Protein-protein etkileşimleri (PPI'ler) biyolojik etkilerin oluşmasında temeldir. Birçoğu hastalıkla yakından bağlantılıdır ve ilaç etkisi için önemli hedefler sundukları giderek daha fazla kabul edilmektedir1. Bu protein etkileşimlerini incelemek için çok sayıda teknik mevcuttur ve bunlardan bazıları bu koleksiyonda veya diğer JoVE makalelerinde tartışılmaktadır. Her tekniğin kendine özgü avantajları ve sınırlamaları vardır2; bununla birlikte, farklı hücre altı bölmelerde, çok çeşitli afinitelerle (pikomolar ila milimolar) meydana gelen ve doğada yalnızca geçici olabilen bu etkileşimlerin muazzam çeşitliliği nedeniyle tüm ÜFE'ler için mükemmel bir teknik yoktur.
İn vitro kinaz deneyleri, kinazların bir fosfat grubunu ATP'den bir substrata aktarmadaki fonksiyonel rollerini nasıl yerine getirdiklerini analiz etmek için kullanılabilecek ÜFE'leri incelemek için dolaylı bir yaklaşımdır. Cui ve ark.3 , insan sentromer proteini F'nin (CENP-F) bir parçası üzerindeki sikline bağımlı kinaz-1'e özgü fosforilasyon bölgelerini tanımlamak için triptik sindirim ve kütle spektrometrisi ile birlikte bu tekniği kullanır. Yeni fosforilasyon bölgelerinin fonksiyonel doğrulaması için yazarlar, fosfonimetik bir mutasyon içeren CENP-F ile bir nükleer taşıma reseptörü olan karyoferin α'yi birleştiren ve böylece çapraz doğrulama sağlayan bir bağlanma testi kullanırlar.
Koimmünopresipitasyon, belirli bir hedefi onunla ilişkili diğer protein molekülleri ile birlikte yakalamak için bir antikorun kullanıldığı ÜFE'leri incelemek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Zheng ve meslektaşları4 , bu tekniği, oksijenle düzenlenen bir α alt biriminden ve ARNT3 olarak da bilinen yapısal olarak eksprese edilen bir β alt biriminden oluşan heterodimerler olarak işlev gören hipoksi ile indüklenebilir faktörleri (HIF'ler) incelemek için uygular. Protokolleriyle ilgili ilginç bir not, hücrelerin hipoksik koşullar altında indüklenmesi ve toplanması ve nükleer fraksiyonlardan endojen proteinlerin daha sonra birlikte immüno-çökeltilmesidir. Yazarların belirttiği gibi, yöntemin bir sınırlaması, ÜFE'lerin doğrudan mı yoksa dolaylı mı olduğunu belirleyememesidir.
Nolan ve ark.5 , floresan mikroskobu görüntülerinde moleküllerin sayısının ve parlaklıklarının ölçülmesi için bir protokol sunar 'Sayı ve Parlaklık' (N&B), protein homo-oligomerizasyonunu saptamak için uygulanabilir. Teknik hem in vitro hem de in vivo olarak kullanılabilir ve dimerize edici bir ilacın eklenmesinden önce ve sonra mVenüs etiketli FKBP12F36V oligomerik durumunu doğru bir şekilde ölçmek için uygulanmıştır. Yazarlar, tekniğin ilgili teknolojilere göre yararlarını tartışır ve ağartma ve uzun vadeli yoğunluk dalgalanmalarını düzeltmenin önemini vurgular. Dijital dedektörlerle donatılmış konfokal mikroskoplar, nicelemeyi kolaylaştırır, ancak analog dedektörlerle N&B de mümkündür.
Multiprotein komplekslerinin afinite saflaştırılması, bileşenlerinin tanımlanmasıyla birlikte, bu tür kompleks proteinlerin işlevlerini anlamak için yaygın olarak kullanılan bir teknik olmuştur. Luzarowski ve ark.6 tarafından hazırlanan protokolde, bu teknik, transgenik Arabidopsis bitki hücrelerinde hem PPI'ları hem de protein-metabolit etkileşimlerini (PMI'ler) aynı anda karakterize ederek bir adım daha ileri götürülmüştür. Etiketli nükleosit difosfat kinazlar, yakalanan proteinler ve küçük moleküller ile tandem afinite saflaştırma (TAP) etiket prosedürü ile afinite saflaştırılır ve daha sonra kütle spektrometrisi ile tanımlanır. Bu protokolün benzersizliği, hem hidrofobik hem de hidrofilik ligandları tanımlama yeteneğidir; hem PPI'ların hem de PMI'ların incelenmesini sağlayan ve hücrelerin ekimine afinite saflaştırması uygulayan üçü bir arada ekstraksiyon protokolüdür.
Yakınlık ligasyonu testi, hücrelerdeki ve dokulardaki endojen proteinler arasındaki etkileşimleri tespit etmek için kullanılma avantajına sahiptir. Karchugina ve Chernoff7 , insan Schwann hücrelerinde (HSC'ler) ve insan embriyonik böbrek hücrelerinde (HEK-293) MST1 ve MST2 kinazlarının heterodimerlerinin varlığını göstermek için tekniği kullanır. Makaleleri, tekniğin başarılı bir şekilde nasıl uygulanacağına dair birkaç değerli ipucu içeriyor. Etkileşen her proteine karşı farklı türlerde yetiştirilen uygun birincil antikorlar gereklidir ve antikorların özgüllüğü ve duyarlılığı anahtar olduğundan, antikor konsantrasyonları ince bir şekilde ayarlanmalıdır. Yazarlar, çoklu hücre hatlarını ve antikor kombinasyonlarını analiz etmek için uygun cam oda slaytları buldular, ancak mikroskopi sırasında konfokal mesafedeki farklılıkları önlemek için kuyucuklar arasındaki tüm silikon ekin çıkarılmasının zorunlu olduğunu belirttiler. Ayrıca sonuçların doğrulanması için çeşitli pozitif ve negatif kontroller kullanılmaktadır.
Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, protein etkileşimleri ve protein-ligand etkileşimleri hakkında atomik düzeyde çözünürlük ve nicel bilgi sağlamak için kullanılabilen hassas bir testtir. Winkelaar ve meslektaşları8 bu tekniği, tipik olarak yoğun mekanik stres yaşayan dokularda bulunan, hücreden hücreye yapışmada yer alan hücre yapıları olan desmozomlarda bulunan iki proteinin (vimentin ve envoplakin) etkileşimini incelemek için kullanıyor. Yazarlar, 15N-etiketli bir vimentin alanı kullanır ve heteronükleer tek kuantum korelasyonu (HSQC) kullanarak bir 2D spektrum elde eder. Envoplakin'den bir alanın varlığında, protein etkileşimi ile tutarlı olarak geniş çizgi genişlemesi ve pik kaybolması gözlenir. Yazarlar, nicel bilgi sağlamak için mutajenez ve mikro ölçekli termoforez (MST) kullanarak etkileşimin temelini daha da araştırıyorlar.
Küçük açılı X-ışını saçılması (SAXS), çözeltideki bir makromolekülün boyutu ve konformasyonları hakkında bilgi sağlamak ve düşük çözünürlükte büyük, çok alanlı veya protein komplekslerinden oluşan moleküler bir zarf oluşturmak için kullanılabilen bir tekniktir. Mrozowich ve ark.9 tarafından hazırlanan protokolde, teknik, kompleks halinde nidojen-1 ve laminin γ-1'in düşük çözünürlüklü bir yapısını oluşturmak için kullanılmıştır. Teknik, NMR spektroskopisi için çok büyük olan ve X-ışını kristalografisi için kristalleştirilmesi zor olan çoklu küresel alanlara sahip büyük proteinlerdeki ÜFE'leri inceleyen araştırmacıların ilgisini çekebilir.
İnsan interaktomunda yaklaşık 650.000 etkileşim olduğu tahmin ediliyor10 - bu alandaki araştırmacıları bir süre daha meşgul etmeye yetecek kadar. Mikroskopi, kütle spektrometrisi ve makine öğrenimindeki ilerlemelerin mümkün kıldığı yeni bir gelişme, gelecekte bu alanda büyük içgörü sağlayabilecek uzamsal proteomiktir11. Bu ÜFE yöntemleri koleksiyonu, araştırmacıların potansiyel tuzaklardan kaçınırken bu önemli zorluğun üstesinden gelmelerine yardımcı olacaktır.