sonra sulu montaj ortamı
Eşek anti-Fare Alexa Fluor 555Thermo Fisher ScientificA-31570İmmünohistokimya için ikincil antikor
Eşek anti-Tavşan IgG, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-21206İmmünohistokimya için ikincil antikor
Dulbecco'nun Modifiye Kartal OrtaTermo Balıkçısı Bilimsel11966-025Doku bütünlüğünü korumak için
Etilendiamintetraasetik asitMillipore SigmaE6758Termoliz reaksiyonunu durdurur
Moloney Murin Lösemi Virüsü (M-MLV) Ters transkriptazPromegaM1701Tamamlayıcı DNA sentezi için
Fare anti-NGF Antikoru (E-12)Santa Cruz Biyoteknolojisc-365944Nörotrofin için immünohistokimya
ProLong Altın Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36930İmmünofloresan söndürmeyi geciktirmek için
Tavşan anti-PGP 9.5Cedarlane LabsCL7756APİntraepidermal sinir boyama için
SAS Sprague Dawley SıçanCharles NehriSuş Kodu 400Enflamasyon çalışmaları için kullanılan hayvan
Shandon M-1 Gömme MatrisiTermo Fisher Scientific1310TSTentür ve immüno-histokimya için doku gömme matrisi
RT-PCR analizi içinSimpliAmp Thermal CyclerThermo Fisher ScientificA24811
RT-PCR analizi içinSYBR Select Master MixThermo Fisher Scientific4472908
Geobacillus stearothermophilus'tan
Thermolysin Millipore Sigma T7902Toluidin MaviMillipore Sigma89640Parlak alan mikroskobu için tentür boyama için
TRIzol ReaktifiThermo Fisher Scientific15596026RTPCR için toplam RNA ekstraksiyonu için
İrlanda yosununun

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Choi, J. E., Di Nardo, A. Skin neurogenic inflammation. Seminars in Immunopathology. 40 (3), 249-259 (2018).
  2. Manti, S., Brown, P., Perez, M. K., Piedimonte, G. The role of neurotrophins in inflammation and allergy. Vitamins and Hormones. 104, 313-341 (2017).
  3. Schäkel, K., Schön, M. P., Ghoreschi, K. Pathogenesis of psoriasis. Zeitschrift für Dermatologie, Venerologie, und verwandte Gebiete. 67 (6), 422-431 (2016).
  4. Zou, Y., Maibach, H. I. Dermal-epidermal separation methods: research implications. Archives of Dermatological Research. 310 (1), 1-9 (2018).
  5. Baumberger, J. Methods for the separation of epidermis from dermis and some physiologic and chemical properties of isolated epidermis. Journal of the National Cancer Institute. 2, 413-423 (1942).
  6. Felsher, Z. Studies on the adherence of the epidermis to the corium. Journal of Investigative Dermatology. 8, 35-47 (1947).
  7. Einbinder, J. M., Walzer, R. A., Mandl, I. Epidermal-dermal separation with proteolytic enzymes. Journal of Investigative Dermatology. 46, 492-504 (1966).
  8. Rakhorst, H. A., et al. Mucosal keratinocyte isolation: a short comparative study on thermolysin and dispase. International Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 35 (10), 935-940 (2006).
  9. Tschachler, E., et al. Sheet preparations expose the dermal nerve plexus of human skin and render the dermal nerve end organ accessible to extensive analysis. Journal of Investigative Dermatology. 122 (1), 177-182 (2004).
  10. Walzer, C., Benathan, M., Frenk, E. Thermolysin treatment-a new method for dermo-epidermal separation. Journal of Investigative Dermatology. 92, 78-81 (1989).
  11. Anderson, M. B., Miller, K. E., Schechter, R. Evaluation of rat epidermis and dermis following thermolysin separation: PGP 9.5 and Nav 1.8 localization. Society for Neuroscience Abstract. 584 (9), (2010).
  12. Ibitokun, B. O., Anderson, M. B., Miller, K. E. Separation of corneal epithelium from the stroma using thermolysin: evaluation of corneal afferents. Society for Neuroscience Abstract. , 584(2010).
  13. Nawani, P., Anderson, M., Miller, K. E. Structure-property relationship of skin. Oklahoma Center for Neuroscience Symposium Abstract. , # 17 (2011).
  14. Anderson, M. B., Miller, K. E. Intra-epidermal nerve fiber reconstruction and quantification in three-dimensions. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23(2017).
  15. Gujar, V. K. E., Miller, K. E. Expression of nerve growth factor in adjuvant-induced arthritis (AIA): A temporal study. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23(2017).
  16. Vinegar, R., et al. to carrageenan-induced inflammation in the hind limb of the rat. Federation Proceedings. 46 (1), 118-126 (1987).
  17. Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund's Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 5, Unit 5.4 (2012).
  18. Li, K. K., et al. exerts its anti-inflammatory effects associated with suppressing ERK/p38 MAPK and Heme Oxygenase-1 activation in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages and carrageenan-induced mice paw edema. International Immunopharmacology. 54, 366-374 (2018).
  19. Sammons, M. J., et al. Carrageenan-induced thermal hyperalgesia in the mouse: role of nerve growth factor and the mitogen-activated protein kinase pathway. Brain Research. 876 (1-2), 48-54 (2000).
  20. Hoffman, E. M., Miller, K. E. Peripheral inhibition of glutaminase reduces carrageenan induced Fos expression in the superficial dorsal horn of the rat. Neuroscience Letters. 472 (3), 157-160 (2010).
  21. Crosby, H. A., Ihnat, M., Spencer, D., Miller, K. E. Expression of glutaminase and vesicular glutamate transporter type 2 immunoreactivity in rat sacral dorsal root ganglia following a surgical tail incision. Pharmacy and Pharmacology International Journal. 2 (3), 00023(2015).
  22. Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative composition alters distributions of immunoreactivity for glutaminase and two markers of nociceptive neurons Nav1.8 and TRPV1, in the rat dorsal ganglion. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (4), 329-344 (2010).
  23. Hoffman, E. M., Zhang, Z., Schechter, R., Miller, K. E. Glutaminase increases in rat dorsal root ganglion neurons after unilateral adjuvant-induced hind paw inflammation. Biomolecules. 6 (1), 10(2016).
  24. van den Burg, B., Eijsink, V. Thermolysin and related Bacillus metallopeptidases. Handbook of Proteolytic Enzymes. , Volume 1, Chapter 111 540-553 (2013).
  25. Matthews, B. W. Thermolysin. Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry. , (2011).
  26. Hybbinette, S., Boström, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental Dermatology. 8 (1), 30-38 (1999).
  27. Glade, C. P., et al. Multiparameter flow cytometric characterization of epidermal cell suspensions prepared from normal and hyperproliferative human skin using an optimized thermolysin-trypsin protocol. Archives of Dermatological Research. 288 (4), 203-210 (1996).
  28. Sato, J. D., Kan, M. Media for culture of mammalian cells. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1: Unit 1.2 (2001).
  29. Gragnani, A., Sobral, C. S., Ferreira, L. M. Thermolysin in human cultured keratinocyte isolation. Brazilian Journal of Biology. 67 (1), 105-109 (2007).
  30. Germain, L., et al. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
  31. Michel, M., et al. Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (6), 318-326 (1999).
  32. Fassina, G., et al. Autolysis of thermolysin. Isolation and characterization of a folded three-fragment complex. European Journal of Biochemistry. 156 (2), 221-228 (1986).
  33. Petho, G., Reeh, P. W. Sensory and signaling mechanisms of bradykinin, eicosanoids, platelet-activating factor, and nitric oxide in peripheral nociceptors. Physiological Reviews. 92 (4), 1699-1775 (2012).
  34. Djouhri, L., et al. Time course and nerve growth factor dependence of inflammation-induced alterations in electrophysiological membrane properties in nociceptive primary afferent neurons. Journal of Neuroscience. 21 (22), 8722-8733 (2001).
  35. Denk, F., Bennett, D. L., McMahon, S. B. Nerve growth factor and pain mechanisms. Annual Review of Neuroscience. 40, 307-325 (2017).
  36. Flint, M. S., Dearman, R. J., Kimber, I., Hotchkiss, S. A. Production and in situ localization of cutaneous tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin 6 (IL-6) following skin sensitization. Cytokine. 10 (3), 213-219 (1998).
  37. Crosby, H. A., Ihnat, M., Miller, K. E. Evaluating the toxicity of the analgesic glutaminase inhibitor 6-diazo-5-oxo-L-norleucine in vitro and on rat dermal skin fibroblasts. MOJ Toxicology. 1 (1), 00005(2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Epidermal Dermal SeparationThermolysin DigestionSkin Inflammation ModelNerve Growth FactorInterleukin 6 ExpressionWestern BlottingImmunohistochemistryToluidine Blue StainingCarrageenan Induced InflammationSprague Dawley Rats

İlgili makaleler