Hemorajik Inme patolojik sonuçlarını Incelemek için zebrafish larva kullanma

İntrakerebral kanama (ıCH), spontan serebral damar rüptür ve beyin hasarı, fiziksel özürlülük ve genellikle ölüm¹olan parankimat içine kanama ile ilişkili en şiddetli alt tip inme olduğunu. Ich²ile ilişkili yüksek mortalite ve morbidite oranına rağmen, destek etiyolojisi ve kanama sonrası patolojinin anlaşılması hala eksiktir. Bu nedenle, ıCH önlemek veya hasta sonuçlarını iyileştirmek için özel tedaviler yoktur. Hastalık biyolojisinin anlayışımızın çoğu, Ich³' ün klinik öncesi kemirgen modellerinden geliyor, ancak bu modellerde yapılan çalışmalar, herhangi bir başarılı terapötik terapi için klinik^4,5' e çeviremedi. Bu başarısızlık kısmen, bu preklinik modellerin bazı sınırlamalar için, kolayca insan hastalığının spontan doğası ve invaziv cerrahi gereksinimi memelilerde modelleri oluşturmak için reapitulate dahil olmak üzere olabilir⁶. Ayrıca, kemirgenler bozulmamış doku içinde ıCH hücresel tepkiler hızlı başlangıcı gözlemlemeye ilişkin pratik sorunlar oluşturmaktadır. Kemirgen modellerinden çeviri eksikliği göz önüne alındığında, spontan ıCH alternatif modelleri geliştirmek bu pratik sorunları aşmak ve yeni uyuşturucu hedeflerini belirlemeye yardımcı olmak için zorunludur.

Vasküler gelişimin moleküler mekanizmaları, zebra balığı (Danio rerio)⁷de dahil olmak üzere vertebratlar arasında iyi şekilde tutulurlar. Bu nedenle, bu model organizmanın benimsenmesi serebrovasküler hastalığı incelemek için her zamankinden daha kullanışlı bir mekanik strateji haline geliyor⁸. Bir dizi zebra balığı modelleri, inme ile ilgili koşullar ile ilgili fenotipleri özetlemek üretilir^9,10,11,12. Hastalık patogenezi araştırmak için zebra balığı larvaları kullanımı, memelinin modelleri üzerinde hem pratik hem de bilimsel avantajlar sunar⁸. Bu yüksek üreme oranları, hızlı gelişim ve intravital görüntüleme için kemirgenler ile ilişkili invaziv kısıtlamalar olmadan sağlar larva şeffaflık içerir. Zebra balığı araştırma topluluğunun içinde mevcut olan çok çeşitli transgenik muhabir hatları ile bu avantajları kavramak, hastalık biyolojisi eğitimi için güçlü bir In vivo yaklaşımıdır, henüz patolojik çalışmalar için kullanılmaz ıCH sonuçları.

Beynin kan yaralanma tepkisi bifazik¹³; birincil hakaret nöronal ölüm ve hücre nekrozu neden olur, daha sonra doğuştan gelen bağışıklık aktivasyonu ile indüklenen bir hasar ikincil dalgası başlatır. Beyin yaralanması ikinci aşaması, özellikle nöroinflamatuar bileşeni, gelecekteki ilaç tedavisi için gerçekçi bir hedef olarak kabul edilir¹³. Zebra balığı larvaları daha önce^{14,15,16,17,18,19}' da spontan ve serebral özel hemorajler tarif edilmiştir. İki tür modeller atorvastatin kullanımı (ATV) at 24 h sonrası fertilizasyon (HPF) inhibe hmgcr yol ve kolesterol biyosentezi¹⁴, ve bir balon kafa (BBH) arhgef7 geni bir Hipomorfik mutasyon ifade mutant, βpix, ve daha sonra sıkı endovasküler kavşaklar için aktin remodeling inhibe¹⁸. Bu modeller dolaşım başlangıcında spontan serebral spesifik kan damar rüptürü sergiler (~ 33 HPF). Son zamanlarda, bu modeller daha fazla beyin hasarı tepkisi önemli yönlerini insanlar ve zebra balığı larvaları arasında tutulmaktadır ortaya çıkarmak için karakterize ettik²⁰. Bu çalışmada, zebra balığı larvaları içinde spontan beyin hemorajinin elde edilmesi ve görselleştirilmesi için gereken metodoloji ve insan durumu ile ilgili olarak beyin yaralanması, lokomotor ve nöroinflamatuar fenotiplerin nasıl ölçüleceği gösterilmektedir. Bu veri ve teknikler, klinik öncesi ıCH araştırmaları için değerli bir tamamlayıcı sistem olarak bu model türlerinin kullanımını desteklemektedir.

Zebrafish, daha önce²¹' de açıklandığı gibi, Manchester Üniversitesi biyolojik hizmetler birimi 'nde standart koşullar altında büyüdü ve sürdürülür. Yetişkin zebra balığı yetiştiriciliği Manchester Üniversitesi hayvan refahı ve etik İnceleme Kurulu tarafından onaylandı. Tüm deneyler İngiltere ev ofisi yönetmeliklerine (PPL: P132EB6D7) uygun olarak gerçekleştirildi.

Not: Bu çalışmada kullanılan transjenik çizgiler macrophage özgü Lineage MPEG1 içerir:MCherry (daha önce açıklanan²²), nötrofil özgü MPO:Gfp²³,erythroid özgü gata1: DSRed²⁴ ve ubiq:secannexinv-mvenus, hücre ölümü için bir muhabir (ev²⁵' te yeniden türedi)vahşi tip, nacre (mitfa^W2/W2) ve mutant (BBH^m292) arka planlar. Şekil 1 deneysel zaman çizelgesini gösterir.

Şekil 1 : Beyin hasarı, lokomotor ve nöroinflamatuar sonuçları karakterize etmek için deneysel zaman çizelgesi grafik. ICH, intrakerebral kanama; BBH, bubblehead. Şekil Crilly ve al.²⁰ ' den bir Creative Commons lisansı altında izni ile çoğaltılmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. 

1. gün 0: yumurta üretimi ve toplanması

1. 1 erkek ve 1-2 kadın yetişkin zebrafish üretilen üreme kutularında doğal yumurtlama döllenmiş embriyo toplayın.
   Not: atorvastatin Protokolü Için herhangi bir wildtype/transgenik hayvanlar kullanılabilir ancak kanama oranları suşları arasında biraz farklılık gösterebilir.
2. Standart kurallar²⁶' ya göre Petri tabağı ve sahne başına standart E3 embriyo orta olarak 28 °c ' de 100 embriyoları inküat.
3. ~ 6 saat sonrası döllenme (HPF) Pasteur pipet kullanarak yemden ölü ve döllenmemiş embriyoları çıkarın.

2. gün 1: atorvastatin tedavi 24 HPF

1. NET Ultra ince diseksiyon forseps kullanarak atorvastatin tedavisi için dechorionate embriyo²⁷. Denemeler için gerekli sayılar buna göre ayarlanabilir.
2. İki temiz Petri yemek için E3 embriyo orta 30 mL ekleyin. 100 embriyo için bir çanak kullanın.
   Not: plakalar hücre kültürü için tasarlanmış ise, bu erken aşamada dechorionated zebra balığı genellikle alt sopa. Bunu önlemek için, kullanmadan önce plakaları iyice temiz suya durulayın.
3. Tedavi plakasını 60 μL embriyo suyu çıkarın ve 60 μL 0,5 mM atorvastatin (ATV) ekleyin. 0,5 mM 'Lik stok konsantrasyonunda, yukarıdaki seyreltme, larvanın kanama olmayan (ICH-)% 20 ' sini 80 ve larvaları kanama (ıCH +) ' nın% ~%% ' ine neden olacak 1 μM son konsantrasyona neden olacaktır. Tedavi edilmeyen kontroller için diğer plakası kullanın
   Not: atorvastatin, 0,5 mM 'Lik bir stok solüsyonu yapmak için distile suda (10 mL 'ye 3 mg) çözünmüştür. Çözündürme biraz zaman alır gibi agitasyon ile karanlıkta oda sıcaklığında bir gecede inküye. Komple çözünme 1 hafta kadar sürebilir. DMSO kullanmayın. Çözüm,-20 °C ' de saklanır. Çözünme dondurmayın.
4. Pasteur pipet kullanarak, 100 embriyoları tedavi plakalarına mümkün olduğunca az su olarak aktarın.
5. Levhaları 28 °C ' de kulyatın.
   Not: 33 ve 48 HPF arasında ıCH gerçekleşir. Atorvastatin 'in 24 h 'den uzun kuluçk olarak kaldırılması gerekmez daha fazla gelişim sorunlarına neden olmaz.

3. gün 2:50 HPF 'de ıCH-ve ıCH + nüfusunun ayrılması

1. ICH 'den ayrı ıCH + balık-nüfus ve kolaylıkla yeni yemeklerle transfer.
   1. ATV modelini 1 μM konsantrasyonda kullanıyorsanız, larvaları% 75-100 ' i bu zaman noktasında hemoraj (ıCH +) sergileyecektir.
      Not: larvaları, larva istenilen frekanslarda kanama yoksa, atorvastatin yeni bir toplu veya daha yüksek bir konsantrasyon kullanmak, suşları arasında farklıdır. Larvaları 48 HPF tarafından kanama sergilememiş ise o zaman onları ıCH-düşünün.
   2. BBH modelini kullanıyorsanız, tüm homozigot mutantlar 48 HPF tarafından kanama sergileyecektir. Bir heterozigot incross kullanıyorsanız, Ich-heterozigot ve wildtype kardeşler deneyler için denetim hayvanları olarak kullanılabilir.
2. Gerekirse, larvaları, E3 ortamına 0,02% MS222 ekleyerek anestezize etme. Pasteur pipet kullanarak, Kafadaki kan varlığı için larvaları yeni E3 medyasında sıralayabilirsiniz. Bkz. Şekil 2.
   Not: baş kanı ön, orta veya arka beyin ya da kombinasyon halinde görünebilir ve kanama hacmi hayvanlar arasında farklılık gösterebilir. BBH mutantlar, ıCG genellikle büyük kafaları tarafından tanınabilir şiddetli ödem ile ilişkilidir, gözler ve daha geniş boşluk arasında daha fazla taşma kanama. Ancak tüm ıCG + BBH larvaları ödemi sergiler.

Şekil 2 : Ich + beyin hemoraj fenotipleri. Bir transgenik gata1 tutulan larva Ich fenotipleri örnekleri: DSRed muhabir nacre arka plan bir aydınlık alan mikroskoptan (üst paneller) ve floresan (alt panel) ile gözlenen ~ 48 h sonrası fertilizasyon. ICH-larva (sol paneller) ' de kanama görülmemiştir. Ich + larvaları (sağ paneller), önefe ve arka beyin (oklar) kırmızı kan hücrelerinin ayrı bir birikimi gözlenmiştir. Ölçek çubukları 250 μm temsil eder. Şekil Crilly ve al.²⁰ ' den bir Creative Commons lisansı altında izni ile çoğaltılmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. 

4. gün 3:72 HPF 'de hücre ölümü ve lökosit Analizi

1. Floresan protein ifadesi sağlamak için bir floresan mikroskop kullanarak larvaları ekran.
   Not: Bu çalışmada, transjenik ubiq: secannexinv-mvenus larvaları beyin hücresi ölümü ve çift transgenik MPOraporu için kullanılmıştır: Gfp; MPEG1: MCherry veya ubiq: secannexinv-mvenus; MPEG1: lökosit analizi için kullanılan MCherry.
2. 0,02% MS222 içeren E3 medyasını içeren lightsheet montaj odasını doldurun.
3. Larvalar kullanarak anestezize 0,02% MS222. Montaj (n = 1-6) için larvaları, tek bir damlacık içinde kuru Petri çanak yüzeyine aktarın. Mümkün olduğunca fazla sıvı çıkarın.
   Not: 1,5% düşük Melt agaroz, mikrodalgada metilen mavisi olmaksızın 10 ml E3 ortamında çözülmüş ve 45 °c ' de kullanılıncaya kadar tutulan düşük Melt agaroz 0,15 g kullanılarak hazırlanır.
4. Bir damla 1,5% düşük Melt agaroz ekleyin (bir 45 °c ısı bloğunda sıvı olarak tutulur) larvaya ve bir 800 μm montaj kılcal kullanarak ve larvaları ilk önce yukarı çizin. Konumlandırma doğru değilse larvalar agaroz 'den atılabilir ve tekrar monte edilebilir. Lightsheet odasına takmadan önce kapiller soğumaya bırakın.
   Not: Alternatif olarak, bu prosedür için bir Konfokal mikroskop kullanılabilir. Bunun için, larvaları bir cam alt çanak üzerinde agaroz yanal monte edilmelidir.
5. Göz lensler (~ 300 μm) ve maksimum yoğunluk projeksiyon görüntü süreci arasında kafa z-yığını görüntüleri elde.
   1. Toplam floresan hücre sayısı ve toplam yoğunluk floresan²⁰için toplanan görüntülerden beyin bölgesini analiz edin.
6. Lökosit hareketlilik ve ölüm hücreleri ile etkileşim izlemek için 18-24 h üzerinde birden fazla projeksiyon kompozitlerin bir zaman atlamalı video oluşturun.
   Not: uzun vadeli canlı görüntüleme yapıldığında, kapiller sadece bir larva monte edilir.
7. Görüntüleme tamamlandığında, larvaları montaj kapiller arasında ölümcül bir aşırı dozda% 4 MS222 ötenize etmek için uzaklaştırın.

5. gün 3:72 HPF 'de motilite tahlili için larvaları seçme

1. 0,02% MS222 ile Petri yemeklerinden anestezize larvaları.
2. Rastgele seçin n = 24 motilite tahlil için larva ve yeni E3 medya içine transfer ve hayvanların anestezik kurtarmak için izin.
   Not: Bu noktada anestezik yakalamak kolay yavaş yüzücüler için seçim önyargı kaldırır.

6. gün 3-5:72, 96 ve 120 HPF at lokomotif Asdiyerek

1. 72 HPF 'de seçilen transfer larvaları metilen mavisi olmadan E3 orta haline gelmiştir.
   Not: 3 DPF 'de larvaları bol zaman anestezik (> 1 h) kurtarmak için izin vermek Için.
2. Bir pipet kullanarak 24-kuyu plakasının iyi başına 1 mL plaka bir larva.
   Not: larvaları zarar görmesini önlemek için pipet ucunun ucunu kesin. Plaka boyutu deneysel tasarıma göre değiştirilebilir.
3. Spontan yüzme artırmak için beyaz ışık korkutmak rutin kullanarak 10 dakika için kamera odasına ve tahlil hareket içine plakaları yükleyin.
   Not: yüzme davranışı bir kamera odası ve izleme yazılımı kullanılarak izlenir ( malzeme tablosunabakın).
4. 96 ve 120 HPF 'de aynı larvaları ile deneyi tekrarlayın. Test plakasında bulunan bireysel konutların larvaları Petri tabağına taşıyın ve 28 °C ' de asder arasında inkük yapın.
5. Tahlil tamamlandığında, ölümcül bir aşırı doz içinde ötenize larva 4% MS222.

Transjenik ubıqkullanarak beyin hücresi ölümü değerlendirilmesi: secannexinv-mvenus, tüm Ich-larva ' d a yok olan hem ATV hem de bby modellerinde ICG + larvaları içinde ölen hücrelerin net kesin kümeleri ile sonuçlanır (Şekil 3). Kümeleri 96 HPF önce geri. Görüntü analizi sayesinde, kanama beyinde floresans sinyalinin toplam yoğunluğunda önemli iki kat artış ile ilişkilidir, işaretlenmiş hücre ölümü gösteren.

ICH + larvaları içinde, beynin MPEG1 pozitif makrophaj hücrelerinin sayıları önemli ölçüde artan bir nöroinflamatuar yanıt tanımlanır. Toplam MPO pozitif nötrofil hücrelerinin sayısı da arttı ancak bu istatistiksel öneme ulaşamadı (Şekil 4). MPEG1 pozitif makrofajların morfolojisi, hücreler aktif, yuvarlatılmış, Kökbacaklılar şekli benimsemek olarak Ich + larvaları değiştirmek için de görülebilir. Bu aktif yuvarlak hücreler aynı zamanda ubıq'nun artan bir fagositik tepkisi göstermek için zaman içinde izlenebilir: secannexinv-mvenus, Ich + larva 'daki ölüm hücrelerini ifade ediyor (Şekil 5). MPEG1 pozitif makrofajlar sergileme dallanmış süreçleri etkin olarak kategorize edildi.

Beyin kanaması, 72 ve 96 HPF 'de motilite önemli bir düşüş ile ilişkilidir, hem BBH hem de ATV modellerinde ıCY-kardeş kontrollerine kıyasla (Şekil 6). 120 HPF 'de motilite, temel seviyelere yakın şekilde kurtarır. Genellikle yumurta debriyajlar ve suşları arasında temel motilite farklılıkları vardır ve bu nedenle karşılaştırma ıCH yapılmalıdır-her zaman kontrol eder.

Şekil 3 : Zebra balığı larvlarda intrakerebral kanama (Ich) ölçülebilir bir beyin yaralanmasına neden olur. (A) Ich + larvaları (sağ paneller) içinde beyin hasarı fenotipinin temsili görüntüleri, Ich-kardeşler (sol paneller) ile karşılaştırıldığında, 72 HPF. Brightfield görüntüleri (alt paneller, ölçek çubuğu = 250 μm) ıCG + larvada beyin kanamaları (oklar) varlığını göstermektedir. Ubiq:secannexinv-mvenus Reporter satırında (üst paneller, ölçek çubuğu = 100 μm) hücre ölümünü görselleştirmek için Floresan Mikroskobu yapılmıştır. Peri-hematomal bölgelerde ölen hücrelerin kümeleri gözlenmiştir. Görüntüler sadece beyin bölgelerine kırpılıyorlardı ve ek dosya 1' de makroyu kullanarak, çapı 30 pikselden (beyaz çizgi) büyük yuvarlak partiküllerde toplam yeşil floresan yoğunluğu için analiz edilmiştir. (B) ATV modeli (n = 12 Grup başına; 3 bağımsız çoğaltır) ile elde edilen, tedavi edilmemiş, Ich-ve Ich + larvaları beyinlerinde floresans sinyalinin ölçülmesini 72 HPF. ICH + ile tedavi edilmemiş (* * p = 0,004) ve ıCH-(* p = 0,03) kardeşler ile karşılaştırılırken önemli farklılıklar gözlenmiştir. (C) 72 HPF 'de balon kafa (BBH) modeli (grup başına n = 12; 2 bağımsız çoğaltır) ile elde edilen ICG-ve ICU + larvasının beyinlerinde annexinv bağlayıcı için okuma olarak floresan sinyalinin ölçülmesini. Grafikler ortalama SD gösterir. ICH + ve ıCH-yaş eşleştirilen kardeşler arasında mVenus floresan önemli bir fark görüldü (* * p = 0,002). Şekil Crilly ve al.20 ' den bir Creative Commons lisansı altında izni ile çoğaltılmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 4 : İntrakerebral kanama (Ich) zebra balığı larva beyninde içsel bir hücresel bağışıklık tepkisi başlatır. Daha önce MPO için açıklanan beyin bölgelerinde nicelik lökosit sayısı: GFP; MPEG1: dsRed çift transjenik larvaları (grup başına n = 8; 2 bağımsız çoğaltır) 72 HPF makrofajlarda önemli bir artış ortaya çıkarır (* p = 0,01), ancak nötrofiller (p = 0,5), ıCH yanıt olarak. Şekil Crilly ve al.20 ' den bir Creative Commons lisansı altında izni ile çoğaltılmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. 

Şekil 5 : Aktif makrophaj hücreleri beyin lezyonunun fagositik tepkisini gösteriyor. (A) temsili zaman atlamalı fotoğraf20 bir annexinv pozitif hücreye doğru göç bir dallanmış devriye makrophage gösteren (i-vi). Stills bir 20X amacı kullanarak tüm beyin alınan görüntüleri bir dizi elde edilir. Ölçek çubuğu 50 μm temsil eder. Makrofaj annexinv-pozitif hücre (VI, VII) phagocytosing önce bir Kökbacaklılar morfoloji (v) satın aldı. Phagositoz sonrası makrofaj bir dallanmış morfoloji devam eder ve uzaklaşır ve annexinv-pozitif hücre artık görülebilir (VIII). Ramified makrofaj (#), annexinv pozitif hücre (ok), Kökbacaklılar makrofaj (*) belirtilir. (B) Ich-ve Ich + larva beyninde MPEG1-pozitif hücrelerin temsili görüntüleri Kökbacaklılar ve dallanmış Morphologies sergileme. Ölçek çubukları 50 μm ' sini temsil eder. (C) Ich-kardeşlere kıyasla Ich + beyinde artan oranda Kökbacaklılar (fagositik) ve azalmış oran (aktif olmayan) makrofajlar gözlenmiştir. Şekil Crilly ve al.20 ' den bir Creative Commons lisansı altında izni ile çoğaltılmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. 

Şekil 6 : Zebra balığı larva 'da ölçülebilir bir lokomotor açığı ile Ich kaynaklı beyin hasarı sonuçlanır. (A) 72, 96 ve 120 HPF 'de ich-ve ich + BBH larvaları 'ndaki yüzme pistlerinin temsili örnekleri. (B) Ich + larvaları, hem 72 hem de 96 HPF 'de 10 dk kayıt döneminde mobil harcanan toplu süre içinde önemli bir düşüş sergiledi. 120 HPF zaman noktasında potansiyel olarak beyin yaralanması (n = 24 larva grubu başına; 3 bağımsız çoğaltır; * * * * p = 0,00006; * * p = 0,003; NS: p = 0,08) geri kazanımı için anlam kaybı oldu. (C) 120 HPF 'de tedavi EDILMEMIŞ ve ATV TEDAVI edilen Ick-ve Ich + larvaları içinde hareket eden toplu zamanın ölçülmesini. ICH + larvaları, 10 dakika kayıt döneminde mobil harcanan toplu süre içinde önemli bir düşüş sergiledi. Ortalama (* * * p = 0,00004, * * p = 0,0003) SD hesaplamak için üç teknik çoğaltır (grup başına n = 24 larva) kullanılmıştır. Şekil Crilly ve al.20 ' den bir Creative Commons lisansı altında izni ile çoğaltılmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. 

Ek dosya 1. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.