Burada, meme blastema oluşumu ve Intramembranous ossifikasyon araştırmak için yetişkin fare terminali falanks amputasyon bir protokol sunuyoruz, floresan immünhistokimya ve sıralı in-vivo MİKROBİLGİSAYARLI tomografi ile analiz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yetişkin fare basamak amputasyon ve rejenerasyonu: Mammalin Blastema oluşumu ve Intramembranous ossifikasyon araştırmak için basit bir model
Bu makalede
Özet
Özet
Burada, biz bir protokol yetişkin fare distal Terminal falanks (P3) amputation, epimorphic rejenerasyon, bir procedurally basit ve tekrarlanabilir memeli modeli mevcut blastema oluşumu ve Intramembranous ossifikasyon tarafından analiz içerir Floresan immünhistokimya ve sıralı in-vivo MİKROBİLGİSAYARLI tomografi (μCT). Memelinin rejenerasyonu Terminal falanks distal bölgesini (P3) aktaran amputasyonlar ile sınırlıdır; daha proksimal düzeylerde bacağı rakamları yeniden ve fibrotik şifa ve yara oluşumu geçmesi başarısız. Rejenerasyon tepkisi, amputasyonlu iskelet uzunluğunu geri yüklemek için Intramembranous ossifikasyon yoluyla kemik rejenerasyonu takiben proliferatif bir blastema oluşumu ile aracılık edilir. P3 amputasyon memelilerde epimamorfik rejenerasyon araştırmak için bir preklinik model, ve başarılı bir rejeneratif tepki ile fibrotik şifa yerine terapötik stratejilerin tasarımı için güçlü bir araçtır. Protokolimiz 1) erken ve geç blastema hücre nüfus, 2) rejenerasyon bağlamında revaskülarizasyon çalışma ve 3) tanımlamak için floresan immünhistokimya kullanır karmaşık kemik gerek kalmadan Intramembranous ossifikasyon araştırmak stabilize cihazları. Ayrıca, amputasyon sonrası morfolojik değişiklikleri incelemek için yüksek çözünürlüklü görüntüler oluşturmak için sıralı in vivo μCT kullanımını da gösteriyoruz, aynı basamak içindeki hacim ve uzunluk değişikliklerini yenilenme sırasında ölçmek. Bu protokolün memelilerde hem epimamorfik hem de doku rejeneratif yanıtlarını araştırmak için muazzam bir yarar sunuyor olduğuna inanıyoruz.
Giriş
İnsanlar ve fareler de dahil olmak üzere memeliler, Terminal falanks (P3)1,2,3distal amputasyon sonra rakamlarının ipuçlarını yeniden oluşturmak için kapasitesine sahip. Farelerde, rejenerasyon tepkisi amputation düzeyine bağlıdır; giderek proksimal basamaklı amputasyonlar, P3 çivi matrisine geçiş ve proksimal Amputasyonların tam rejeneratif yetmezliği4,5,6 ' ya kadar aşamalı olarak zayıflatılmış rejeneratif tepkisi görüntüler , 7 ,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan kullanımı ve teknikleri, Texas A & M Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi 'nin standart çalışma prosedürlerine uygun olarak yapıldı.
1. yetişkin fare arka ekstremite distal P3 amputasyon
- Anestezize bir 8 için 12 hafta-eski CD-1 fare (malzeme tablosu) oksijen Isoflurane gaz kullanarak; Başlangıçta bir odada% 3 ' te anesteziye, ardından ameliyat süresince bir burun konisi tarafından sağlanan% 2 isofluran. Anestezi altında kuruluğu önlemek için gözlerde oftalmik merhem uygulayın.
Not: Laboratuvarımızda standardize edilen yetişkin P3 amputasyon çalışmaları 8 ila 12 ha....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
6/7 DPA (Şekil 2a-D), 9 DPA (Şekil 2e-H) ve 10 DPA (Şekil 2i-L) ' de P3 basamakları rejenere yetişkin fare, Runx2, OSX ve PCNA antikorları ile immünosteli Intramembranous kemik görselleştirmek için rejenerasyon ve CXCR4 ve vWF antikorları ile immünostasyon blastema oluşumu görselleştirin. Amputasyon öncesinde taranan basamak ve yenilenme sırasında çeşitli zaman noktalarında (
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, Yetişkin fare distal P3 Amputasyonunun standartlaştırılmış bir prosedürünü, blastema oluşumunu ve Intramembranous ossifikasyonu görselleştirmek ve araştırmak için floresan immünhistokimyasal boya, ve sıralı in-vivo μct taramasını açıklar kemik morfolojik, hacim ve uzunluk değişiklikleri amputasyon sonrası tanımlayın. P3 amputasyonu, blastema oluşumunu tetikleyen bir rejeneratif yara ortamını analiz etmek için benzersiz, prosedüre basit ve tekrarlanabilir bir modeldir. Ayrıca, P3 basamak modeli, Intramembrano.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Biz Muneoka Lab ve Teksas genomik Tıp Enstitüsü (TıGM) üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma Texas A & M Üniversitesi tarafından destekleniyordu.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Protein Blok Serumu İçermeyen | DAKO | X0909 | Kullanıma hazır |
| Fare anti-PCNA antikoru | Abcam | ab29 | 1:2000 seyreltme |
| Sıçan anti-CXCR4 antikoru | R& D Sistemleri | MAB21651 | 1:500 seyreltme |
| Tavşan anti-insan vWF XIII antikoru | DAKO | A0082 | 1:800 seyreltme |
| Tavşan anti-osteriks, SP7 antikoru | Abcam | ab22552 | 1:400 seyreltme |
| Tavşan anti-Runx2 antikoru | Sigma-Aldrich Co. | HPA022040 | 1:250 seyreltme |
| Alexa Fluor 647-konjuge keçi anti-fare IgG (H + L) | Invitrogen | A21235 | 1:500 seyreltme |
| Alexa Fluor 488-konjuge keçi anti-tavşan IgG (H + L) | Invitrogen | A11008 | 1:500 seyreltme |
| Alexa Fluor 568-konjuge keçi sıçan önleyici IgG (H + L) | Invitrogen | A11077 | 1:500 seyreltme |
| Uzat Altın antifade reaktifi | Invitrogen | P36930 | Kullanıma hazır |
| Surgipath Decalicifiye 1 | Leica Biosystems | 3800400 | Kullanıma hazır |
| Z-Fix, Sulu tamponlu çinko formalin fiksatif | Anatech LTD | 174 | Kullanıma hazır |
| CD-1 Dişi Fare | Envigo | ICR(CD-1) | 8-12 haftalık |
| vivaCT 40 | SCANCO Medical |
Kaynaklar
- Douglas, B. S. Conservative management of guillotine amputation of the finger in children. Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).
- Illingworth, C. M. Trapped fingers and amputated finger tips in children. Journal of Pediatric Surgery. <....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
