Bu yazıda, tdTomato ve eGFP 'i ifade eden bir çift yönlü muhabir Plasmid ile nakledilmiş HEK293T hücrelerini kullanarak BK-polyomavirus transkripsiyon aktivitesinin FACS tabanlı ölçümünü gerçekleştirmek için bir protokol sunulmuştur. Bu yöntem daha da Nicek viral transkripsiyon üzerinde yeni bileşiklerin etkisini belirlemek için izin verir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
BK-polyomavirus kodlama dışı kontrol bölgesini Akış sitometrisi yoluyla transkripsiyon aktivitesinin ölçümü
Bu makalede
Özet
Özet
BK-polyomavirus (BKPyV) gibi polyomaviruses, bağışıklık sistemini tehlikeye atılan hastalarda şiddetli patolojilere neden olabilir. Ancak, son derece etkili antiviral Şu anda mevcut olmadığı için, potansiyel anti-virüs ajanların etkisini ölçme yöntemleri gereklidir. Burada, BKPyV kodlama olmayan kontrol bölgesinin (NCCR) erken ve geç organizatörü aktivitesinin analizine izin veren bir çift floresan muhabiri, potansiyel antiviral ilaçların tdTomato ve eGFP aracılığıyla viral gen ifadesinde etkisini ölçmek için inşa edildi Ifa -de. Buna ek olarak, bu protokolde, immünolojili renal nakledilen hastaların kan türeği DNA 'sından örnek olarak elde edilen bkpyv-nccr amplikonlar klonlayarak, nccr-redüzenlemeleri viral gen ifadesi üzerine etkisi tespit edilebilir. Hasta türevi amplicons klonlama sonrasında, HEK293T hücreler muhabiri-plazmids ile transferleştirilmiş ve potansiyel antiviral ajanlar ile tedavi edildi. Daha sonra hücreler, ortalama floresans yoğunlukları 72 h Post transfeksiyon ölçümü için FACS-analizine tabi tutulmuştur. Ayrıca potansiyel bir hücre döngüsü inhibe etkisi olan ilaçların analizini test etmek için, sadece transfekte ve böylece floresan hücreler kullanılır. Bu tahlil büyük T antijeni hücre ifade gerçekleştirildiği için, erken ve geç ifade etkisi karşılıklı bağımsız bir şekilde analiz edilebilir.
Giriş
Polyomaviruses küçük çift telli DNA bağımsız bir aile temsil (dsDNA) Simian virüsü 40 ile virüsler (BAZıLARıNDA SV40) bir prototip türü olarak. Primer enfeksiyon çoğunlukla çocukluk çağında oluşur, genellikle hastalık belirtileri olmadan devam ve genellikle bağışıklık yetkili konaklarında gizli enfeksiyonlara neden. BK-polyomavirus (BKPyV), renal tübüller hücrelerinde nefropatolojilere neden olmadan çoğunlukla devam eder, ancak böbrek nakli sonrasında bağışıklık-yetkinliğin bozulması durumunda virüs yeniden etkinleştirebilir ve şiddetli zararlar verebilir ve greft bozulması yüksek viremi ulaştığında fonksiyon (1 x 104 bkpyv DNA kopyaları/ml)
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu protokol, Duisburg-Essen (14-6028-BO) Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Komitesi tarafından onaylanan insan araştırmaları yönergelerini takip eder.
1. kan veya idrar numunelerinin toplanması ve polyomavirüsdür DNA 'sı yalıtımı
- EDTA tüpleri veya idrar edinme tüplerinde en az 3 mL kan toplayın.
- Numuneyi 2.500 x g 'de 15 dakika santrifüjün. Gerekirse, plazmayı yeni bir tüpte pipet ve plazma örneklerini birkaç gün boyunca 4 °C ' de saklayın ya da daha uzun süreli depolama için-20 °C ' de dondurur.
- 40 μL proteinaz K 'yi 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne hazırlayın ve pipetleme ile 400 μL plazma ekleyin. <....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu temsilci denemede, BK-polyomavirus kodlama olmayan kontrol bölgesi güdümlü transkripsiyon aktivitesi Akış sitometrisi ile ölçülmüştür. Ayrıca, BKPyV reaktivasyonu sonrasında hastaları tedavi etmek için kullanılabilecek bir mTOR inhibitörü, viral erken Gen ifadesinin inhibisyonu için test edildi. Bu amaçla, daha önce yayınlanan bir çift floresan-muhabir tahlil olarak kullanıldı5. Deneysel kurulumunun genel iş akışı şeması Fıgure 1
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu makalede, sık kullanılan bir yöntem, bkpyv kodlama olmayan denetim bölgesi (nccr) erken ve geç Organizatör etkinliği yönetilen analizi için olanak sağlar sunulmuştur. Nccr aktivite aynı anda ölçülebilir ve transfekte hücrelerin lizis gerekmez. Dahası, nispeten çok sayıda hücre analiz edilebilir ve floresan değerlerinin normalleştirilmesi için ek işaretçilerin eş transfeksiyonunu gerekli değildir.
Bu yöntemin kritik bir kısmı, klonlanmış nccr 'nin, hasta plazmasında bulunan çoğunluk türevler.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Johannes Korth, Astellas ve Novartis 'ten konuşmacı ücreti ve seyahat giderleri için hibe aldı. Marek Widera, Novartis 'ten danışmanlık ücreti aldı. Oliver Witzke, Astellas, Basilea, Biotest, Bristol-Myers-Squibb, Correvio, chiesi, Gilead, Hexal, Janssen, Dr. F. Köhler Chemie, MSD, Novartis, Roche 'dan klinik çalışmalar, konuşmacı ücreti, honoraria ve seyahat giderleri için hibe aldı. Pfizer, Sanofi ve TEVA.
Teşekkürler
Yazarlar mükemmel teknik yardım için Barbara Bleekmann teşekkür ederiz. Bu çalışmalar, Duisburg-Essen Tıp Fakültesi 'nin IFORES-programı ve Üniversitesi Ittifak Ruhr ve Mercator araştırma merkezi Ruhr (MERCUR) RIMUR-programı tarafından destekleniyor. Yazarlar, Helene Sertznig 'in Doktora Bursu ve sürekli destek için Jürgen-Manchot-Stiftung ' a teşekkür ederler. Hasta materyalinin toplanması ve kullanımı, Duisburg-Essen (14-6028-BO) Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 100 bp merdiven | NEB | N3231 | 1 kb'ye kadar menzile sahip herhangi bir merdiven |
| 2 kütüklü merdiven | NEB | N0550 | 10 kb'ye kadar menzile sahip herhangi bir merdiven ikame edilebilir |
| Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth | 5210.3 | |
| AgeI-HF | NEB | R3552 | |
| Ampisilin Natriumsalz Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
| Aqua ad iniectabilia | Bbraun | 2351744 | tarafından ikame edilebilir |
| ; II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
| DAPI | Sigma | 10236276001 DFC450C | |
| kamera modülü | Leica | Herhangi bir kamera kullanılabilir | |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | herhangi bir üretici tarafından değiştirilebilir |
| DMIL LED mikroskop | Leica | Herhangi bir floresan mikroskobu kullanılabilir | |
| DNA Kan Mini Kiti | Qiagen | 51104 | herhangi bir üretici tarafından ikame edilebilir |
| E.coli DH5alpha Yetkili Hücreler | Thermo Scientific | 18258012 | |
| FBS Superior | MerckMillipore | 50615 | Herhangi bir FBS kullanılabilir |
| FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | Herhangi bir akış sitometri yazılımı FBS kullanılabilir | |
| Jel Yükleme Boyası, Mor (6X) | NEB | B7024 | Herhangi bir 6x yükleme boyası |
| ATCC | 11268 | hücreleri HEK293T | Bu hücreler, simian virüsü 40 (SV40) büyük T antijenini yapısal olarak eksprese eder ve klon 17, yüksek transfektebilitesi için özel olarak seçilmiştir. |
| HERAcell® 240i CO2 İnkübatörü | Thermo Scientific | , herhangi bir üretici tarafından ikame edilebilir | |
| HotStar PCR kiti | Qiagen | 203203 | |
| Intas Jel dokümantasyon sistemi | Intas | Agaroz jelleri içeren lekeli DNA için herhangi bir görselleştirme sistemi kullanılabilir | |
| Düşük Eriyik Agaroz | Biozym | 850081 herhangi bir üretici | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | herhangi bir üretici tarafından ikame edilebilir |
| pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | BKPyV suşu Dunlop'un tam uzunlukta genomunu barındıran plazmid; pozitif kontrol olarak kullanıldı; Acc.: KP412983 |
| PBS | Gibco | 14190-136 | |
| PCR Döngüleyici MJ Mini 48 Kuyulu Kişisel Döngüleyici | Bio-Rad | üretimi durdurulan ürün | Herhangi bir termodöngüleyici kullanılabilir |
| PCR Nükleotid Karışımı, 10 mM | Promega | #C1145 | herhangi bir üretici tarafından ikame edilebilir |
| PCR1 ve PCR2 Primerler | metabion | uygulanamaz | Tuzdan arındırılmış. (10 & mikro; M) PCR sınıfı su ile |
| PenStrep (100x) | Gibco | 15140-122 | herhangi bir üretici tarafından ikame edilebilir |
| Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | dsDNA konsantrasyonunu ölçmek için floresan bazlı bir leke |
| SpeI-HF | NEB | R3133 | |
| T4-DNA Ligaz | NEB | M0202 | |
| TransIT LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Tripsin% 0.05 - EDTA | Gibco | 25300-054 | herhangi bir üretici tarafından ikame edilebilir |
| ZymoPURE II Plazmid Kiti | Zymo | D4201 | herhangi bir üretici tarafından ikame edilebilir |
Kaynaklar
- Drachenberg, C. B., et al. Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load. American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).
- Korth, J., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
