Method Article

BK-polyomavirus kodlama dışı kontrol bölgesini Akış sitometrisi yoluyla transkripsiyon aktivitesinin ölçümü

DOI:

10.3791/59755

⸱

July 13th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, University of Duisburg-Essen, University Hospital Essen, 2Institute for Virology, University of Duisburg-Essen, University Hospital Essen, 3Center for Translational Medicine, Medical Department I, Marien Hospital Herne, University Hospital of the Ruhr-University of Bochum, 4Department of Infectious Diseases, University of Duisburg-Essen, University Hospital Essen Hufelandstr

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda, tdTomato ve eGFP 'i ifade eden bir çift yönlü muhabir Plasmid ile nakledilmiş HEK293T hücrelerini kullanarak BK-polyomavirus transkripsiyon aktivitesinin FACS tabanlı ölçümünü gerçekleştirmek için bir protokol sunulmuştur. Bu yöntem daha da Nicek viral transkripsiyon üzerinde yeni bileşiklerin etkisini belirlemek için izin verir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BK-polyomavirus (BKPyV) gibi polyomaviruses, bağışıklık sistemini tehlikeye atılan hastalarda şiddetli patolojilere neden olabilir. Ancak, son derece etkili antiviral Şu anda mevcut olmadığı için, potansiyel anti-virüs ajanların etkisini ölçme yöntemleri gereklidir. Burada, BKPyV kodlama olmayan kontrol bölgesinin (NCCR) erken ve geç organizatörü aktivitesinin analizine izin veren bir çift floresan muhabiri, potansiyel antiviral ilaçların tdTomato ve eGFP aracılığıyla viral gen ifadesinde etkisini ölçmek için inşa edildi Ifa -de. Buna ek olarak, bu protokolde, immünolojili renal nakledilen hastaların kan türeği DNA 'sından örnek olarak elde edilen bkpyv-nccr amplikonlar klonlayarak, nccr-redüzenlemeleri viral gen ifadesi üzerine etkisi tespit edilebilir. Hasta türevi amplicons klonlama sonrasında, HEK293T hücreler muhabiri-plazmids ile transferleştirilmiş ve potansiyel antiviral ajanlar ile tedavi edildi. Daha sonra hücreler, ortalama floresans yoğunlukları 72 h Post transfeksiyon ölçümü için FACS-analizine tabi tutulmuştur. Ayrıca potansiyel bir hücre döngüsü inhibe etkisi olan ilaçların analizini test etmek için, sadece transfekte ve böylece floresan hücreler kullanılır. Bu tahlil büyük T antijeni hücre ifade gerçekleştirildiği için, erken ve geç ifade etkisi karşılıklı bağımsız bir şekilde analiz edilebilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polyomaviruses küçük çift telli DNA bağımsız bir aile temsil (dsDNA) Simian virüsü 40 ile virüsler (BAZıLARıNDA SV40) bir prototip türü olarak. Primer enfeksiyon çoğunlukla çocukluk çağında oluşur, genellikle hastalık belirtileri olmadan devam ve genellikle bağışıklık yetkili konaklarında gizli enfeksiyonlara neden. BK-polyomavirus (BKPyV), renal tübüller hücrelerinde nefropatolojilere neden olmadan çoğunlukla devam eder, ancak böbrek nakli sonrasında bağışıklık-yetkinliğin bozulması durumunda virüs yeniden etkinleştirebilir ve şiddetli zararlar verebilir ve greft bozulması yüksek viremi ulaştığında fonksiyon (1 x 104 bkpyv DNA kopyaları/ml)1,2. Böbrek nakli alıcılarının yaklaşık% 10 ' unda, BK-polyomavirüsdür (bkpyv) ' ın yeniden aktivasyonu, renal allogreft arızaları yüksek riskiyle ilişkili% 80 ' a kadar olan polyomavirüsdür Associated nefropati (pyvan) ile sonuçlanır3,4 . Hiçbir onaylı antiviral ajanlar mevcut olduğundan, mevcut tedavi immünerbastırma azaltılması dayanmaktadır. İlginçtir, mTOR inhibitörleri bir antiviral etkiye sahip gibi görünüyor; Bu nedenle, immünpresif tedavisini mTOR bazlı immünerimoterapi ile değiştirmek, bkpyv viremi5,6,7' nin ilerlemesini önlemek için alternatif bir yaklaşım gösterebilir. Ancak, mTOR tabanlı antiviral mekanizması şu anda hala tamamen anlaşılır. Böylece potansiyel antiviral ajanların klinik olarak ilgili konsantrasyonlarda etkisini ölçen Yöntemler gereklidir.

BKPyV 'in dairesel genomu, çoğaltmanın kökeni olarak hizmet veren ve erken ve geç faz mRNA transkriptinin ifadesini kullanan çift yönlü bir promotör olan bir kodlama olmayan kontrol bölgesini (NCCR) barındıran yaklaşık 5 KB 'den oluşur. Nccr-redüzenlemeler, silmeler ve çoğaltmalar ortaya çıktığı için patojenik bkpyv8 ' de bulunan ve pvan5,9, arketipsel (WT) bir karşılaştırma muzdarip hastalarda önemli ölçüde birikmiş yeniden düzenlenmiş (RR) NCCR-faaliyetler viral çoğaltıcı Fitness karakterize etmek yararlıdır.

Şekil 1' de özetlendiği gibi, bu protokol, bir muhabirin Plasmid5' den ifade edilen iki fluorophores tdtomato ve EGFP floresans ölçerek bkpyv nccr transkripsiyonel etkinliğini ölçmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemi açıklar, 9,10,11. Prosedür, potansiyel antiviral ajanların erken ve geç NCCR-aktivite ayrı5üzerinde etkisini analiz etmek için ızın veren bazılarında SV40 büyük T antijeni (LTag), varlığında gerçekleştirilir. Bu tahlil daha nccr aktivite ve WT-nccrs ile karşılaştırma üzerinde yeniden düzenlemeleri etkisini analiz5,9. Muhabir plazmid, her bir fluorophore açık okuma çerçevesinin bazılarında SV40 geç Poliadenilasyon sinyallerini, sırasıyla tdtomato ve EGFP için her iki transkriptin karşılaştırılabilir ve verimli bir şekilde işlenmesini sağlamak için harborlar. QRT-PCR tabanlı yöntemler5,12ile karşılaştırıldığında, bu FACS tabanlı yaklaşım, virüslü hücre kültürü için karmaşık ayıklama protokolleri olmadığından ve pahalı olmayan bir düşük maliyetli ve yüksek verimlilik uyumlu alternatifi temsil eder bağışıklık floresan boyama için antikorlar gereklidir. Ayrıca, tanımlanan bir miktar floresan hücre Akış sitometrisi aracılığıyla analiz edildiğimden, hücre döngüsü inhibe edici ajanların analizi de nicel bir şekilde mümkündür.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Duisburg-Essen (14-6028-BO) Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Komitesi tarafından onaylanan insan araştırmaları yönergelerini takip eder.

1. kan veya idrar numunelerinin toplanması ve polyomavirüsdür DNA 'sı yalıtımı

  1. EDTA tüpleri veya idrar edinme tüplerinde en az 3 mL kan toplayın.
  2. Numuneyi 2.500 x g 'de 15 dakika santrifüjün. Gerekirse, plazmayı yeni bir tüpte pipet ve plazma örneklerini birkaç gün boyunca 4 °C ' de saklayın ya da daha uzun süreli depolama için-20 °C ' de dondurur.
  3. 40 μL proteinaz K 'yi 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne hazırlayın ve pipetleme ile 400 μL plazma ekleyin.
  4. 400 μL lizis tampon ekleyerek, 15 s için Vortex ve 56 °c ' de 10 dakika boyunca inkübe ederek numune Lyse.
  5. DNA 'yı, üreticinin talimatında açıklandığı gibi bir DNA kan ekstraksiyon kiti kullanarak izole et. Kısaca, alkol ekleyin ve DNA bağlayıcı silika bazlı membran içeren bir spin sütun üzerine endoglikozidazları yükleyin. Saf DNA verim için birkaç kez sütunları yıkayın.
  6. 30-50 μL TE tampon olarak elde edilen DNA 'Yı elute.

2. kodlama olmayan kontrol bölgesinin (NCCR) amplifikasyon

  1. Fiziksel olarak ayrılmış odalarda aşağıdaki yordamı gerçekleştirin. Reaktifleri hazırlamak ve karışımı PCR tüplerine dağıtmak için izole edilmiş bir oda kullanın.
  2. Pre-PCR için Master Mix + 50 μL toplam hacimde primer çifti A (Tablo 1) kullanarak hazırlayın ve daha önce yalıtılmış DNA adım 1,6 kullanın. Pre ve Nested PCR için ana karışımı hazırlamak için pipetleme şeması Tablo 2' de yazdırılır.
  3. 45 μL ana karışımı PCR tüplerine dağıtın.
  4. PCR tüpleri içine yalıtılmış DNA 5 μL ekleyin.
    Not: kontaminasyonu önlemek için ana karışım hazırlığı için olandan başka bir oda kullanın.
  5. PCR Tablo 3' te gösterildiği gibi reaksiyon koşulları ile çalıştırın. 35 döngülerinde denatürasyon, tavlama ve uzatma yineleyin.
  6. İç içe amplifikasyon için, AgeI ve SpeI (Tablo 1) için kısıtlama sitelerini barındıran astar çifti B kullanın.
  7. 2,2, pre-PCR ' i k i 5 μL kullanarak 2,5 ' e kadar adımları açıklandığı gibi reaksiyon koşullarına sahip iç içe PCR çalıştırın.
  8. PCR ürününün 10 μL 'sini 2 μL 6x jel yükleme boyasıyla karıştırın. % 1,5 agaroz jel üzerinde 10 μL karışımı yükleyin ve 60 MA 'da 30 dakika jel çalıştırın.
  9. Uygun bir UV dokümantasyon sistemi kullanarak jel görselleştirin.
    Not: amplikon boyutu yeniden düzenleme (silme, eklemeler veya yinelemeler) oluştuğu bağlı olarak 300-500 BP arasında olması bekleniyor (Şekil 2C).
  10. PCR ampliconları üreticinin talimatlarına göre bir PCAR arıtma kiti ile arındırın. PCR amplikonlar 30 μL elüsyon tampon elute.
  11. Astar çifti B kullanarak Sanger sıralaması için amplikonlar gönderin.

3. NCCR 'nin çift flüoresan muhabirine klonlanması

  1. Tablo 4' te açıklandığı gibi, 37 °c ' de 2 h Için ageı ve spei ile arıtılmış ampliconları (adım 2,10) özetler.
  2. Adım 2,10 tekrarlayın ve sindirilmiş amplicons arındırmak.
  3. Paralel olarak, Tablo 5' te açıklandığı gibi, 37 °c ' de 2 h Için agei ve spei ile plazmid omurgasını (1,5 μg) sindirin. Bu adımın yalnızca bir kez gerçekleştirilmesi gerekir. Sonraki reaksiyonlar için,-20 °C ' de sindirim dondurmak.
  4. % 0,8 düşük Melt agaroz jel üzerinde sindirilmiş Plasmid omurgasını analiz edin.
    Not: jeli 40 mA 'dan daha yüksek bir akım ile çalıştırmayın. Başlangıçta Plasmid elde edilen spacer bölgenin beklenen kesici uç pEX-K4 2-LTR CD313 olan 128 BP (Şekil 2C).
  5. Uzun dalga UV ışığı (320 NM) kullanarak DNA parçalarını görselleştirin ve temiz bir neşter kullanarak omurga bandını kesip çıkarın. Düşük Melt jel parçasını yeni 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. DNA hasarını önlemek için uzun UV pozlama süreleri kaçının.
    Not: düşük Melt agaroz kullanıldığı için, ligasyon öncesinde DNA 'yı arındırmak gerekli değildir.
  6. 65 °c ' de 10 dakika için düşük Melt agaroz parça içeren omurgasını ısıtın ve jel parçasını eritmek ve her 2 dakikada bir yumuşatma ile karıştırın. Erimiş jel doğrudan ligasyon için kullanılabilir.
  7. Tablo 6' da gösterilen şemayı kullanarak 16 °c ' de gece boyunca T4 DNA ligaz kullanılarak omurga ve sindirilmiş amplikon ligate.
  8. Isı şok yöntemi, LB-amp plakaları üzerinde plaka bakteri ve gece 37 °C ' de kültür kullanarak E. coli 'de dönüşümü gerçekleştirin.
  9. Ertesi gün, üç pozitif klonlar seçin ve gece E. coli kültürler hazırlamak (5 ml lb-amp) ve kültür 37 °c.
  10. Plasmid-DNA 'yı başka bir yerde14olarak açıklandığı şekilde standart protokolleri kullanarak izole edin, pozitif klonlar için kontrol etmek için ageı ve spei sindirimi gerçekleştirin ve% 1 agaroz jeli üzerinde parçaları kesip görselleştirin. Spacer Band (128 BP) daha büyük NCCR-sıra (300-500 BP, yukarıda görmek) ile değiştirilir.
  11. Astar EGFP-N veya primer çifti B (Tablo 1) kullanarak Sanger sıralama için Plasmid gönderin.
  12. Mutasyonlar kendiliğinden oluşabileceği için, sıralama sonuçlarını Amplicon ile elde edilen sıralama sonuçları ile karşılaştırın. Yalnızca Amplicon ile karşılaştırıldığında özdeş sıraları içeren klonlar kullanın.
  13. Elde edilen dizileri hizalamak ve düzenlemek için bir moleküler çalışma ekranı yazılımı (örn. ücretsiz nazik 1.9.4 veya diğer sıra düzenleme programları) kullanın (Şekil 3).
  14. Nazik 1.9.4 başlatın ve ithalat DÜĞMESINE tıklayarak DNA dizileri ithalat (yeşil aşağı ok).
  15. Sonraki tıklayın Aracı ve menü Hizalama seçin (kısayol olarak Ctrl + G kullanın) ve hizalama için DNA dizileri seçin.
  16. Tıklatarak hizalamaya bir sıra ekleyin Ekle veya Kaldır 'ı tıklatarak bir dizi kaldırın. JN19243815gibi bir arketipsel nccr görüş sırası dahil, sık kullanılan Dunlop-strain16nccr-sırası kullanmayın, bu yana redüzenlemeler ve arketipsel bkpyv daha çoğalan diğerleri limanları Suş.
    Not: nccr zaten translasyonel başlangıç kodon (Şekil 3) içerir.
  17. Hizalama için bir yöntem seçerek seçin Algoritmasıaraç çubuğunda ve seçin Setal W. eşleştirmek için hizalama parametrelerini ayarlamak 2; Gap uzatma cezası-1; Gap ceza-2 ve tıklayın ok hizalama çalıştırmak için.

4. muhabir plazmid ile HEK293T hücrelerin geçici transfeksiyon ve potansiyel antiviral ajanlar ile tedavi

  1. Sonraki transfeksiyon deneyler için Plasmid DNA yeterli miktarda hazırlamak için bir 150 mL gece kültürü hazırlayın. Plasmid DNA 'sını plazorta izolasyon kiti ile yalıtın. Alternatif olarak, diğer Plasmid arıtma kitleri kullanılabilir.
  2. Tohum 1 x 105 HEK293T HÜCRELERDE dmem içeren 10% FCS, penisilin ve streptomisin (1x) başına bir 12-kuyu plakası 24 saat önce transfeksiyon ve kuluçhanedeki gece 37 °c ve 5% Co2 transfeksiyon sırasında aktif proliferasyonu korumak için.
    Not: hücreler yaklaşık 80% transfeksiyon sırasında konfluent olmalıdır.
  3. Steril bir tüpte azaltılmış serum medyası 250 μL yerleştirin ve her muhabirin plazmid DNA 'sına 1 μg ekleyin ve pipetleme ile yavaşça karıştırın.
  4. DNA karışımına transfeksiyon reakajının 3 μL 'ını ekleyin, pipetleme ile hafifçe karıştırın ve 15 dakika boyunca inküye yapın. transfeksiyon reakajının 22 °C ' lik ortam sıcaklığına ve kullanmadan önce hafifçe girdap üzerine ısıtın.
  5. Kuyu için karışım Drop-Wise ekleyin ve yavaşça iyi dağıtın.
  6. 4 h sonra, test aracıları ve solvent kontrolü içeren taze orta ile süpernatant değiştirin. Analizine kadar 37 °C ' de kulküat yapın. Bu örnekte, mTOR inhibitörleri INK128 (100 ng/mL) ve Rapamycin (100 ng/mL) kullanılmıştır.

5. floresan mikroskopisi ve akış sitometri

  1. Floresan mikroskobu altında kırmızı ve yeşil floresans hücrelerini kontrol edin (Şekil 4).
    Not: kırmızı ve yeşil floresans sırasıyla erken ve geç BKPyV gen ifadesine karşılık gelir.
  2. 72 h sonrası transfeksiyon sonra, süpernatant Aspire ve iki kez soğuk PBS 1 ml ile hücreleri yıkayın.
  3. Yavaşça 500 μL tripsin ekleyin ve hücrelerin erken dekolmanı önlemek için biraz plaka çevirin. Bu adım, hücre doublets önlemek için önemlidir.
  4. Ayrıca, tripsin doğrudan aynı pipet ucu ile çıkarın.
  5. 37 °C ' de hücreleri en az 5 dakika boyunca inküat.
  6. % 3 FCS içeren PBS 1 ml ile tripsinize hücreler resuspend ve ön etiketli FACS tüpler süspansiyon transfer.
  7. FACS analizinden önce DAPı (1 μg/mL) ekleyin.
  8. Akış cytometer kullanarak hücreleri analiz edin. Her örnek için, DAPı boyama için negatif olan en az 10.000 yaşam hücrelerini ölçün.

6. veri analizi

  1. Akış sitometri analiz yazılımına verileri içe aktarın ve çalışma alanına tıkla ve sürükle örnekleri ekleyin.
  2. İçe aktarılan dosyaya çift tıklayın ve bir grafik çizimi oluşturun. X-ve y ekseni üzerine tıklayarak FSC-A ve SSC-A karşı seçin. Ana hücre popülasyonunu araç çubuğunda Çokgen üzerine tıklayarak ve hücre popülasyonunu çerçeveleme (Şekil 5) ile kapatın. Seçilen hücre popülasyon gerektiği gibi adlandırın (örneğin "tek hücreler"). "Tek hücreler" yeni bir çalışma alanı olarak görünecektir.
  3. DAPı negatif (yani, "yaşayan hücreler") için "tek hücreler" gating ile devam edin. Yaşam hücrelerini tanımlamak için hücre popülasyon ile ve DAPı boyama olmadan karşılaştırın. Her iki arazide FSC-A VERSUS Pacific-Blue-A ' ı seçin.
  4. Dikdörtgen tıklayın ve DAPı negatif hücre popülasyon seçin, seçilen hücre nüfus "yaşayan hücreler" adı ve yeni bir nokta-Plot gösteren oluşturmak FITC (eGFP) karşı PE (tdTomato) daha önce açıklandığı gibi.
  5. Dört seçerek "yaşayan hücrelere" kadran Ekle araç çubuğundan. Her nüfusun kenarına çeyreği merkezini sürükleyerek nüfus kapısı. Kadran temsil 1) EGFP-tdtom-, 2) EGFP-tdtom +, 3) EGFP + tdtom-, 4) EGFP + tdtom +.
    Not: FITC ve PE arasında emisyon spektrumunun spektral kaplama nedeniyle, ilk telafisi kırmızı ve yeşil sinyaller arasında ayırt etmek ve doğru sonuçlar elde etmek için esastır.
  6. Çeyrek üzerine sağ tıklayarak ve Istatistik Ekle'yi seçerek ortalama floresan yoğunlukları (MFIs) belirleyin. Ortalama seçin ve Tamam'ı tıklatın. Ortalama MFı artık "istatistik" bölümündeki nüfusun altında görüntülenir. Kadran 2 ve 4 erken ifade karşılık, kadran 3 ve 4 geç ifade temsil ederken.
  7. İstatistiksel güç için aynı şekilde ek çoğaltır ekleyin.
  8. Bir çubuk arsa içine erken ve geç veri yorumlama Plot MFı değerleri için:
  9. Farklı bağış veya virüs suşlarından elde edilen nccr etkinliklerini karşılaştırmak için, bir arketipsel kontrol veya Dunlop strain16 ekleyin ve göreli mfis% 100 için ayarlayın ve göreli MFI değerlerini hesaplayın. Her çoğaltma ile tekrarlayın ve ortalama ve standart sapma belirleyin.
  10. Transkripsiyon aktivitesinde potansiyel bileşiklerin etkisini değerlendirmek için, solvent kontrolünü% 100 olarak ayarlayın ve tedavi edilen hücrelerin MFı 'ini çizin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu temsilci denemede, BK-polyomavirus kodlama olmayan kontrol bölgesi güdümlü transkripsiyon aktivitesi Akış sitometrisi ile ölçülmüştür. Ayrıca, BKPyV reaktivasyonu sonrasında hastaları tedavi etmek için kullanılabilecek bir mTOR inhibitörü, viral erken Gen ifadesinin inhibisyonu için test edildi. Bu amaçla, daha önce yayınlanan bir çift floresan-muhabir tahlil olarak kullanıldı5. Deneysel kurulumunun genel iş akışı şeması Fıgure 1

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede, sık kullanılan bir yöntem, bkpyv kodlama olmayan denetim bölgesi (nccr) erken ve geç Organizatör etkinliği yönetilen analizi için olanak sağlar sunulmuştur. Nccr aktivite aynı anda ölçülebilir ve transfekte hücrelerin lizis gerekmez. Dahası, nispeten çok sayıda hücre analiz edilebilir ve floresan değerlerinin normalleştirilmesi için ek işaretçilerin eş transfeksiyonunu gerekli değildir.

Bu yöntemin kritik bir kısmı, klonlanmış nccr 'nin, hasta plazmasında bulunan çoğunluk türevler...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Johannes Korth, Astellas ve Novartis 'ten konuşmacı ücreti ve seyahat giderleri için hibe aldı. Marek Widera, Novartis 'ten danışmanlık ücreti aldı. Oliver Witzke, Astellas, Basilea, Biotest, Bristol-Myers-Squibb, Correvio, chiesi, Gilead, Hexal, Janssen, Dr. F. Köhler Chemie, MSD, Novartis, Roche 'dan klinik çalışmalar, konuşmacı ücreti, honoraria ve seyahat giderleri için hibe aldı. Pfizer, Sanofi ve TEVA.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar mükemmel teknik yardım için Barbara Bleekmann teşekkür ederiz. Bu çalışmalar, Duisburg-Essen Tıp Fakültesi 'nin IFORES-programı ve Üniversitesi Ittifak Ruhr ve Mercator araştırma merkezi Ruhr (MERCUR) RIMUR-programı tarafından destekleniyor. Yazarlar, Helene Sertznig 'in Doktora Bursu ve sürekli destek için Jürgen-Manchot-Stiftung ' a teşekkür ederler. Hasta materyalinin toplanması ve kullanımı, Duisburg-Essen (14-6028-BO) Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100 bp merdivenNEBN32311 kb'ye kadar menzile sahip herhangi bir merdiven
2 kütüklü merdivenNEBN055010 kb'ye kadar menzile sahip herhangi bir merdiven ikame edilebilir
Agar-Agar, Kobe ICarl Roth5210.3
AgeI-HFNEBR3552
Ampisilin Natriumsalz CellpureCarl RothHP62.1
Aqua ad iniectabiliaBbraun2351744tarafından ikame edilebilir
; IIBD Biosciences
BD FACSDivaBD Biosciences
DAPISigma10236276001 DFC450C
kamera modülüLeicaHerhangi bir kamera kullanılabilir
DMEMGibco41966-029herhangi bir üretici tarafından değiştirilebilir
DMIL LED mikroskopLeicaHerhangi bir floresan mikroskobu kullanılabilir
DNA Kan Mini KitiQiagen51104herhangi bir üretici tarafından ikame edilebilir
E.coli DH5alpha Yetkili HücrelerThermo Scientific18258012
FBS SuperiorMerckMillipore50615Herhangi bir FBS kullanılabilir
FlowJo v10.5.3FlowJo, LLCHerhangi bir akış sitometri yazılımı FBS kullanılabilir
Jel Yükleme Boyası, Mor (6X) NEBB7024Herhangi bir 6x yükleme boyası
ATCC11268hücreleri HEK293TBu hücreler, simian virüsü 40 (SV40) büyük T antijenini yapısal olarak eksprese eder ve klon 17, yüksek transfektebilitesi için özel olarak seçilmiştir.
HERAcell® 240i CO2 İnkübatörüThermo Scientific, herhangi bir üretici tarafından ikame edilebilir
HotStar PCR kitiQiagen203203
Intas Jel dokümantasyon sistemiIntasAgaroz jelleri içeren lekeli DNA için herhangi bir görselleştirme sistemi kullanılabilir
Düşük Eriyik AgarozBiozym850081 herhangi bir üretici
Opti-MEMInvitrogen31985070herhangi bir üretici tarafından ikame edilebilir
pBKV (34-2)ATCC45025BKPyV suşu Dunlop'un tam uzunlukta genomunu barındıran plazmid; pozitif kontrol olarak kullanıldı; Acc.: KP412983
PBSGibco14190-136
PCR Döngüleyici MJ Mini 48 Kuyulu Kişisel DöngüleyiciBio-Radüretimi durdurulan ürünHerhangi bir termodöngüleyici kullanılabilir
PCR Nükleotid Karışımı, 10 mMPromega#C1145herhangi bir üretici tarafından ikame edilebilir
PCR1 ve PCR2 PrimerlermetabionuygulanamazTuzdan arındırılmış. (10 & mikro; M) PCR sınıfı su ile
PenStrep (100x)Gibco15140-122herhangi bir üretici tarafından ikame edilebilir
Roti®-GelStainCarl Roth3865dsDNA konsantrasyonunu ölçmek için floresan bazlı bir leke
SpeI-HFNEBR3133
T4-DNA LigazNEBM0202
TransIT LT1MirusMIR2300
Tripsin% 0.05 - EDTAGibco25300-054herhangi bir üretici tarafından ikame edilebilir
ZymoPURE II Plazmid KitiZymoD4201herhangi bir üretici tarafından ikame edilebilir
değiştirilebilir , herhangi bir üretici BD FACSCanto & trade , ikame edilebilir tarafından ikame edilebilir, ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Drachenberg, C. B., et al. Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load. American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).
  2. Korth, J., et al. Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function. Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).
  3. Hirsch, H. H., et al. European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation. Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).
  4. Masutani, K., et al. The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome. American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).
  5. Korth, J., et al. Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region. Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).
  6. Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12. Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).
  7. Sanchez Fructuoso, A. I., et al. Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients. Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).
  8. Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis. Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).
  9. Gosert, R., et al. Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology. Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).
  10. Bethge, T., et al. Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression. Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).
  11. Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate. Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).
  12. Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression. American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).
  13. Widera, M., et al. HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia. Medical Microbiology Immunology. , (2017).
  14. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiment. (6), 247(2007).
  15. Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland. Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).
  16. Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals. Virology. 198 (1), 59-70 (1994).
  17. Teutsch, K., et al. Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy. Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).
  18. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).
  19. Korth, J., et al. The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation. Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).
  20. Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens. Virology. 152 (2), 459-465 (1986).
  21. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

BK PolyomavirusNon Coding Control RegionTranscriptional ActivityFlow CytometryDual Fluorescence ReporterHEK293T CellsAntiviral AgentsNCCR RearrangementsEarly Late Gene ExpressionFluorescence Microscopy

Related Articles