Yöntem makalesi

Enjekte Gryllus bimaculatus Yumurta

DOI:

10.3791/59726

⸱

22 Ağustos 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Colby College, 2Division of Evolutionary Developmental Biology, National Institute for Basic Biology, 3Department of Biological Sciences, National University of Singapore, 4Department Biology and Department of Neuroscience, Bowdoin College, 5Department of Organismic and Evolutionary Biology and Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada kriket yumurtaları enjekte etmek için bir protokol salıyoruz, kriketteki birçok deneyde temel bir yöntem olarak hizmet veren bir teknik, RNA paraziti ve genomik manipülasyon dahil, ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gelişmekte olan bir organizmada gen işlevini değiştirmek farklı deney türlerinin merkezinde yer alıyor. Geleneksel model sistemlerinde son derece güçlü genetik araçlar geliştirilmiş olmakla birlikte, diğer organizmalarda genleri veya haberci RNA'yı (mRNA) işlemek zordur. Aynı zamanda, evrimsel ve karşılaştırmalı yaklaşımlar birçok farklı türde gen fonksiyonunun araştırılmasına dayanıyor, bu da şu anda genetik olarak kontrol edilebilir olan dış ifadeyi manipüle etme tekniklerinin geliştirilmesini ve uyarlanmasına ihtiyaç diliyor. Tür. Bu protokol, belirli bir manipülasyonun embriyonik veya larva gelişimi üzerindeki etkilerini tetkiklemek için kriket yumurtalarına reaktif enjekte etme yöntemini tanımlar. Yontucu iğnelerle yumurtaların nasıl toplanıp enjekte edilene ilgili talimatlar açıklanmıştır. Bu nispeten basit teknik esnek tir ve diğer böceklere karşı potansiyel olarak uyarlanabilir. Tek bir deneyde düzinelerce yumurta toplayıp enjekte edilebilen bir kişi, tampon aparatların sağkalım oranları pratikte iyileşir ve %80'e kadar çıkabilir. Bu teknik, farmakolojik ajanların enjeksiyonu, ilgi genlerini ifade etmek için in vitro kapaklı mRNA, RNA girişimini sağlamak için çift iplikli RNA (dsRNA), kümelenmiş düzenli olarak kullanımı gibi çeşitli deneysel yaklaşımları destekleyecektir. genomik modifikasyon için CRISPR ilişkili protein 9 (Cas9) reaktifleri ve geçici veya kararlı transgenik çizgiler oluşturmak için geçirilebilir elementler ile birlikte uzaya kısa palindromik tekrarlar (CRISPR).

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organizmalarda genomu değiştirebilme veya gen ekspresyonunu etkileme yeteneği, fonksiyonel nedenselliği test eden birçok deney türünün tasarımının temelini oluşturur. Genomik ve genomik olmayan modifikasyon tekniklerinin geleneksel genetik laboratuvar hayvan model sistemleri dışındaki organizmalarda bulunması karşılaştırmalı ve evrimsel olarak ilgili çalışmalar için de önemlidir (örneğin, Mus musculus, Danio rerio, Drosophila melanogaster, ve Caenorhabditis elegans). İster organizma çeşitliliğini anlamak için arzu1 veya Krogh ilkesine bir bağlılık, her biyolojik soru için en iyi çözüm 2 uygun bir organizma olduğunu,3, genomları değiştirmek için yeteneği ya da gen ekspresyonunun modern deneysel tasarımlar için gerekli olduğu etkidir.

Kriket Gryllus bimaculatus gelişmekte olan bir model sistemidir. Nöroethology deneylerde son yüzyılda kullanılan4, son yirmi yılda kriket artan bir deneysel ilgi tanık, özellikle bu organizmanın evrimi ve gelişimi üzerinde duruldu5. Kriket d. melanogaster ve Tribolyum castaneum6gibi iyi çalışılmış holometabolöz böcekler, bazal dalları hemimetabolous böcek. Evrim ağacı üzerindeki yararlı konumu nedeniyle, bilim adamları g. bimaculatuskullanımı için moleküler araçlar adapte artan bir ilgi yol açmıştır bu böcek, modern, sofistike deneysel sorular soran ilgileniyoruz.

Kriket yumurtalarına moleküler reaktif enjeksiyonları genomik modifikasyon deneyleri ve embriyolarda gen ekspresyonunun genomik olmayan manipülasyonları için kullanılabilir. Örneğin, transgenik G. eGFP eklemeleri taşıyan bimaculatus transposaz piggyBac7,8kullanılarak oluşturulmuştur. Araştırmacılar başarıyla çinko-parmak nükleazlar kullanarak nakavt G. bimaculatus yarattık (ZFNs) ve transkripsiyon aktivatör benzeri (TAL) efektör nükleazlar (TALENs) belirli genomik bölgelerde çift iplikli tatili tanıtmak için9. ZFN'ler ve TALEN'ler büyük dört model sistemlerinin ötesindeki hayvanlarda siteye özgü hedeflemeye izin vermesine rağmen, bu reaktifler kullanımı daha kolay, daha verimli ve son derece esnek10olan CRISPR/Cas9 sistemi tarafından hızlı bir şekilde aşılmıştır. CRISPR, G. bimaculatus'ta nakavt11 ve knock-in hatları üretmek için kullanılmıştır12,13 Genomik modifikasyona ek olarak, dsRNA gelişmekte olan mRNA ekspresyonunu yıkmak için yumurtalara enjekte edilebilir embriyolar, araştırmacılar geliştirme 14 ,15boyuncabelirli transkript rolünü anlamak için izin . Kriket yumurtaları enjekte etmek için bazı sınırlı ayrıntılar daha önce12yayınlanmıştır .

Burada, erken G. bimaculatus yumurta enjekte etmek için ayrıntılı bir protokol açıklar. Bu protokol çeşitli laboratuvar ayarlarına, enjeksiyon malzemelerine ve muhtemelen diğer böceklere etkili ve kolayca uyarlanabilir. Genomik modifikasyon ve nakavt deneylerinin tasarlanması ve uygulanması için ek ayrıntılar başka bir yerde yayınlanmış olsa da12,13, Bu yaklaşımlar sonuçta burada ayrıntılı enjeksiyon protokolü ne bağlı olacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Donanım Kurulumu ve Malzemelerin Hazırlanması

NOT: Çözüm, reaktif ve ekipman ayrıntılarının hazırlanması için tablo 1 ve Malzeme Tablosu'na bakın.

  1. Yumurtaları görmek ve enjeksiyon iğnesini yönlendirmek için bir kesme mikroskobu ayarlayın. (Şekil 1A floresan ile donatılmış bir diseksiyon mikroskobu gösterir.) Floresan yeteneği avantajlıdır ancak gerekli değildir.
  2. Enjeksiyon iğnesini yerine getirmek için 3 eksenli bir mikromanipülatör yerleştirin (Şekil 1A).
  3. Küçük miktarlarda malzeme enjekte etmek için bir mikroenjektör ve bir iğne tutucu ayarlayın (Şekil1A). İsteğe bağlı olarak şekilde gösterilmez bir ayak pedalı kullanın.
  4. 3D yazıcı veya lazer oymacı ile istenilen desenin tersini yazdırarak yumurtalar için kuyular (Şekil1C)oluşturmak için bir damga tasarlayın ve oluşturun.
    NOT: Gösterilen 3D baskılı numune pulu 4,5 cm x 5 cm, 128 cm, 3 cm x 1 cm x 1 mm çıkıntılı olup, ayrı kuyular oluşturmak için. Özelleştirilebilir kalıplar çeşitli yapmak için nasıl ayrıntılarbaşka bir yerde 16 yayınlanmıştır.
  5. 10x Enjeksiyon Tampon, HEPES tamponlu salin (HBS) ve Tetrametiloiddamine Dextran boya stok çözeltisi hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.
  6. Enjekte edilecek deneysel çözümler hazırlayın, örneğin dsRNA, CRISPR/Cas912,transpozable elemanlar, in vitro kapaklı mRNA7,8, farmakolojik ajanlar17, ZFN'ler veya TALENS9.
  7. Değerlendirme için iğne tutmak için kullanılacak cam slayt, 1 mm veya öylesine üzerinde bir platform oluşturmak için bir cam mikroskop slayt standart laboratuvar bandı birkaç katmanları üzerinde çift sopa bant yerleştirin.
  8. Hava sirkülasyonu için örgü kaplı bir açıklığa sahip bir kapak ile yaklaşık 40 cm x 60 cm boyutunda bir kriket konteynerhazırlayın.
  9. Yiyecek, su ve barınak malzemeleri ekleyin.
  10. Birkaç düzine sağlıklı erkek ve kadın yetişkin kriket ekleyin. Kanatların varlığı ile yetişkin kriket tanımlayın.
    NOT: Hayal sonrası yaşaralığı yumurta verimini artırabilir. Bir deney için yeterli yumurta toplamak edebilmek için kriket yoğunluğu nispeten yüksek olmalıdır, ama yamyamlık oluşur o kadar kalabalık değil. Örneğin, yaklaşık iki düzine sağlıklı kriket, kabaca eşit erkek kadın oranı ile, yukarıda belirtilen boyutta bir kapta bir ila iki saat döneminde yaklaşık 200 yumurta toplamak için yeterli olmalıdır. Kriketler oda sıcaklığında tutulabilir, ancak kriketler sıcak (23.5-26 °C), nemli (%40 - %60 bağıl nem) kuvözde muhafaza edilirse gelişme ve davranış en uygun uyrabilir.

2. Enjeksiyon için İğne yapma

  1. Filamentli Borosilikat Cam Kılcal damarları kullanın (boyut ayrıntıları için Malzemeler Tablosu'na bakın). Çekme iğnelerini aynı gün veya enjeksiyonlar tamamlanmadan birkaç gün önce hazırlayın.
  2. Çekmeceye kılcal bir cam yerleştirin, camın filamentin üzerine ortalayın ve camı yerinde sabitlemek için tonlamaları sıkın.
  3. Çekmece sıcaklığını cam rampa sıcaklığının (-5 °C ila +10 °C) yakınına ayarlayın.
  4. Küçük bir açıklıkla uzun bir konik çekmek için tek adımlı, yüksek ısı protokolünü kullanın, ancak uçların kapalı erimesini önleyin.
    NOT: Örneğin, bir kutu filamenti ile donatılmış Malzeme Tablosunda ayrıntılı mikropipet çekmecesini kullanırken, rampa sıcaklığı 478 olan cam için aşağıdaki parametreleri kullanın: Isı 478; Çekme 45; Vel 75; Del 120. Şekil 2B'de gösterilen şekilile iğne üretmek için en uygun koşullar her kullanıcı tarafından ampirik olarak belirlenmelidir.
  5. Enjeksiyonlar için hazırlık için bevel iğne ipuçları.
  6. Beveler'in (Şekil2A)dönen öğütücü düzlemini damlama suyuyla ıslayın. Ters ozmoz (RO) veya dietilasyonokarbonat (DEPC) ile işlenmiş distile su kullanın.
  7. Çekilen iğneyi beveler'e yerleştirin ve 20° açıya dönün.
  8. İğneyi sadece taşlama düzlemine değene kadar indirin ve 2-3 dk.
  9. Bir cam mikroskop slayt yapıştırılmış olan çift sopa bant üzerine yaslı iğne yerleştirerek bevel değerlendirin.
  10. İğneyi tutan kaydırağı kamera ve görüntü edinme yazılımıyla donatılmış bileşik bir mikroskobun sahnesine yerleştirin.
  11. 20x hedefi kullanarak iğne ucunun görüntüsünü elde edin.
  12. İğnenin iç lümen çapını ölçmek için görüntüleme yazılımını kullanın (Şekil 2C). En uygun boyut 10 μm + 2 μm'dir.
  13. 8 μm'nin altında ve 12 μm'nin üzerinde bir açıklığı olan iğneleri atın.
  14. Tozlu önlemek için bir kapak ile bir kapta iğneleri saklayın. Uçları kırmayı önlemek için iğneleri kabın altındakilere yükseltmek için balmumu veya benzeri bir malzeme şeridi kullanın (Şekil2D).

3. Yumurta Toplama ve Hazırlama

  1. Yumurta toplamaya çalışmadan önce bir gecede veya en az 8-10 saat boyunca herhangi bir nemli yumurtlama malzemesi (su şişeleri, yumurta yemekleri) kriket yoksun tarafından yatırılabilen yumurta sayısını maksimize.
    NOT: Dişiler spermi dahili olarak depolama yeteneğine sahip olduğundan, dikkatli bir şekilde zamanlanmış döllenme deneysel olarak gerekli yse, farklı bir zamanlanmış işlem gerekebilir18.
  2. Suda % 1 agarose 40 mL olun ve 10 cm petri kabına dökün.
  3. Katılaşmadan önce agarose yüzeyine bir yumurta kuyusu damgası yerleştirin.
  4. Pulu çıkarın, bir kez agarose katılaşmış, kuyuları ortaya çıkarmak için (Şekil 1C).
  5. % 1 Penisilin / Streptomisin içeren HBS ile agarose iyi plaka doldurun.
  6. Kapağı yemeğin üzerine yerleştirin, parafilm'e sarın ve 4 °C'de saklayın.
    NOT: Yemekler 4 °C'de birkaç gün saklanabilir ancak yoğuşmayı önlemek için kullanılmadan önce oda sıcaklığına kadar ısıtılmalıdır.
  7. 35 mm'lik petri kabını beyaz oyun alanı kumuyla doldurarak yumurtlamak için kriketlerin yumurta toplama kabı nı yapın (Şekil1B).
    NOT: Malzeme Tablosunda belirtilen kum uygun tane büyüklüğündedir. Kum taneleri çok büyükse, kum yumurtalara zarar verir.
  8. Yaklaşık 18 cm x 18 cm olacak şekilde kesilmiş kağıt havlu bir kare ile yumurta çanak kapak ve kum ile çanak üstüne yerleştirin. Bu kağıt havlu sayesinde musluk suyu ile dolu çanak kapağı.
  9. Petri kabını yatırın ve fazla suyu çıkarmak için üstçe hafifçe sıkın.
  10. Çanak altında kağıt havlu kare köşelerini tuck ve yerinde kağıt havlu kapağı tutmaya yardımcı olacak ters kapak, yumurta çanak yerleştirin.
  11. Kriket kutusuna yumurta çanak yerleştirin ve yetişkin kadın bir ila iki saat için ovipozit yumurta sağlar.
    NOT: Burada nispeten kısa bir süre tüm yumurta enjeksiyon sırasında gelişme aşamasında benzer olmasını sağlar. Hücreselleşmeden önce enjeksiyon önemliyse, enjeksiyonlar19yumurtlama nın 14 saat içinde yapılmalıdır.
  12. Bu arada, agarose çanak (adım 3.6) enjeksiyon için yumurta tutmak için hazırlık oda sıcaklığına ısınmak için izin verin.
  13. Kriket kutusundan taze döşenmiş yumurtalar içeren yumurta toplama yemeğini çıkarın ve kağıt havlu kapağını çıkarın. En az 500 mL kapasiteli bir kabın üzerine 0,5-1 mm gözenek boyutunda bir süzgeç yerleştirin (Şekil1B).
  14. Yumurta yumurtlayan yemeğin (kum ve yumurta) içeriğini, süzgeçteki yumurta tanelerinin süzgeçten suya düşmesine izin veren ve süzgeç yumurtalarını süzgeç sepetinde bırakarak hafifçe akan musluk suyunun içine durulayın.
  15. Ro su ile bir kap doldurun ve bir tepsiye yerleştirin. Süzgeci kabın üzerine ters çevirin ve yumurtaları suya çıkarmak için çanağa dokunun. Yumurtalar kabın dibine batar.
  16. Yaklaşık 3 mm çapında bir açıklık yapmak için bir P1000 pipet ucumak makasla kesin. Bir P1000 pipettor bu ucu yerleştirin ve mümkün olduğunca az su aktararak, agarose yumurta kalıp çanak için konteyner yumurta aktarmak için kullanabilirsiniz.
  17. HBS artı% 1 Penisilin / Streptomisin dolu agarose kuyularda yumurta hizalamak için plastik cımbız kullanın. Her yumurta bir kuyunun dibine batar. Enjekte etmeye hazır olana kadar petri kabı kapağı ile kaplayın.

4. Mikroenjektör hazırlayın

  1. Mikroenjektörü basınçlı hava veya gaz kaynağına takın (bu protokol basınçlı hava veya N2kullanılarak optimize edilmiştir).
    NOT: Taşınabilir bir hava tankı kullanıyorsanız, en az 75 psi doldurun. Tank enjeksiyonlar boyunca hava basıncını kaybeder ve yeniden doldurulması gerekebilir; enjeksiyonlar 40psi altında zor olur.
  2. Mikroenjektörü aç. Enjeksiyon süresini 0.17 s'ye, basıncı 10-15 psi'ye ayarlayın.
    NOT: İhtiyaç duyulan tam basınç iğnenin açılmasına bağlıdır ve kullanılan her enjeksiyon ve/veya yeni iğne için ampirik olarak belirlenmelidir.
  3. Mikroenjektörün BALANCE topuzlarının 0'a (genellikle saat yönünün tersine) döndürülmesini ve mikroenjektörün basınçlı ve enjeksiyon modunda olduğundan emin olun.

5. Enjeksiyonlar

  1. 1 mL şırınga ve 0,45 m şırınga filtresi kullanarak yaklaşık 500 μL 10x Enjeksiyon Tamponu filtreleyin.
  2. Mix enjeksiyon reaktifleri (takip eden ayrıntılar 12'de açıklandığışekilde hazırlanan dsRNA enjeksiyonu içindir).
    NOT: Özellikle bu tekniği ilk kez öğrenen biri olduğunda, çeşitli kontroller tasarlamak ve gerçekleştirmek tavsiye edilebilir. Enjekte etmeden yumurta ları dürtmek, tampon + boya enjekte etmek veya tampon + boya + bir kontrol reaktifi (eGFP dsRNA gibi) enjekte etmek enjeksiyon protokolünün çeşitli unsurlarının ne kadar yıkıcı olabileceğinin iyi testleridir. Bir dizi farklı denetimin hayatta kalma kabiliyeti için Şekil 3'e bakın.
  3. 4 mL dsRNA aliquot ile başlayın.
  4. DSRNA aliquot'a filtrelenmiş 10x Enjeksiyon Tamponunun 0,5 mL'sini ekleyin.
  5. 0,5 mL 50 mg/mL Tetrametil rhodamine Dextran boya çözeltisi ekleyin. Floresan olmadan bir diseksiyon kapsamı üzerinde çalışıyorsanız, bunun yerine Phenol Red kullanın.
  6. Enjeksiyon süresi boyunca tüm malzemeleri buzda saklayın.
  7. Enjeksiyon çözeltisini 20 mL yükleme uçları ve p10 pipet kullanarak enjeksiyon iğnesine yükleyin.
  8. 1,5 mL enjeksiyon çözeltisi çekin ve yükleme ucunu enjeksiyon iğnesinin geniş ucuna yerleştirin.
  9. Çözeltiyi mümkün olduğunca iğnenin içine doğru fırlatın ve hafifçe hareket ederek hava kabarcıklarını ortadan kaldırın; iğne kırmak için dikkatli olun.
  10. Diseksiyon mikroskobu altında yumurta çanak yerleştirin ve yaklaşık 10x (10x göz hedefleri ile görüntülenen 1x büyütme) düşük büyütme seçin.
  11. İğneyi enjeksiyon gövdesine takın ve sıkın.
    NOT: İğnenin gövdeye düzgün ve sağlam bir şekilde sokulduklarına dikkat edin. Bunu yapmak için, iğnenin geniş ucunu metal gövdeden geri çekin ve silikon boruyu gövdeye getirin. Silikon boruyu, iğnenin cam ucunun silikonun hemen ötesine çıkıntısı olacak şekilde ayarlayın. Bu yapılmazsa, silikon boru cam ve metal gövde arasında sıkışmış alabilirsiniz, iğne ucunu bloke.
  12. Enjeksiyon gövdesini mikromanipülatöre bağlı bir iğneyle dikkatlice takın. İğnenin keskin ucuna dikkat edin ve yüzeylere çarpmadığı ve kırılmadığı konusunda dikkatli olun.
  13. Hem yumurtaya hem de iğneye mikroskoptan bakarken, iğneyi çanak ızgaranın sol üst köşesindeki yumurtaların yanına taşıyın.
  14. Ucu HBS artı% 1 Penisilin / Streptomisin kabızlık tamponlu çözelti girene kadar iğne düşürün.
  15. İğneyi görüş alanında ortalayın ve yumurta kabını hareket ettirin, böylece iğne yemeğin kenarına yumurtalardan birkaç mm daha yakın dır.
  16. İğne ile yumurta ızgarasının görünümünü engellemeyin.
  17. Mikroskobu Rhodamine'e uygun filtreye ayarlayın, böylece iğnedeki floresangözlemi gözlemleyin ve iğnenin ucuna odaklanın.
  18. Mikroenjektörde, enjeksiyon çözeltisi iğneden süspansiyon çözeltisine sızmaya başlayana kadar BALANCE topuzlarını saat yönünde yavaşça çevirin. Sayısal değer önemli olmasa da, mikroenjektörün ekranındaki bakiye numarası artmaya başlar. Daha sonra, boya iğneden dışarı sızan durana kadar düğmeyi saat yönünün tersine çevirin.
    NOT: Her yeni iğne kullanıldığında bu dengeyi ayarlamak çok önemlidir. Denge uygun şekilde ayarlanamayınca, mikroenjektör enjeksiyon tetiklendikten sonra bir süre daha enjekte etmeye devam edecektir. İğne düğmesinin dengesiz bir iğneyle tek bir basması, yüklenen iğnenin tüm içeriğinin atılmasıile sonuçlanması na bile mümkündür.
  19. İğne görüş alanında ortalanmış ile, iğne ilk enjekte edilecek yumurta hedefleniyor böylece yumurta çanak hareket ettirin. Enjeksiyonların düzenlenmiş yumurta ızgarasının bir köşesinde başlaması tavsiye edilir, örneğin sol üst köşede.
  20. Büyütmeyi yaklaşık 50x'e ayarlayın; bu büyütmede, tek bir yumurta görüş alanının çoğunu dolduracaktır.
  21. İğneyi enjeksiyon için pozisyona sokmak için hem mikromanipülörü hem de elini yumurta kabında kullanın.
  22. Mikromanipülatör kullanarak iğneyi ilerletin ve iğnenin ucunu enjekte edilecek ilk yumurtaya takın.
  23. İğneyi yumurtanın arka (künt) ucundan %20-30 yumurta uzunluğunda (Şekil1E)yumurtanın uzun eksenine dik olarak yerleştirin.
  24. Enjeksiyon ayak pedalı veya mikroenjektör üzerindeki enjeksiyon düğmesi ile çözelti enjekte edin. Yumurtanın içindeki küçük bir floresan madde bolusu başarılı bir enjeksiyona işaret eder (Şekil 1D).
    NOT: Enjeksiyon sırasında yumurtadan bir miktar sarısı atılması nadir değildir (Şekil1F),ve bu mutlaka enjekte edilen yumurtanın canlı olacağını göstermez.
  25. İğneyi yumurtadan geri çek. Yumurta, iğnenin geri çekilmesi üzerine istemeden kuyusundan çıkarılırsa, iğneyi geri çekerken yumurtayı kuyuya geri itmek için küçük forsepsler kullanın.
  26. İğne enjeksiyon sırasında iğne tıkanırsa, iğneyi yumurtadan çıkarın ve iğneyi HBS artı yumurtaları kaplayan %1 Penisilin/Streptomisin çözeltisine batırın, tıkanmış iğneyi Clear işlevini kullanarak veya enjekte ederek temizleyin Düğme.
  27. Aynı iğneyi kullanmaya devam ederek, mümkün olduğunca çok yumurta için enjeksiyon işlemini tekrarlayın. İlk başta, bu sadece yaklaşık 20 veya 30 yumurta olabilir ama uygulama ile 100 üzerinde artacaktır.
  28. İğne tıkanır ve temizlenemiyorsa, iğneyi atın, yeni bir iğne doldurun ve yeniden başlayın (örn. adım 5.7'ye dönün).
  29. Enjekte edilen yumurtaların yemeğini, embriyolar analiz için istenilen gelişim aşamasına ulaşıncaya kadar hafif nemli (buharlaşmayı en aza indirmek için) sıcak bir kuluçka makinesinde (23,5-26 °C) saklayın.
  30. En az her 24 saat, artık uygun olmayan yumurtaları çıkarın (Şekil3A,B), ve süspansiyon çözeltisini taze HBS artı %1 Penisilin/Streptomisin ile değiştirin.
  31. Enjeksiyondan 2-3 gün sonra, yumurtaları nazik pipetleme veya plastik prömiyerlerle HBS artı %1 Penisilin/Streptomisin ile nemlendirilmiş kağıt havlulara aktararak ılık, nemli kuluçka makinesinde gelişmeye devam edin.
  32. Yumurtaları izleyin ve artık her gün uygun olmayan yumurtaları çıkarın (Şekil3A,B).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kriket kolayca nemli malzeme içinde yumurta yatıyordu ve nemli kum veya kir gibi yeterli malzeme sağlayan, onları yumurta çok sayıda koymak için neden olur. Bu özellikle kriketlerin ilk olarak 8-10 saat boyunca yumurtlama materyalinden yoksun bırakılması durumunda etkilidir. Bir diseksiyon mikroskobu, bir mikroenjektör ve bir mikromanipülatör (Şekil1A)çeşitli malzemeler (Şekil1D)...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu teknikile iki ana zorluklar optimal iğne boyutu ve hayatta kalma ile ilgili konulardır. Küçük iğneler hayatta kalma yeteneğini artırmak rağmen, dar lümenile iğneler iş yerinde kılcal kuvvetler daha büyük bir dereceye sahip, hangi sarısı iğne içine hareket edecek daha olası dır tıkanmasına neden. En iyi durumda, tıkanıklıklar sadece başka bir yumurta enjekte ederek veya yukarıda açıklandığı gibi iğne temizleyerek temizlenebilir. Bir de yumurta sarısı iğne dışarı itilir kadar mikroenjektör üzerindeki denge basıncını art...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu projede bildirilen araştırmalar, P20GM10342 ile HH3 arasında yer alan Ulusal Sağlık Enstitüleri Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü'nden Kurumsal Gelişim Ödülü (IDeA) ve NSF ödül numarası IOS-1257217 tarafından desteklenmiştir. Cge.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Floresan diseksiyon mikroskobuLeicaM165 FCFloresan ile stereomikroskop
Floresan için harici ışık kaynağıLeicaEL 6000
MikroenjektörNarishigeIM-300-Aksesuarlarşunları içerebilir: Enjeksiyon İğneleri Tutucu, Giriş Hortumu (hortum bağlantılı), AC Güç Kablosu, Ayak Pedalı, Silikon Kauçuk Conta-mCherry
filtre küpüLeicaM205FA / M165FCmCherry veya benzeri kırmızı boya için filtre küpü işe yarayacak
MicromanipulatorWorld Precision Instruments, Inc.M3301RManyetik Stand ile Kullanılan (Narishige, Tip GJ-8)
Manyetik standNarishigeMMO-202ND
Pipet Tutucu (İğne tutucu)NarishigeHD-21
Hava kaynağını mikroenjektöre
Yumurta kuyusu damgası3D baskılıözel3D Poli Laktik Asit termoplastik kullanılarak bir Lulzbot Taz 5 üzerine basılmıştır
Mikrodalgaçeşitli
İnkübatör veya sıcaklık kontrollü odaçeşitliSıcaklıklar 23.5-26 ° C; C'ye ihtiyaç vardır.
Kriket mamasıçeşitlikedi mamaları veya balık gevrekleri uygun mamalardır.
Kriket suyuvairousSu, şişelerde tutulabilir ve pamuk topları aracılığıyla cırcır böceklerine sunulabilir
Kriket barınağızorluBarınak malzemeleri arasında buruşuk kağıt havlular veya yumurta kartonları bulunabilir
Cam kılcal borularWorld Precision Instruments, Inc.Ürün no. 1B100F-4Kwik-Fil™ Borosilikat Cam Kılcal Damarlar, 100 mm uzunluk, 0,58 mm İç Çap, 1,0 mm Dış Çap, filamentli
Mikropipet çektirmeAlevli/KahverengiModel P-97Sutter Instrument Co. tarafından dağıtılmıştır.
Beveller/Mikro öğütücüNarishigeModel EG-45/EG-400EG-400, bir mikroskop kafası
Petri kaplarıiçerir, CellTreatÜrün kodu 22969390 mm çap
Play SandSandtastik Products Ltd.B003U6QLVSBeyaz oyun kumu
AgaroseAmerikan BiyoanalitikAB000972Agarose GPG/LE ultra saf
Yumurta Süzgeci: Ekstra İnce Dimi Mesh Paslanmaz Çelik Konik SüzgeçlerABD Mutfak Tedarik ModeliSS-C123Gözenek boyutu 0,5 - 1,0 mm arasında olmalıdır
Penisilin StreptomisinGibco by Life TechnologiesRef 15070-063Kalem Strep
Plastik cımbızSipel Electronic SAP3C-STDSiyah Statik Dağıtıcı, 118 mm
Şırınga filtreleri, 25 mm çap, 0.45 & mNalgene725-25451 mL şırınga ile kullanın
1 mL şırınga, Tüberkülin Kayma Ucu ileBecton Dickinson309602Enjeksiyon Tamponunu filtrelemek için şırınga filtresi ile kullanın, Luer-Lok uçlu şırıngalar da işe yarar
Hava tankı (isteğe bağlı)Midwest ProductsAir Works®Portatif hava tankı
Rhodamine boyaThermofisherD-1817dekstran, tetrametilrodamin 10.000MW,
20 mL yükleme uçlarıEppendorfSipariş no. 5242 956.003epT.I.P.S. 20 μ L Microloader
Bileşik mikroskopZeissAxioskope 2 plus
20x objektifZiessPlan-Apochromat 20x/0.75 M27
KameraLeicaDMC 5400
Leica Application Suite  yazılımLeicaLASSürüm 4.6.2 burada kullanılır
bağlamak için boru, , ,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abzhanov, A., et al. Are we there yet? Tracking the development of new model systems. Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).
  2. Krebs, H. A. The August Krogh principle: “For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).
  3. Krogh, A. The Progress of Physiology. American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
  4. Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. Cricket neurobiology and behavior. , Cornell University Press. Ithaca. (1989).
  5. Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , Springer. Tokyo. (2017).
  6. Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
  7. Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).
  8. Shinmyo, Y., et al. piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus. Development, growth & differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).
  9. Watanabe, T., et al. Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases. Nature communications. 3, 1017(2012).
  10. Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).
  11. Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets. Scientific Reports. 5, 15885(2015).
  12. Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. Protocols in the Cricket. The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).
  13. Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus. Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).
  14. Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus. Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).
  15. Miyawaki, K., et al. Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis. Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).
  16. Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. 7 (7), bio031260(2018).
  17. Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect. Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).
  18. Larson, E., Andres, J., Harrison, R. Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets. PLOS ONE. 7 (10), e46202(2012).
  19. Donoughe, S., Extavour, C. G. Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus. Developmental Biology. , (2016).
  20. Matsuoka, Y., et al. Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes. Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).
  21. Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects. Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).
  22. Bacon, J., Strausfeld, N. Nonrandom resolution of neuron arrangements. Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

C rc r B ce i Yumurta EnjeksiyonuRNA nterferansGenomik Manip lasyonE imli ne Haz rlamaAgaroz Kuyu Kal bMikromanip lat r Kullan mFloresan Boya zlemeHayatta Kalma Oran De erlendirmesiHBS Tampon zeltisiEmbriyonik Geli im Analizi

İlgili makaleler