Yöntem makalesi

Iyi tanımlanmış kayma stres altında tek hücreli Iyon akımları elektrofizyolojik kayıtlar

DOI:

10.3791/59776

⸱

2 Ağustos 2019

 , 
1Department of Medicine, Division of Pulmonary, Critical Care, Sleep and Allergy, University of Illinois at Chicago

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün amacı, kayma stresi ile mekanik duyarlı iyon kanallarının gerçek zamanlı aktivasyonunu araştırırken kullanılmak üzere değiştirilmiş bir paralel plaka akış odasını tarif etmektir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sıvı kesme stres iyi endotel fonksiyonunda önemli bir rol oynamak için bilinmektedir. Çoğu vasküler yataklarda, kan akışındaki akut artışlardan kaynaklanan yüksek kesme gerilimi, damar duvarındaki mekanik stresin azaltılması için vazodilasyona neden olan sinyalizasyon basamaklarını tetikler. Kesme stres deseni de iyi bir ateroskleroz gelişiminde önemli bir faktör olarak bilinen laminar kesme stres atherokoruyucu ve rahatsız kesme stres Pro-atojik olmak. Biz çeşitli ara hücre sinyalizasyon yolları ayrıntılı bir anlayış var iken, ilk kimyasal mediatörlere mekanik uyarıcı tercüme reseptörleri tamamen anlaşılır değildir. Mekanik duyarlı iyon kanalları, böylece vazoaktif mediatörlerin üretimini kontrol etmek için kesme ve kesme kaynaklı hücre sinyalleme düzenleyen yanıt için önemlidir. Bu kanallar, kesme için en erken aktif sinyal bileşenleri arasındadır ve nitrik oksit üretimini teşvik ederek kesme kaynaklı vazodilasyona bağlanmıştır (örn., K+ [kır] ve geçici reseptör potansiyeli [TRP] kanallar) ve endotelyum hiperpolarizasyon faktörü (örn., kir ve kalsiyum aktive K+ [KCA] kanallar) ve piezo kanalları içeren belirlenmemiş bir mekanizma aracılığıyla kesme kaynaklı vazokonstriksiyon. Bu kanalların kesme kuvvetleri tarafından aktive edildiği Biyofizik mekanizmayı anlamak (örneğin, doğrudan veya birincil mekanik reseptör yoluyla), endotel disfonksiyon ile ilişkili patofisyolojisi çözmek için potansiyel yeni hedefler sağlayabilir ve Atherogenesis. Elektrofizyoloji kullanarak gerçek zamanlı iyon kanallarının akış kaynaklı aktivasyonunu kaydetmek için hala önemli bir sorundur. Hücreleri iyi tanımlanmış kesme stresine maruz bırakmak için standart yöntemler, örneğin koni ve plaka reometresi ve kapalı paralel plaka akış odası iyon kanalı aktivasyonunun gerçek zamanlı çalışmasına izin vermez. Bu protokolün amacı, iyi tanımlanmış kayma stres altında mekanik duyarlı iyon kanallarının gerçek zamanlı elektrofizyolojik kayıt sağlayan değiştirilmiş bir paralel plaka akış odası açıklamak için.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kan akışının oluşturduğu hemodinamik kuvvetler, endotel ve vasküler fonksiyonların1,2' de önemli roller çalmaktadır. Aynı zamanda iyon kanallarının çeşitli türleri akut kayma stres değişiklikleri yanıt bilinmektedir3,4,5 hipotezi için iyon kanalları primer kesme stres sensörleri olabilir lider. Daha yakın zamanda, biz ve diğerleri mekanik duyarlı iyon kanalları çeşitli kesme stres duyarlı damar fonksiyonları kritik roller oynamak gösterdi, kırma stres vazoaktif yanıt dahil olmak üzere6,7,8 ve gelişimsel anjiyogenez9. Ancak, iyon kanallarının kesme-stres hassasiyeti mekanizmaları neredeyse tamamen bilinmiyor. Bu bilgi boşluğu, iyi tanımlanmış kayma stres altında elektrofizyolojik kayıtların gerçekleştirilmesi teknik zorluk nedeniyle muhtemeldir. Bu makalede, bu nedenle, bu hedefe ulaşmak için laboratuvarımızda rutin olarak gerçekleştirilen bir adım adım ayrıntılı protokol sunuyoruz6,7,10,11.

Bu yöntemin genel amacı, fizyolojik aralıkta iyi tanımlanmış kesme stres altında iyon kanal mechanoactivation gerçek zamanlı soruşturma sağlamak için. Bu, standart bir paralel plaka akış odası değiştirerek elde edilir bir elektrofizyolojik pipet odasına indirilerek ve erişim hücreleri alt plaka üzerinde gerçek zamanlı akımına maruz kalma sırasında yetiştirilen, bu elde etmek için benzersiz bir yaklaşım sağlar hedef6,7,11. Buna karşılık, önceki yayınlarda açıklanan standart paralel plaka akış odaları, kesme kuvvetlerine maruz kalan hücrelerin gerçek zamanlı görüntüleme analizi için kullanılabilir12 veya diğer non-invaziv yaklaşımlar13,14 ama değil Elektrofizyoloji. Benzer şekilde, koni ve plaka aparatı, hücreleri açığa çıkarmak için başka bir güçlü yaklaşım15,16 kesme stres de elektrofizyolojik kayıtlar için uygun değildir. Böylece, bu akış cihazları iyon kanallarının kesme stres hassasiyeti araştırılması izin vermez. Akış altında elektrofizyolojik kayıtların gerçekleştirilmesinde zorluk, bu önemli etkilerden sorumlu mekanizmalar hakkında bilgi sağlamlığı için ana nedenidir.

Aynı hedefe ulaşmak için alternatif yaklaşımlar açısından, doğru veya kontrollü olan hiçbiri vardır. Bazı önceki çalışmalar,17,18yukarıdakinden bir hücrenin yakınında getirilen başka bir pipet gelen sıvı akışına hücreleri göstererek akış altında iyon kanal etkinliğini kaydetmeye çalıştı. Bu son derece fizyolojik olmayan, bu koşullarda oluşturulan mekanik kuvvetler kan damarlarında kesme stres fizyolojik profilleri ile ortak az olduğu gibi. Benzer endişeler açık odaların perfüzyon fizyolojik kesme stres simüle girişimleri için geçerlidir. Daha önceki çalışma10' da ayrıntılı olarak anlatıldığı gibi, açık bir sıvı hava arayüzü, fizyolojik olmayan, birden fazla bozulma ve devridaim oluşturur. Tüm bu endişeleri gidermek için, daha önceki çalışmalarımız6,7,10,11, yapılan "minimal invazif akış cihazı" olarak da adlandırılan değiştirilmiş bir paralel plaka (MPP) akış odası tasarladık Akrilik ve yaygın laboratuvarımızda kullanılır. Ancak, tasarımın orijinal tanımı neredeyse 20 yıl önce yayınlandı olmasına rağmen ve iyi tanımlanmış kesme stres altında elektrofizyolojik kayıtların gerçekleştirilmesi sağlayan tek akış cihazdır, Bu metodoloji değil diğer laboratuvarlar tarafından benimsenmiştir ve akış altında akımları kaydetmek için girişim sadece çok az sayıda çalışmalar vardır. Bu nedenle, MPP akış odasını kullanmak için ayrıntılı bir açıklama sağlayan, mekanik duyarlı iyon kanalları ve vasküler biyoloji ile ilgilenen araştırmalar için büyük yardımcı olacaktır inanıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışmalarda hayvanların kullanımı Chicago hayvan bakım Komitesi Illinois Üniversitesi tarafından onaylanmıştır (#16-183).

1. modifiye paralel plaka akış odasının montajı

Not: Lütfen Tablo 1 ve ŞEKIL 1 için MPP akış odası parça kimlikleri bakın. Montaj için oda parçalarının oryantasyonunu ayrıntılarıyla açıklayan bir şematik için lütfen Şekil 1 ' e bakın.

  1. Dikdörtgen kapak camına, D parçasına, C parçasının altına sığması için, ilk olarak 500 μL silikon elastomer kür ajanını 5 mL silikon elastomer tabanına karıştırarak silikon elastomer solüsyonu yapın.
  2. C parçasının dikdörtgen boşluklarının kenarları etrafında silikon elastomer çözeltisinin ince bir katmanını uygulayın ve dikdörtgen kapak cam parçası D 'yi doğrudan elastomer çözümüne yerleştirin, böylece D parçası C 'nin açık dikdörtgen alanını tamamen kapsar. Aşırı silikon elastomer solüsyonu dikkatlice silin.
  3. Dikdörtgen kapak cam, parça F, parça E altına yapışmasına için adım 1,2 tekrarlayın ve silikon elastomer çözüm oda sıcaklığında gece boyunca tedavi izin.
    Not: Tedavi edildikten sonra, dikdörtgen kapak camı, değiştirilmesi gerekmeden önce altı aya kadar yapışacak şekilde kalacaktır.
  4. Alt oda parçası ile başlayarak, parça E, sıralı olarak aşağıdaki sırada önceki her parça yerleştirerek MPP akış odası birleştirmek: parça E (alt), parça C, parça B, parça A (üst).
  5. Her parçanın vida delikleri köşelerinde hizalayın ve MPP akış odasına akış yönetirken meydana gelen sızıntıları önlemek için sıkıca birlikte parçaları vidalayın.

2. hücre hazırlama ve MPP akış odasına tohumlama

Not: Kültürlü endotel hücreler için 2.1 − 2.7 adımları izleyin. Endotel hücrelerini fare mezenterik arteriyel Arcade 'den izole etmek ve taze izole endotel hücrelerin hazırlanması için 2.8 − 2.14 adımda ayrıntılı yöntemi izleyin.

  1. 6-kuyu plakasında, dört ila 5 12 mm kapak cam daire/kuyu ve tohum hücrelerini% 10 ile% 30 arasındaki konflukans gibi tek hücrelere electrofizyoloji kayıtları için erişilebilir.
  2. Standart kültür koşullarında (% 5 Co2, 37 °c) hücrelerde inküyenin en az 2 h için hücrelerin uymasına izin vermek ve hiçbir daha fazla 24 yazarlar ' deneyim endotel hücreleri olarak h çok düz ve yama için zor zaman alt-confluency daha fazla 24 için seribaşı hale H.
  3. 6-kuyu plakasının bir kuyunun içine yapışan hücreleri içeren bir kapak camı çıkarın, fosfat-tamponlu tuz (PBS) ile hızlı bir şekilde durulayın ve MPP akışına aktarmadan önce 2 mL elektrofizyolojik banyo çözeltisi (Tablo 2) içeren bir 35 mm Petri tabağı aktarın Odası.
  4. Kapak cam daire dikdörtgen kapak cam transfer, parça D, hangi MPP akış odasının C parçası için yapışmış olduğu emin olmak yeterli çözüm kapak cam üzerinde kalır böylece hücreler havaya maruz olmayacaktır. İstenilen banyo çözümünü (~ 250 μL) hücrelere ekleyin, böylece kapak camı çemberi ve hücreleri tamamen çözüme sahiptir.
  5. Böylece hücrelerin parça B yarık açıklıkları ile birlikte olacak şekilde kapak cam daire, vakum rezervuar tarafına en yakın yarısında kalır şekilde konumlandırın. cam kapak daire çözüm-cam yapışma ile D parça yapışır emin olun böylece uygulama kapak cam daire konumunu bozmaz Oda akışı.
  6. 1,4 ve 1,5 adımlarında ve Şekil 1' de gösterildiği gibi, parçaları birlikte uygun düzende VIDALAYARAK MPP akış odasını birleştirin. Oda mikroskop aşamasına aktarın ve hemen banyo çözeltisi ile Oda serpmek bu çözüm aspirasyon için vakum rezervuar ulaşır (~ 10 ml).
  7. Karanlık kenarlık ve bariz çekirdeği olan bir hücreyi belirleyerek deneme için sağlıklı bir hücreyi tanımlayın. Diğer hücrelerle temas eden hücreler veya hücre karartılması olarak görünen hücrelerden kaçının.
    Not: Yazarların laboratuvarında, kültürde insan aort endotel hücreleri ve primer fare mezenterik endotel hücreleri kullanılmaktadır. Bununla birlikte, belirli araştırma ihtiyaçlarına ilgi gösteren diğer herhangi bir tür yapışkar hücre aynı şekilde kullanılabilir.
  8. Yalıtılmış arteriyel Arcade ayrışma solüsyonu yıkayın (Tablo 2). Bu çarşı, 2 ml ön ısıtılmış (37 °C) kesilme çözeltisi ( Tablo 2' de gösterilen dissosyasyon çözeltisi tarifi) ile nötr proteaz (0,5 mg/ml) ve elastaz (0,5 mg/ml) Içeren 2 ml santrifüj tüpüne aktarın. 37 °C ' de her 10 dakikada bir hafifçe sallama ile 1 h için inkübe.
  9. Nötr proteaz/elastaz ayrışma çözeltisi 1 ml çıkarın ve 1 mg/ml kolajenaz tip 1 ekleyin. Son kolajenaz türü 1 konsantrasyonu 0,5 mg/ml için arterlerin içeren çözüme kolajenaz çözüm dönün. 37 °C ' de 2 − 3 dak.
  10. 5 sınıf forseps kullanarak, hızlı bir 35 mm çapı Petri çanak üzerinde bir 750 μL taze, soğutulmuş ayrışma çözeltisi içeren üzerine Arcade taşıyın. Daha fazla 2 20 G şırınga iğneler kullanarak doku DISSOCIATE endotel hücreleri enzimsel olarak sindirilmiş arterlerin mekanik olarak özgürleşmesi.
  11. 9 "tek kullanımlık Pasteur cam pipet kullanarak, hücre çözeltisi 10X cam pipet kullanarak yeni bir 1,5 mL santrifüj tüp için hücreleri aktarmadan önce triturate.
  12. Petri tabağı başka bir 750 μL ayrışma solüsyonu ile yıkayın ve aynı tüpe aktarın. Cam Pipet kullanarak, daha mekanik tek bir hücre süspansiyon endotel hücre bütünlüğünü zarar verebilecek kabarcıklar tanıtmak için dikkatli olmak için en az 10X pipetleme hücreleri dağıtır.
  13. 750, endotel hücresi süspansiyonunun (~ 500 − 1000 hücre) μL değerini, rezervuar vakum tarafına en yakın olan yarı MPP akış odasının D parçasına doğrudan ekleyin. Endotel hücrelerin oda sıcaklığında 45 dk ve 1 saat arasında uymasına izin verin.
  14. 1,4 ve 1,5 adımlarında ve Şekil 1' de gösterildiği gibi, parçaları birlikte uygun düzende VIDALAYARAK MPP akış odasını birleştirin. Oda mikroskop aşamasına aktarın ve hemen banyo çözeltisi ile Oda serpmek Bu çözelti vakum aspirasyonu ulaşır (~ 10 ml). Onların kaba ve yuvarlak fenotip tarafından erişilebilir endotel hücreleri tanımlamak19,20.
    Not: Farklı arteriyel yataklardan endotel hücrelerini izole etmek için çeşitli sindirim yöntemleri ve enzim kokteylleri kullanılmıştır. Tablo 3 , mekanik duyarlı iyon kanallarının yama kelepçe elektrofizyolojisi için endotel hücrelerini yalıtmak için araştırmacılar çeşitli tarafından kullanılan protokoller ayrıntılı açıklamaları için bkz. Bu yöntemler büyük olasılıkla MPP akış odası ile birlikte kullanılmak üzere uygundur.

3. kesme stresini MPP akış odasına kontrol ederek, kayma-aktif mekanik duyarlı Iyon kanallarının elektrofizyolojik kayıtları

  1. 30 ml 'lik bir şırınga silindirini, mikrobor boru (iç çapı: 0,05 inç, dış çap: 0,09 inç) ile donatılmış 3 yönlü Luer kilitlere bağlayarak bir yerçekimi perfüzyon sistemi kurma, MPP 'nin 3 mm çapında giriş deliğine yerleştirilmesi için uygundur Odası.
  2. Dereceli silindiri, Çift taraflı bant kullanarak Elektrofizyoloji makinesinin çevresindeki Faraday kafesi 'nin dış yüzüne takın (Şekil 2). Önce MPP odasına tüp takmak için, önceden doldurmak şırınga ve küvet çözeltisi ile boru ( Tablo 2 için bkz: banyo çözeltisi ınwardly önleyici önleyici K+ kanallar endotel hücrelerde araştırmak için kullanılır). Borusu A parçasının MPP akış odası giriş deliğine takın.
  3. MPP akış odasını, çözelti vakum rezervuarında kaldırılmakta olan çözeltiyle önceden doldurun. Odaya akış durdurun ve üst işareti için dereceli silindir doldurmak. Çözeltinin Oda üzerinden akmasına ve belirli bir şırınga silindir yüksekliğindeki mL/s 'yi hesaplamak için bir durdurma-saat kullanarak akış oranlarını el ile hesaplayın.
  4. Akışı değiştirmek için şırıngayı yükseltin veya alçaltın ve böylece odada kesme yapın ve istenilen seviyede kesme stresi buluncaya kadar bu işleme devam edin.
  5. Aşağıdaki denklem21kullanarak paralel bir odada kesme gerilimi hesaplayın:
    τ = 6μQ/h2w
    Burada μ = sıvı viskozitesi (g/cm · s), Q = akış hızı (mL/s) ve paralel plaka odası genişliği (w = 2,2 cm) ve yüksekliği (h = 0,1 cm).
    Not: Mevcut yerçekimi perfüzyon sistemi, bir şırınga silindir yüksekliği (gibi silindir üst ölçülen) içinde 57 cm mikroskop aşamasında, akış oranı 0,3 mL/s. Bu şırınga silindir yüksekliği ve akış hızında odasında hesaplanan kesme 0,7 dyn/cm2' dir. Ayrıca, peristaltik pompa gibi diğer perfüzyon sistemlerinin MPP akış odasına akışını kontrol etmek için kullanılabilirler. Ancak, bu cihazlar istenmeyen türbülans ekleyebilir ve akış altında Elektrofizyoloji ölçümlerinin istikrarı etkileyebilir, bu nedenle, burada açıklanan yerçekimi perfüzyon sistemi kullanılarak tavsiye edilir.
  6. Monte edilen bir odası Elektrofizyoloji donanımının mikroskop aşamasına yapışan hücreler içeren transferi ve tüp ön-banyo çözeltisi ile parça A. aynı anda doldurmak ve hücreleri yıkayın 10 mL banyo çözeltisi ile 3-yönlü luer kilidi gibi çözüm odasına akar tornalama.
  7. İstenilen yama konfigürasyonu başarıyla elde edildikten sonra kanal akımlarının oda sıcaklığında statik bir banyoda stabilizasyonu sağlar. Akımlar stabilize edildikten sonra, kesme stresinde bir sonraki adımdan önce stabilize etmek için mevcut artışlara izin veren bir step-Wise moda kesme uygulayın.
    Not: Yazarlar, endotel hücrelerinde mechanoactivated iyon kanalları okurken delikli yama konfigürasyonu ile en başarılı bulmak. Delikli tüm hücreli yama konfigürasyonları gerçekleştirmek için, dimetil sülfoxide (DMSO) 1 ml 0,2 μm steril filtreli pipet çözeltisi için 5 μL 60 mg/ml stok Amfoterisin B ekleyin. Hücreye bağlı konfigürasyonda bir giga-ohm mührü oluşturduktan sonra, 2 − 5 dk içinde perforasyonlu tüm hücreli yamalar oluşturur.
  8. Mekanik duyarlı kanal akımlarının statik banyoda gözlenen temel akımına geri dönmesini sağlayan odacık akışını durdurarak hücrelere kesme pozlamasını kaldırın.
  9. Çözüm valresinin değiştirilmesi (örn. 60 mM K+ banyo çözeltisi, 0 CA2 + ' da pipet çözeltisi ile k + kanallarını iç alarak incelemek için, mekanik duyarlı iyon kanalı akımları ile ilgi alanı yalıtın. Tablo 2 örnek çözüm tarifleri gösterir) ve/veya potansiyel kontamine mevcut kaynakların farmakolojik inhibisyonu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskop aşamasında MPP akış odasının farklı görünümlerini gösteren birden fazla fotoğraf (üst panel) ve MPP akış odasının şematik gösterimi (alt panel) Şekil 1' de gösterilir. Şematik detaylar tüm cihaz ve akış odası boyutları. Şekil 2 , laboratuvarımızda (üst panel) MPP akış odasına yerçekimi perfüzyon sisteminin bir fotoğrafını gösterir. Ayrıca gösterilen akış sisteminin bir şematik temsili (alt panel) perfüzyon sisteminden ç...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vasküler sistem sürekli aktif hemodinamik kuvvetlere maruz kalmaktadır, hangi mekanik duyarlı iyon kanalları etkinleştirmek,3,22 ama bu kanallar kesme stres kaynaklı mechanotransdution içinde fizyolojik rolleri sadece 4,6,8ortaya çıkmaya başlıyor. Kesme stres aktif kanalların mekanik sensitivitesi sorumlu mekanizmalar bilinmeyen kalır. Burada ayrıntılı protokol, gerçek z...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Ulusal Kalp, akciğer ve kan Enstitüsü (R01 HL073965, IL) ve (T32 HL007829-24, ıSF) tarafından finanse edilmiştir. Yazarlar da en son MPP akış odaları oluşturmak için Chicago Illinois Üniversitesi 'nde bilimsel makine dükkanı kabul etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.2 ve mikro; m steril şırınga filtreleriVWR28145-501Elektrofizyolojik pipet çözeltisini filtrelemek için kullanılır
5 dereceli forsepsİnce Bilimsel Araçlar1252-30Sindirilmiş arterleri taze çözeltiye aktarmak için kullanılır
9" Pasteur PipetFisher Scientifc13-678-20DSindirilmiş arterleri mekanik olarak bozmak ve yeni izole edilmiş endohteliyal hücreleri transfer etmek için kullanılır.
12 mm çap Cam daireleri örtünFisher Scientifc12-545-80Kültürlenmiş hücreleri ve çoklu tedavileri içeren çalışmalarda kullanım içindir. Kapak camına yapıştırılan hücreler yama kelepçesi analizleri için kullanılır
24 mm x 40 mm Dikdörtgen Kapak camıSigma-AldrichCLS2975224MPP akış odası parçalarına eklenecek kapak camı C (Şekil 1)
24 mm x 50 mm Dikdörtgen Kapaklı camSigma-AldrichCLS2975245MPP akış odasına eklenecek kapak camı E (Şekil 1)
20 G şırınga iğneleriBecton Dickinson and Co305175Sindirilmiş mezenterik arterlerin mekanik olarak parçalanmasında kullanım için
35 mm Petri kabıGenesee Scientific32-103Sindirilmiş mezenterik arterlerin mekanik olarak bozulmasında kullanım için
Amfoterisin B çözündürülmüşSigma-AldrichA9528-50MGDelikli tüm hücre yama konfigürasyonunu oluşturmak için kullanılır.
Kollajenaz, tip IWorthington Biyokimyasal100 mg - LS004194Nötr proteaz ve elastazın ilk kokteylini takiben kısa bir sindirim olarak laboratuvarımızda kullanılan
Dimetil Sülfoksit (DMSO)Fisher Scientifc67-68-5Delikli tam hücre yama kelepçesinde kullanılan Amfoterisin B için çözücü
Elastaz, liyofilizeWorthington Biyokimyasal25 mg - LS002290 Laboratuvarımızda, endotel hücre izolasyonu için arterlerin sindirimini başlatmak için nötr proteaz/dispas içeren bir kokteylde kullanılan enzim.
Falcon Doku kültürü Plakası, 6 oyuklu, Düşük Buharlaşma Kapaklı Düz Tabanlı Corning353046Kültürlenmiş hücreleri ve çoklu tedavileri içeren çalışmalarda kullanım için
Nötr proteaz/dispasWorthington Biyokimyasal10 mg- LS02100 50 mg - LS02104Laboratuvarımızda endotel hücre izolasyonu için arterlerin sindirimini başlatmak için elastaz içeren bir kokteylde kullanılan enzim
SylGard World Precision InstrumentsSYLG184Dikdörtgen kapak kızağını MPP akış odası parçaları C ve E'ye yapıştırmak için silikon elastomer (Şekil 1)
Tygon ND 10-80 boruMikro Delikli BoruAAQ04133ID: 0,05 inç, OD: 0,09 inç, odaya akış sağlamak için giriş perfüzyon borusu
enzim

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli. Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).
  2. Gimbrone, M. A. Jr, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis. Annals of the New York Academy of Sciences. 902, discussion 239-240 230-239 (2000).
  3. Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells. Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).
  4. Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals? Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).
  5. Beech, D. J. Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise. Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).
  6. Ahn, S. J., et al. Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries. Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).
  7. Fancher, I. S., et al. Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels. Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).
  8. Rode, B., et al. Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance. Nature Communications. 8 (1), 350(2017).
  9. Li, J., et al. Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force. Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).
  10. Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field. Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).
  11. Fang, Y., et al. Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo. Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).
  12. Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress. Journal of Visualized Experiments. (85), e51330(2014).
  13. Man, H. S. J., et al. Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers. Journal of Visualized Experiments. (140), e58478(2018).
  14. White, L. A., et al. The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress. Journal of Visualized Experiments. (116), e54632(2016).
  15. Franzoni, M., et al. Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers. Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).
  16. Dewey, C. F. Jr, Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A. Jr, Davies, P. F. The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).
  17. Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
  18. Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).
  19. Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery. Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).
  20. Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
  21. Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), e3349(2012).
  22. Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).
  23. Le Master, E., et al. Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).
  24. Kim, J. G., et al. Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow. Journal of Visualized Experiments. (143), e58228(2019).
  25. Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface. Scientific Reports. 6, 39585(2016).
  26. Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
  27. Jacobs, E. R., et al. Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).
  28. Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells. Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).
  29. Fitzgerald, T. N., et al. Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway. Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).
  30. Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Elektrofizyolojik Kay tMekanosensitif yon KanallarParalel Plakl Ak OdasGer ek Zamanl ElektrofizyolojiEndotel H cre Fonksiyonuyon Kanal AktivasyonuAk Odas MontajYama Kenetleme Tekni iKayma Gerilmesi Hesaplamas

İlgili makaleler