Method Article

Yeni kinaz proteinin sağlam biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak moleküler düzeyde karakterize edilmesi

DOI:

10.3791/59820

⸱

June 30th, 2019

 ,  ,  , 
1Centre de Biophysique Moléculaire, CNRS, UPR 4301, University of Orléans and INSERM

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz güçlü biyokimyasal yaklaşımlar kullanarak yeni bir kinaz protein karakterize: farklı hücre hatları ve dokularda adanmış spesifik antikor ile Batı Blot analizi, coimmunoprecipitation deneyler ile etkileşimler, Batı tarafından tespit kinaz aktivite Fosho spesifik antikor ve γ [32P] ATP etiketleme kullanarak Blot.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geniş tüm genom sıralamasının birçok potansiyel protein sağlayan pek çok açık okuma çerçeveleri (ORFs) belirledi. Bu proteinlerin hücre için önemli rolleri olabilir ve yeni hücresel süreçleri çözebilir. Proteinler arasında, kinazlar, hücre sinyalizasyon yollarına ait olduğu ve hücre büyümesi, bölünme, farklılaşma, motilite ve ölüm gibi hücrenin kaderi için önemli olan birçok işlemi açma veya kapama yeteneğine sahip olduğu için önemli aktörlerdir.

Bu çalışmada, yeni bir potansiyel kinaz proteini, LIMK2-1 üzerinde duruldu. Biz Batı Blot tarafından belirli bir antikor kullanarak varlığını göstermiştir. Biz koimmünoprecipitation deneyler kullanarak upstream düzenleyen protein ile etkileşimi değerlendirdi. Coimmünoprecipitation iki hedef proteinleri arasındaki etkileşimi algılamak mümkün olan çok güçlü bir tekniktir. Ayrıca bir yem proteini yeni ortakları algılamak için kullanılabilir. Yem protein ya kendi sırasına yönelik bir etiket veya özellikle onu hedefleyen bir antikor yoluyla arındırılmış olabilir. Bu protein kompleksleri daha sonra SDS-PAGE (sodyum Dodecyl sülfat Poliakrilamid jel) ile ayrılabilir ve kütle spektrometresi kullanılarak tespit edilebilir. İmmunoprecip, LIMK2-1 de onun kinaz aktivitesini test etmek için kullanıldı in vitro tarafından γ [32P] ATP etiketleme. Bu iyi kurulan tahlil birçok farklı substratlar kullanabilirsiniz, ve yem mutasyonlu sürümleri belirli kalıntıları rolünü değerlendirmek için kullanılabilir. Bu tekniğin hem son derece hassas hem de nicel olduğundan farmakolojik ajanların etkileri de değerlendirilebilir. Yine de, radyoaktivite işleme özellikle dikkatli gerektirir. Kinaz aktivitesi de değiştirilmiş amino asit Fosfo grubunu hedefleyen spesifik antikorlar ile değerlendirilebilir. Bu tür antikorlar tüm fosho değiştirilmiş kalıntıları için ticari olarak mevcut değildir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onlarca yıl boyunca, çok sayıda sinyalizasyon yolları aydınlatılamamıştır ve hücre bölünmesi, farklılaşma, motilite, programlanmış hücre ölümü, bağışıklık ve Nörobiyoloji gibi önemli hücresel süreçlere katılımı gösterildi. Kinazlar, bu sinyal yollarında, aktivasyon veya inaktivasyonunu genellikle ince olarak düzenleyen ve dış uyaranlara1,2,3yanıt veren geçici çok yönlü kompleksleri bir parçası olarak önemli bir rol oynamaktadır. Mutasyon ve kinazlar disregülasyon genellikle insanlarda hastalıklara yol, ve bu nedenle son 40 yıl içinde en önemli uyuşturucu hedefleri biri haline gelmiştir4.

Bu bağlamda, upstream regülatörleri veya aşağı alt substratlar ile kinaz etkileşimi tespit etmek ve yeni ortakları tespit edebilmek için önemlidir. Yakınlık arıtma ve immünoprecipitation protein kompleksleri yalıtımı için çok güçlü tekniklerdir5. Yem protein veya kinaz belirli bir peptit dizisi ile kovalently peptit hedefleyen antikorlar ile birleştiğinde ticari boncuk kullanımına izin etiketli olabilir. Bu malzeme deneyler6,7,8yüksek bir yeniden üretilebilirliği izin verir. Endojen proteinleri de doğrudan yem protein hedefleyen antikorlar kullanarak immünoprecip, olabilir. Antikorlar protein A veya protein G agaroz boncuklar çapraz bağlantılı olabilir ya da sadece lysate eklemeden önce bu boncuklar ile inkübe. Liziz tamponları, etkileşimi kaybetmeden protein çözünmesine izin vermek ve protein bozulmasını önlemek için optimize edilmelidir. Bu yaklaşımın büyük bir dezavantajı, etkileşimin hücre lizisi üzerine algılanması; Bu nedenle, geçici veya zayıf etkileşimler, alt hücre bağlamı gerektiren ile birlikte cevapsız olabilir. Diğer teknikler, Proximity ligasyon tahlil (PLA)9, In vivo çapraz bağlama destekli benzeşme arıtma (xap)10, Bioluminescence rezonans enerji transferi (Bret) veya Förster rezonans enerjisi gibi doğrudan hücrede çalışmak için kullanılabilir Transfer (fret)11,12. Ayrıca, immünoplikoterapi, yüzey plasmon rezonans, Isothermal titrasyon kalorimetri veya Microscale Thermophoresis gibi fiziksel tekniklerin gerekli olduğu bağlayıcı termodinamik sabitler belirlemek için uygun değildir 13,14.

Kinaz aktivitesi birden fazla teknik kullanılarak değerlendirilebilir. Burada, fosho spesifik antikorlar üzerinde duruldu ve in vitro γ [32P] ATP (adenozin trifosfat) etiketleme. Phospho spesifik antikorlar bir protein içinde belirli bir kalıntı fosfat modifikasyonu hedef. Onlar Batı Blot veya ELISA kullanılabilir (enzim bağlantılı Immünosorbent assay) hücre lizis sonra, immünhistokimya, ve aynı zamanda akış sitometri veya immünofluorescence kullanarak bozulmamış hücreler üzerinde. Bunların dezavantajları, hedef proteinin mutasyona uğramış bir versiyonunu kullanarak değerlendirilebilen ve tüm proteinler için ticari olarak kullanılmaması açısından özgüllük eksikliği içerebilir. In vitro γ [32P] ATP etiketleme çok sağlam, iyi kurulmuş ve son derece hassas bir yöntemdir15. İmmunopmanite veya rekombinant proteinler kullanılabilir ve farklı substratlar test edilebilir. Bu yöntem nicel olduğu için ilaçların etkileri de değerlendirilebilir. Büyük dezavantajı, yaklaşım ile ilişkili radyoaktivite dikkatli işleme gerektirir. Floresan veya ışıldayan peptid substratların ölçümüne dayalı ve fosforilasyon üzerine değiştirilmiş floresan/ışıldayan özelliklerinden yararlanarak alternatif yöntemler de mümkündür. Bu tür yöntemler de, örneğin, hedef kinaz potansiyel inhibitörleri olabilir moleküllerin taramasında gerekli olan yüksek verim, izin verir. Gerçekten de, kinazlar ilaç şirketleri tarafından izlenen uyuşturucu hedefleri en büyük sınıflarından birini temsil16.

Bu çalışmada LIMK2-1 proteini (LIMK2-1 Lin11, Isle1, Mec3 kinase izoformu 2-1) üzerinde duruldu. LIMK2 kinaz proteini ilk olarak 199517' de tanımlanmıştır. LIMK2 üç izoformlarının alternatif birleştirme tarafından üretilir: LIMK2a, LIMK2b ve LIMK2-1. Şu anda, LIMK2-1 sadece tek bir çalışmada18mRNA düzeyinde açıklanmıştır. Burada, bu potansiyel yeni kinaz proteini moleküler düzeyde güçlü biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak karakterize ediyoruz. Öncelikle, LIMK2-1 ' in gerçekten sentezlenmiş olduğunu gösteriyoruz. Onun iki karşı benzer, LIMK2a ve LIMK2b, upstream kinaz ROCK ile etkileşime girer (Rho-ilişkili protein kinaz). Biz LIMK2-1 myelin temel protein (MBP) üzerinde bir kinaz aktivite olduğunu göstermek, ama cofilin değil, LIM kinazlar ve kurallı substrat.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. transfeksiyon için hücre hazırlığı

DIKKAT: hücre kültürünün tüm adımlarının özel bir laboratuvarda gerçekleştirilmesi gerekir ve hücreler sınıf 2 mikrobiyolojik kabine içinde manipüle edilir.

  1. Tohum HEK-293 (Insan embriyonik böbrek) Ø 10 cm plaklarda 10 mL DMEM (Dulbecco 'nun modifiye Eagles Medium) hücrelerinde% 10 fetal buzağı serumu ile desteklenmektedir. Kültür 3 ila 5 gün altında 5% CO2, at 37 °c, hücreler ulaşıncaya kadar ~ 90% Confluence.
  2. Plastik plakalara hücre yapışmasını artırmak için kollajen R ile Ø 10 cm tabakaları tedavi edin.
    1. Kollajen R bir çözeltisi 5 mL ekleyin, 200-Fold bir Ø 10 cm plaka fosfat tuzlu tampon (PBS) seyreltilmiş. Sıvıyı plakanın tüm yüzeyine bindirin.
    2. Biyogüvenlik kabininde en az 1 saat oda sıcaklığında inküye yapın.
    3. Kollajen çözümünü çıkarın ve atın. 5 mL PBS ekleyin, tüm plakanın yüzeyine yayın, çıkarın ve atın. Bu yıkama bir kez tekrarlayın.
    4. Ekle 8 DMEM mL 10% fetal buzağı serumu ile tamamlayıcı. Hazırlanmış plakaları Biyogüvenlik dolabı içinde saklayın.
  3. Biyogüvenlik kabine içinde adım 1,1 HEK-293 plakaları alın. Plakalardan orta çıkarın ve özel bir çamaşır suyu çöp içinde atın. Ek DMEM 2 mL ekleyin ve 1 mL mikropipet akışını kullanarak onları ayırmak için hücreleri temizlemek, köpük yapma önlemek için özen.
  4. Bir 15 mL tüp hücreleri toplayın ve 4 mL tamamlayıcı DMEM ekleyin. 3 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak 10 mL 'Lik pipet ile homojenleştirin.
  5. Bu hücre çözeltisi 2 mL alın ve adım 1.2.4 tamamlayıcı DMEM içeren kollajen tedavi plakaları ekleyin.
  6. % 5 CO2 ve 37 °c ' de kuluçvanda 24 saat büyütün. Transfeksiyon sırasında hücreler% 50-80 konfluent olmalıdır.

2. geçici transfeksiyonlar

  1. Plakalardan orta çıkarın, özel bir çamaşır suyu çöp atmak, ve taze tamamlayıcı DMEM 10 mL ekleyin. Transfeksiyon karışımı hazırlarken, plakaları 37 °C ' de kuluçlmaya geri koyun.
  2. 15 mL 'Lik bir tüpte, 10 mM Tris-HCl pH 7.5/1 mM EDTA 450 μL (Tris, Tris (hydroxymethyl) aminomethane ve etylenedinitrilotetraacetic asit için EDTA) çözeltisi ve 2,5 M CaCl2 çözeltisi 50 μL 'dir. İnversion ile karıştırın.
  3. Özel Plasmid ile dönüştürülmüş bir bakteri sıvı kültürü üzerinde bir midi preparat hazırlanan 10 μg plasmik DNA (Deokbüribonükleik asit) ekleyin. İnversion ile karıştırın.
  4. Bir girdap üzerinde pürüzsüz ajitasyon altında, eklemek 500 μL BES tamponlu tuz 2x konsantre (kompozisyon: BES, 10,7 g/L, NaCl, 16,0 g/L, na2HPO4, 0,27 g/l; BES, n-bis (2-hidroksiil) -2-aminoetesulfonik asit, N, N-bis (2-hidroksiilil) Taurin) yavaşça damla ile düşecek.
  5. Biyogüvenlik kabininde oda sıcaklığında en az 15 dakika (45 dk. kadar) inküye yapın. Girdap yapmayın, karıştırmayın! Borular çok dikkatle DNA ve kalsiyum fosfat arasındaki karmaşık oluşumu rahatsız etmek değil taşıyın.
  6. 2,1 adımından plakayı emniyet kabinine götürün. DNA kompleksini çok dikkatli bir şekilde ekleyin, damlaya göre bırakın, plakanın yüzeyinin her yerinden hücrelere yerleştirin.
  7. 37 °C ' de kuluçlatıcında 24 ila 72 saat boyunca Inküye yapın. Genellikle maksimum protein ifadesi 48 saat içinde ulaşılır.

3. Lysis

Not: buz üzerinde çalışma ve protein bozulması önlemek için soğuk tamponlar ile.

  1. Liziz tamponu hazırlayın: 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50 mM NaF, 10 mM Sodyum pirofosfat, 1 mM na3VO4, 20 mm p-nitrofenil fosfat, 20 mm β-gliserofosfat, 10 μg/ml aprotinin, 0,05 μg/ml okaidik asit , 1 μg/mL leupeptin ve 1 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluorid). Her nakil plakası için yaklaşık 4 mL liziz tamponu gereklidir.
  2. Taşıyıcı hücrelerden nakli olan plakaları çıkarın. Onları buz üzerine koy.
    Not: Bu adımda, "normal" bir tezgah üzerinde çalışmak mümkündür.
  3. Medyayı çıkarın ve özel bir çamaşır suyu çöp kutusuna atın.
  4. 3 mL soğuk PBS ile iki kez yıkayın: nakledilmiş hücreleri ayırma önlemek için damla tarafından plaka damlası tarafında 3 mL PBS ekleyin, plakanın yüzeyine yayılmış, PBS kaldırmak ve atmak; Bu adımı bir kez daha tekrarlayın. Sonunda, bir sonraki adım için lizis tampon seyreltme önlemek için plaka eğerek PBS geri kalanı dikkatle kaldırın.
  5. Nakledilmiş yıkanmış hücrelere 500 μL soğuk liziz tamponu ekleyin. Her şeyi plakanın yüzeyine yayın.
  6. Buz üzerinde 10 dakika boyunca inküye. Zaman zaman (en az iki kez), tampon plaka yüzeyinin her yerinde yeniden yayılır.
  7. Hücreleri hurda ve bir mikrosantrifüj tüp içinde toplamak.
  8. 10.000 x g 'de 4 °c ' de 10 dakika Santrifüjü.
  9. Yeni bir mikrosantrifüj tüpte süpernatant toplayın. Bu kesir lysate (tüm hücre ekstresi) karşılık gelir. Hücre membranı enkaz karşılık Pelet atın.
  10. Bu kesir bir kısım yeni bir mikrosantrifüj tüp toplamak (yaklaşık 50 μL). Bu kesir "Toplam kesir" veya "hücre lysate" veya "tüm hücre ekstresi" transfekte proteinler Batı Blot tarafından ifade edilir olup olmadığını analiz izin karşılık gelir.
    Not: Bu noktada, örnekler doğrudan Western blot analizleri için kullanılabilir. Laemmli tampon, 5 dakika boyunca 95 °C ' de ısıtılan, 5 dakika boyunca 10.000 x g 'de santrifüçlü ve uygun SDS sayfasına yüklenmiş olan örneğe eklenmelidir. Örnekler de-80 °C ' de depolanabilir.

4. immünopaperasyonu

  1. Hafifçe pelletini agaroz boncuk uygun antikor ile birleştiğinde: ha (insan grip hemagglutinin), bayrak, veya GFP (yeşil floresan protein) pürüzsüz inversion tarafından.
  2. Boncuk ucu girmesine izin vermek için bir mikropipet 200 μL ucunun sonunu kesin. Boncuk doğru hacim almak için emin olmak için ucu doyurmak için birkaç kez boncuk yukarı ve aşağı pipet.
  3. 40 bir mikrosantrifüj tüpünde boncuk μL alın.
  4. Ekle 500 μL TENET (30 mM Tris-HCl pH 7,5, 120 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100) tampon. İnversion ile karıştırın. 1.000 x g 'de 4 °c ' de 2 dakika Santrifüjü. Dikkatle süpernatant kaldırın ve atın. 500 μL TENET ekleyin. Dönen bir tekerlekten 4 °C ' de en az 1 saat boyunca inküye yapın.
    Not: TENET bu pre-inkübasyon adım özel olmayan etkileşimleri azaltmak ve böylece arka plan sinyalini azaltmak için izin verir.
  5. 500 μL lizis tampon ile boncukları iki kez yıkayın.
    1. 4 °C ' de 1.000 x g 'de Santrifüjü 2 dak.
    2. Dikkatle süpernatant tampon kaldırın ve atın.
      Not: Bu yıkama adımları sırasında boncuk Aspire değil dikkat edin.
    3. 500 μL lizis arabelleği ekleyin. Tüp ters çevirme ile homojenize.
    4. 4.5.1-4.5.3 arasındaki adımları yineleyin.
  6. 1.000 x g 'de 4 °c ' de 2 dakika Santrifüjü. Dikkatle süpernatant tampon kaldırmak ve atın.
  7. Geri dönen bir tekerlek üzerinde 4 °C ' de 2 ila 4 saat için 3,9 adımından lysate ile boncuklar inkübe.
  8. İmmünopmanite edilen boncukları yıkayın.
    Not: Bu noktada, immunoprecip, boncuk lizis tampon ile beş kez yıkanabilir ve sonra laemmli tampon ile elüe. Batı Blot analizlerinde veya-80 °C ' de depolanabilir. Alternatif olarak, boncuklar lizis tampon ile iki kez yıkanabilir ve sonra 3 kez kinaz tampon ile γ [32P] ATP etiketleme gerçekleştirmek için.

5. coimmunooprecipitation analizleri

  1. Imiz tamponu ile adım 4,7 immünoprecip, boncuk yıkayın.
    1. 4 °C ' de soğutulmuş santrifüjde 2 dk 1.000 x g 'de Santrifüjü.
    2. Dikkatle supernatant kaldırmak ve atın.
    3. 500 μL lizis arabelleği ekleyin. Tüp ters çevirme ile homojenize.
    4. Dört kez 5.1.1-5.1.3 arasındaki adımları yineleyin.
  2. Elüsyon
    1. 4 °C ' de soğutulmuş santrifüjde 2 dk 1.000 x g 'de Santrifüjü.
    2. Dikkatle supernatant kaldırmak ve atın. Boncuk aspirasyonu önlemek ve süpernatant atmak için bir Hamilton şırınga ile süpernatant son damla çıkarın.
    3. Eklemek 40 μL-in 4X Laemmli tampon (200 mM Tris/HCl pH 6,8, 4% SDS, 40% gliserol, 0,5 M β-mercaptoetanol, 0,02% bromophenol mavi). Hafifçe tüp dokunarak homojenize.
    4. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inküye yapın.
    5. 10.000 x g 'de oda sıcaklığında 5 dk Santrifüjü.
    6. Bir Hamilton şırınga ile, süpernatant çıkarın ve yeni bir mikrosantrifüj tüp içinde toplamak. Bu kesir,-80 °C ' de depolanabilir veya Batı Blot tarafından doğrudan analiz edilen "eluate" e karşılık gelir.

6. kinase tahlil

  1. Kinaz tamponunu hazırlayın: 50 mM HEPES-NaOH pH 7,5 (HEPES 4-(2-hidroksiilil) -1-piperazineethanesulfonik asit), 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2,5mm MNCL2, 50 mm NAF, 1 mm na3VO4, 20 mm β-glisofosfat, 1 μg/ml leupeptin ve 1 mM PMSF. Yaklaşık 2 ml kinaz tampon her immünopresipitasyon durumu için gereklidir.
  2. 500 μL lizis tampon ile iki kez adım 4,7 immunoprecip, boncuk yıkayın.
    1. 4 °C ' de soğutulmuş santrifüjde 2 dk 1.000 x g 'de Santrifüjü.
    2. Dikkatle supernatant kaldırmak ve atmak. 500 μL lizis arabelleği ekleyin. İnversion tarafından homojenize.
    3. Adım 6.2.1 ve 6.2.2 yineleyin.
  3. 500 μL kinaz tamponu ile üç kez immünopmanite boncukları yıkayın.
    1. 4 °C ' de soğutulmuş santrifüjde 2 dk 1.000 x g 'de Santrifüjü.
    2. Dikkatle supernatant kaldırmak ve atmak. 500 μL kinaz arabelleği ekleyin. İnversion tarafından homojenize.
    3. 6.3.1 ve 6.3.2 iki kez adımları yineleyin.
  4. 4 °C ' de soğutulmuş santrifüjde 2 dk 1.000 x g 'de Santrifüjü.
  5. Dikkatle supernatant kaldırmak ve atmak. Boncuk aspirasyonu önlemek ve süpernatant atmak için bir Hamilton şırınga ile süpernatant son damla çıkarın.
  6. İmmunoprecip, boncuklar için 40 μL kinaz tampon ekleyin. Hafifçe tüp dokunarak boncuk resuspend.
  7. İçin mix hazırlayın γ [32P] ATP etiketleme (son hacim 22,5 μL, kinaz tampon ile komple) güvenli bir kilit-tüp.
    1. 22,5 μL son hacmine ulaşmak için gerekli kinaz tampon hacmini ekleyin.
    2. Bir mikropipet 20 μL ucunun sonunu kesin. Birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleme tarafından adım 6,6 immunoprecip, boncuk resuspend. Bu boncukların 10 μL ' sini güvenli kilit tüpüne toplayın.
    3. 50 mM final konsantrasyonuna ulaşmak için 10 μM stokta ATP ekleyin. Tedavi numunesi sayısına göre, kinaz tamponunun ATP stok çözeltisi bir seyreltme hacmi doğru olduğundan emin olmak için, 1 ila 2 μL pipet izin önerilir.
    4. 2,5 μg substrat (cofilin veya myelin temel protein, MBP mevcut çalışma durumunda) ekleyin.
  8. Reaksiyonu başlatmak için 5 Μcı γ [32P] ATP (3.000 ci/mmol) ekleyin. Yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme ile karıştırın.
    DIKKAT: Bu noktadan Itibaren, çalışma, dikkatli önlemler, özel korumaları ve uygun kontroller (radyoaktif kalkanları, Geiger sayacı, spesifik atık toplama, kişisel meme ile radyoaktivite manipülasyonları için adanmış bir güvenlik yerinde yapılmalıdır ve parmak rozetleri radyoaktif pozlama, filtre ipuçları) algılamak için.
  9. 30 °C ' de 20 dakika boyunca inkübe.
  10. 6 μL 5x Laemmli tampon ile reaksiyonu durdurun.
  11. 95 ° C 'de ısı 5 dk.
  12. Oda sıcaklığında 5 dakika 10.000 x g Santrifüjü.
  13. SDS SAYFASıNA yükleyin. Geçiş işlemine devam edin.
    Not: ücretsiz γ [32P] ATP ön hattı göç tankının kontaminasyonunu önlemek için jel çıkmaması dikkat edin.
  14. Jeli oda sıcaklığında lekeleyin.
    1. Jeli cam plakalardan çıkarın.
    2. Oda sıcaklığında suda üç banyo ile devam edin.
    3. Oda sıcaklığında Coomassie mavi ile jel gece leke.
    4. Oda sıcaklığında su ile çeşitli yıkama banyoları ile jel destain.
  15. Jel plastik wrap ile sarın.
  16. Bir gece veya daha fazla bir fosforör ekranında açığa.
  17. Etiketli bantları algılamak için bir fosforör üzerinde ekranı okuyun.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LIMK2-1 protein sentezlenmiş
LIMK2-1 databanks belirtilmiştir, ancak şimdiye kadar sadece bir kağıt onun mRNA18varlığını göstermiştir. İki homolog ile karşılaştırıldığında, LIMK2a ve LIMK2b, LIMK2-1 protein fosfataz 1 Inhibitör etki alanı (PP1i) olarak tanımlanan ekstra bir C-Terminal etki alanı vardır. Biz bu alan bir peptit hedefleyen bir antikor tasarladık, amino asitler 671-684 (Şekil 1a).
İnsan proteini veri...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, moleküler düzeyde yeni bir protein olan LIMK2-1 ' e göre, dizisine ve homologlarında, LIMK2a ve LIMK2b20' ye dayanan bir kinaz olduğuna inanılan sağlam biyokimyasal araçlar kullandık.

Öncelikle, biz belirli bir antikor ile Batı Blot analizi kullanarak protein düzeyinde LIMK2-1 varlığını göstermiştir. Bunun ardından, LIMK2-1 homologlarını LIMK2a ve LIMK2b düzenleyen bilinen upstream kinaz rock1 ile etkileşimi değerlendirildi. Son olarak, LIMK2-1 ' i s vitro γ [

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma la Ligue contre le Cancer, l 'Association Neurofibromatoses et Recklinghausen ve La Région Centre Val de Loire tarafından destekleniyordu. Akış sitometri verileri için Aurélie Cosson ve Déborah Casas ve el yazması tam redaksiyon için keyron Hickman-Lewis çok teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Western Blot içinantikor anti-aktinSigma-AldrichA1978
Blotantikor anti-c-MycInvitrogenMA1-21316
Antikoru anti-kofilinHücre sinyalizasyon Teknolojisi3312/5175Western Blot
Antikoru anti-GFPiçin Santa Cruzsc-9996Western Blot
Antikoru anti-HARoche için Western Blot
Antikoru anti-fosfo-kofilinWestern Blot
Antikoru Anti-PP1iEurogenteciçin bu çalışma için tasarlanmışWestern Blot
AprotininEuromedexA-162Blizis tamponu
için ATPInvitrogenPV3227için γ[ 32P] etiketleme
γ[ 32P] ATPPerkin ElmerNEG502Aiçin γ[ 32P] etiketleme
BES tamponlu salinTransfeksiyon içinSigma-Aldrich14280
β-gliserofosfatve kinaz tamponu içinSigma-AldrichG9422
β-Laemmli BSASigma-AldrichM3148
bloke etmek
için Sigma-Aldrich A3059Laemmli CaClSigma-AldrichB0126
2< / sub>Sigma-AldrichC3881transfeksiyon
içinSantrifüj Sigma111-541
Kollajen RPan BiotechP06-20166
PP1i antikor özgüllüğü
için siRNA Ambion AM4611Coomassie PageBlue Protein Boyama ÇözeltisiThermo-Fisher24620jel boyama için
EDTALizis tamponu içinSigma-Aldrich3690
Western Blot içinElektroforez ÜnitesiBioradMini-Protean
İmmünopresipitasyon içinkırmızı anti-HA afinite jeliSigma-AldrichE6779
GeneSys yazılımıOzymeWestern Blot satın alımı için
Western Blot miktar tayini içinGeneTolls yazılımıOzyme
, GFP-tuzak boncukları,İmmünopresipitasyon içinChromtek
transfer tamponu içinGlisinEuromedex26-128-6405
GST-kofilin,Upstate Cell sinyalizasyonuγ için 12-556;[ 32P] etiketleme
Hamilton şırınga 100 mLHamilton710boncuklardan süpernatanı aspire etmeden dikkatlice çıkarmak için
HEPESKinaz tamponu içinSigma-AldrichH3375
ImageQuant TL yazılımı Radyoaktiviteedinimi ve miktar tayini içinGE Healthcare
PP1i için LIMK2 siRNAAmbions8191 antikor özgüllüğü
LeupeptinSigma-AldrichSP-04-2217lizis ve kinaz tamponu için
MBPUpstate Cell sinyalizasyonu13-173γ[ 32< / sup>P] etiketleme
MgCl 2< / sub>Sigma-AldrichM8266kinaz tamponu
MnCl için 2< / sub>Sigma-Aldrich244589kinaz tamponu
için NaClEuromedex1112ve kinaz
tamponu içinNaFSigma-AldrichS-1504
Okaidic lizistamponu içinEuromedex0-2220
PMSFLizis ve kinaz tamponu içinSigma-Aldrich78830
lizis tamponu içinp-nitrofenilfosfatEuromedex1026
PVDF membranı Western Blot için Immobillon-PMerck-MilliporeIPVH00010 gözenek boyutu 0,45 mm
döner tekerlekLabinco
Kinaz testi içingüvenli kilit eppendorfEppendorf0030120.086
Laemmli ve migrasyon tamponu içinSDSSigma-Aldrich5030
Sodyum ortovanadatLC LaboratuvarlarıLizis ve kinaz tamponu içinS8507
Lizis tamponu içinsodyum pirofosfatFluka71501
Süper Sinyal Batı DuraProtein BiyolojisiBlot için34075
Syngene PxiOzymeWestern Blot
Doku ekstraktları için

 		Biyozincir

 		P1234035 Beyin
P12345152 Akciğer
P1234149 Karaciğer
P1234188 Pankreas
P1234260 Western		Blot analizi için testis

 
TrisEuromedex26-128-3094 için
BioradMini-Trans-BlotÜnitesi
Tween-20Sigma-AldrichP7949bloke etmek için
Typhoon FLA9500GE Healthcareotoradyografi okumak için
Typhoon TrioAmersham Bioscienceotoradyografi okumak için
Western Blot içinWhatman kağıdıGE Healthcare3030-672
Western içinWestern Blot için Uygulamalı Bilim 11687423001 Lizis için merkaptoetanol Tamponu için Bromofenol Blue EZview , , , , lizis asit Boncuk inkübasyonu içinWestern Western Blot Transfer Lizis tamponu için tamponu

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. Evolution of protein kinase signaling from yeast to man. Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).
  2. Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. 298, Science. New York, N.Y. 1912-1934 (2002).
  3. Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling. Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).
  4. Bhullar, K. S., et al. Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions. Molecular Cancer. 17, 48(2018).
  5. Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, Clifton, N.J. 349-364 (2008).
  6. Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., Pedersen, J. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins. Protein Expression and Purification. 48, 1-13 (2006).
  7. Wood, D. W. New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification. Current Opinion in Structural Biology. 26, 54-61 (2014).
  8. Young, C. L., Britton, Z. T., Robinson, A. S. Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications. Biotechnology Journal. 7, 620-634 (2012).
  9. Greenwood, C., et al. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
  10. Wang, X., Huang, L. Dissecting Dynamic and Heterogeneous Proteasome Complexes Using In vivo Cross-Linking-Assisted Affinity Purification and Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1844, Clifton, N.J. 401-410 (2018).
  11. Raykova, D., et al. Let There Be Light! Proteomes. 4, (2016).
  12. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7, 401-409 (2010).
  13. Podobnik, M., et al. How to Study Protein-protein Interactions. Acta Chimica Slovenica. 63, 424-439 (2016).
  14. Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648(2014).
  15. Peck, S. C. Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 45, 512-522 (2006).
  16. Jia, Y., Quinn, C. M., Kwak, S., Talanian, R. V. Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format. Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).
  17. Okano, I., et al. Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs. The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).
  18. Croft, D. R., et al. p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton. Cell Research. 21, 666-682 (2011).
  19. Tastet, J., et al. LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability. Neuroscience. 399, 199-210 (2019).
  20. Vallee, B., et al. LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b. The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).
  21. Lee, Y. C., et al. Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation. Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Kinase ProteinImmunoprecipitationWestern BlotCo immunoprecipitationKinase Activity AssaySDS PAGEGamma P32 ATP LabelingLIMK2 1ROCK InteractionCell Culture

Related Articles