Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Summary

Biz güçlü biyokimyasal yaklaşımlar kullanarak yeni bir kinaz protein karakterize: farklı hücre hatları ve dokularda adanmış spesifik antikor ile Batı Blot analizi, coimmunoprecipitation deneyler ile etkileşimler, Batı tarafından tespit kinaz aktivite Fosho spesifik antikor ve γ [³²P] ATP etiketleme kullanarak Blot.

Abstract

Geniş tüm genom sıralamasının birçok potansiyel protein sağlayan pek çok açık okuma çerçeveleri (ORFs) belirledi. Bu proteinlerin hücre için önemli rolleri olabilir ve yeni hücresel süreçleri çözebilir. Proteinler arasında, kinazlar, hücre sinyalizasyon yollarına ait olduğu ve hücre büyümesi, bölünme, farklılaşma, motilite ve ölüm gibi hücrenin kaderi için önemli olan birçok işlemi açma veya kapama yeteneğine sahip olduğu için önemli aktörlerdir.

Bu çalışmada, yeni bir potansiyel kinaz proteini, LIMK2-1 üzerinde duruldu. Biz Batı Blot tarafından belirli bir antikor kullanarak varlığını göstermiştir. Biz koimmünoprecipitation deneyler kullanarak upstream düzenleyen protein ile etkileşimi değerlendirdi. Coimmünoprecipitation iki hedef proteinleri arasındaki etkileşimi algılamak mümkün olan çok güçlü bir tekniktir. Ayrıca bir yem proteini yeni ortakları algılamak için kullanılabilir. Yem protein ya kendi sırasına yönelik bir etiket veya özellikle onu hedefleyen bir antikor yoluyla arındırılmış olabilir. Bu protein kompleksleri daha sonra SDS-PAGE (sodyum Dodecyl sülfat Poliakrilamid jel) ile ayrılabilir ve kütle spektrometresi kullanılarak tespit edilebilir. İmmunoprecip, LIMK2-1 de onun kinaz aktivitesini test etmek için kullanıldı in vitro tarafından γ [³²P] ATP etiketleme. Bu iyi kurulan tahlil birçok farklı substratlar kullanabilirsiniz, ve yem mutasyonlu sürümleri belirli kalıntıları rolünü değerlendirmek için kullanılabilir. Bu tekniğin hem son derece hassas hem de nicel olduğundan farmakolojik ajanların etkileri de değerlendirilebilir. Yine de, radyoaktivite işleme özellikle dikkatli gerektirir. Kinaz aktivitesi de değiştirilmiş amino asit Fosfo grubunu hedefleyen spesifik antikorlar ile değerlendirilebilir. Bu tür antikorlar tüm fosho değiştirilmiş kalıntıları için ticari olarak mevcut değildir.

Introduction

Onlarca yıl boyunca, çok sayıda sinyalizasyon yolları aydınlatılamamıştır ve hücre bölünmesi, farklılaşma, motilite, programlanmış hücre ölümü, bağışıklık ve Nörobiyoloji gibi önemli hücresel süreçlere katılımı gösterildi. Kinazlar, bu sinyal yollarında, aktivasyon veya inaktivasyonunu genellikle ince olarak düzenleyen ve dış uyaranlara^1,2,3yanıt veren geçici çok yönlü kompleksleri bir parçası olarak önemli bir rol oynamaktadır. Mutasyon ve kinazlar disregülasyon genellikle insanlarda hastalıklara yol, ve bu nedenle son 40 yıl içinde en önemli uyuşturucu hedefleri biri haline gelmiştir⁴.

Bu bağlamda, upstream regülatörleri veya aşağı alt substratlar ile kinaz etkileşimi tespit etmek ve yeni ortakları tespit edebilmek için önemlidir. Yakınlık arıtma ve immünoprecipitation protein kompleksleri yalıtımı için çok güçlü tekniklerdir⁵. Yem protein veya kinaz belirli bir peptit dizisi ile kovalently peptit hedefleyen antikorlar ile birleştiğinde ticari boncuk kullanımına izin etiketli olabilir. Bu malzeme deneyler^6,7,8yüksek bir yeniden üretilebilirliği izin verir. Endojen proteinleri de doğrudan yem protein hedefleyen antikorlar kullanarak immünoprecip, olabilir. Antikorlar protein A veya protein G agaroz boncuklar çapraz bağlantılı olabilir ya da sadece lysate eklemeden önce bu boncuklar ile inkübe. Liziz tamponları, etkileşimi kaybetmeden protein çözünmesine izin vermek ve protein bozulmasını önlemek için optimize edilmelidir. Bu yaklaşımın büyük bir dezavantajı, etkileşimin hücre lizisi üzerine algılanması; Bu nedenle, geçici veya zayıf etkileşimler, alt hücre bağlamı gerektiren ile birlikte cevapsız olabilir. Diğer teknikler, Proximity ligasyon tahlil (PLA)⁹, In vivo çapraz bağlama destekli benzeşme arıtma (xap)¹⁰, Bioluminescence rezonans enerji transferi (Bret) veya Förster rezonans enerjisi gibi doğrudan hücrede çalışmak için kullanılabilir Transfer (fret)^11,12. Ayrıca, immünoplikoterapi, yüzey plasmon rezonans, Isothermal titrasyon kalorimetri veya Microscale Thermophoresis gibi fiziksel tekniklerin gerekli ^{olduğu bağlayıcı termodinamik sabitler belirlemek için uygun değildir 13,14}.

Kinaz aktivitesi birden fazla teknik kullanılarak değerlendirilebilir. Burada, fosho spesifik antikorlar üzerinde duruldu ve in vitro γ [³²P] ATP (adenozin trifosfat) etiketleme. Phospho spesifik antikorlar bir protein içinde belirli bir kalıntı fosfat modifikasyonu hedef. Onlar Batı Blot veya ELISA kullanılabilir (enzim bağlantılı Immünosorbent assay) hücre lizis sonra, immünhistokimya, ve aynı zamanda akış sitometri veya immünofluorescence kullanarak bozulmamış hücreler üzerinde. Bunların dezavantajları, hedef proteinin mutasyona uğramış bir versiyonunu kullanarak değerlendirilebilen ve tüm proteinler için ticari olarak kullanılmaması açısından özgüllük eksikliği içerebilir. In vitro γ [³²P] ATP etiketleme çok sağlam, iyi kurulmuş ve son derece hassas bir yöntemdir¹⁵. İmmunopmanite veya rekombinant proteinler kullanılabilir ve farklı substratlar test edilebilir. Bu yöntem nicel olduğu için ilaçların etkileri de değerlendirilebilir. Büyük dezavantajı, yaklaşım ile ilişkili radyoaktivite dikkatli işleme gerektirir. Floresan veya ışıldayan peptid substratların ölçümüne dayalı ve fosforilasyon üzerine değiştirilmiş floresan/ışıldayan özelliklerinden yararlanarak alternatif yöntemler de mümkündür. Bu tür yöntemler de, örneğin, hedef kinaz potansiyel inhibitörleri olabilir moleküllerin taramasında gerekli olan yüksek verim, izin verir. Gerçekten de, kinazlar ilaç şirketleri tarafından izlenen uyuşturucu hedefleri en büyük sınıflarından birini temsil¹⁶.

Bu çalışmada LIMK2-1 proteini (LIMK2-1 Lin11, Isle1, Mec3 kinase izoformu 2-1) üzerinde duruldu. LIMK2 kinaz proteini ilk olarak 1995¹⁷‘ de tanımlanmıştır. LIMK2 üç izoformlarının alternatif birleştirme tarafından üretilir: LIMK2a, LIMK2b ve LIMK2-1. Şu anda, LIMK2-1 sadece tek bir çalışmada¹⁸mRNA düzeyinde açıklanmıştır. Burada, bu potansiyel yeni kinaz proteini moleküler düzeyde güçlü biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak karakterize ediyoruz. Öncelikle, LIMK2-1 ‘ in gerçekten sentezlenmiş olduğunu gösteriyoruz. Onun iki karşı benzer, LIMK2a ve LIMK2b, upstream kinaz ROCK ile etkileşime girer (Rho-ilişkili protein kinaz). Biz LIMK2-1 myelin temel protein (MBP) üzerinde bir kinaz aktivite olduğunu göstermek, ama cofilin değil, LIM kinazlar ve kurallı substrat.

Protocol

1. transfeksiyon için hücre hazırlığı

DIKKAT: hücre kültürünün tüm adımlarının özel bir laboratuvarda gerçekleştirilmesi gerekir ve hücreler sınıf 2 mikrobiyolojik kabine içinde manipüle edilir.

1. Tohum HEK-293 (Insan embriyonik böbrek) Ø 10 cm plaklarda 10 mL DMEM (Dulbecco ‘nun modifiye Eagles Medium) hücrelerinde% 10 fetal buzağı serumu ile desteklenmektedir. Kültür 3 ila 5 gün altında 5% CO₂, at 37 °c, hücreler ulaşıncaya kadar ~ 90% Confluence.
2. Plastik plakalara hücre yapışmasını artırmak için kollajen R ile Ø 10 cm tabakaları tedavi edin.
   1. Kollajen R bir çözeltisi 5 mL ekleyin, 200-Fold bir Ø 10 cm plaka fosfat tuzlu tampon (PBS) seyreltilmiş. Sıvıyı plakanın tüm yüzeyine bindirin.
   2. Biyogüvenlik kabininde en az 1 saat oda sıcaklığında inküye yapın.
   3. Kollajen çözümünü çıkarın ve atın. 5 mL PBS ekleyin, tüm plakanın yüzeyine yayın, çıkarın ve atın. Bu yıkama bir kez tekrarlayın.
   4. Ekle 8 DMEM mL 10% fetal buzağı serumu ile tamamlayıcı. Hazırlanmış plakaları Biyogüvenlik dolabı içinde saklayın.
3. Biyogüvenlik kabine içinde adım 1,1 HEK-293 plakaları alın. Plakalardan orta çıkarın ve özel bir çamaşır suyu çöp içinde atın. Ek DMEM 2 mL ekleyin ve 1 mL mikropipet akışını kullanarak onları ayırmak için hücreleri temizlemek, köpük yapma önlemek için özen.
4. Bir 15 mL tüp hücreleri toplayın ve 4 mL tamamlayıcı DMEM ekleyin. 3 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak 10 mL ‘Lik pipet ile homojenleştirin.
5. Bu hücre çözeltisi 2 mL alın ve adım 1.2.4 tamamlayıcı DMEM içeren kollajen tedavi plakaları ekleyin.
6. % 5 CO₂ ve 37 °c ‘ de kuluçvanda 24 saat büyütün. Transfeksiyon sırasında hücreler% 50-80 konfluent olmalıdır.

2. geçici transfeksiyonlar

1. Plakalardan orta çıkarın, özel bir çamaşır suyu çöp atmak, ve taze tamamlayıcı DMEM 10 mL ekleyin. Transfeksiyon karışımı hazırlarken, plakaları 37 °C ‘ de kuluçlmaya geri koyun.
2. 15 mL ‘Lik bir tüpte, 10 mM Tris-HCl pH 7.5/1 mM EDTA 450 μL (Tris, Tris (hydroxymethyl) aminomethane ve etylenedinitrilotetraacetic asit için EDTA) çözeltisi ve 2,5 M CaCl₂ çözeltisi 50 μL ‘dir. İnversion ile karıştırın.
3. Özel Plasmid ile dönüştürülmüş bir bakteri sıvı kültürü üzerinde bir midi preparat hazırlanan 10 μg plasmik DNA (Deokbüribonükleik asit) ekleyin. İnversion ile karıştırın.
4. Bir girdap üzerinde pürüzsüz ajitasyon altında, eklemek 500 μL BES tamponlu tuz 2x konsantre (kompozisyon: BES, 10,7 g/L, NaCl, 16,0 g/L, na₂HPO₄, 0,27 g/l; BES, n-bis (2-hidroksiil) -2-aminoetesulfonik asit, N, N-bis (2-hidroksiilil) Taurin) yavaşça damla ile düşecek.
5. Biyogüvenlik kabininde oda sıcaklığında en az 15 dakika (45 dk. kadar) inküye yapın. Girdap yapmayın, karıştırmayın! Borular çok dikkatle DNA ve kalsiyum fosfat arasındaki karmaşık oluşumu rahatsız etmek değil taşıyın.
6. 2,1 adımından plakayı emniyet kabinine götürün. DNA kompleksini çok dikkatli bir şekilde ekleyin, damlaya göre bırakın, plakanın yüzeyinin her yerinden hücrelere yerleştirin.
7. 37 °C ‘ de kuluçlatıcında 24 ila 72 saat boyunca Inküye yapın. Genellikle maksimum protein ifadesi 48 saat içinde ulaşılır.

3. Lysis

Not: buz üzerinde çalışma ve protein bozulması önlemek için soğuk tamponlar ile.

1. Liziz tamponu hazırlayın: 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50 mM NaF, 10 mM Sodyum pirofosfat, 1 mM na₃VO₄, 20 mm p-nitrofenil fosfat, 20 mm β-gliserofosfat, 10 μg/ml aprotinin, 0,05 μg/ml okaidik asit , 1 μg/mL leupeptin ve 1 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluorid). Her nakil plakası için yaklaşık 4 mL liziz tamponu gereklidir.
2. Taşıyıcı hücrelerden nakli olan plakaları çıkarın. Onları buz üzerine koy.
   Not: Bu adımda, “normal” bir tezgah üzerinde çalışmak mümkündür.
3. Medyayı çıkarın ve özel bir çamaşır suyu çöp kutusuna atın.
4. 3 mL soğuk PBS ile iki kez yıkayın: nakledilmiş hücreleri ayırma önlemek için damla tarafından plaka damlası tarafında 3 mL PBS ekleyin, plakanın yüzeyine yayılmış, PBS kaldırmak ve atmak; Bu adımı bir kez daha tekrarlayın. Sonunda, bir sonraki adım için lizis tampon seyreltme önlemek için plaka eğerek PBS geri kalanı dikkatle kaldırın.
5. Nakledilmiş yıkanmış hücrelere 500 μL soğuk liziz tamponu ekleyin. Her şeyi plakanın yüzeyine yayın.
6. Buz üzerinde 10 dakika boyunca inküye. Zaman zaman (en az iki kez), tampon plaka yüzeyinin her yerinde yeniden yayılır.
7. Hücreleri hurda ve bir mikrosantrifüj tüp içinde toplamak.
8. 10.000 x g ‘de 4 °c ‘ de 10 dakika Santrifüjü.
9. Yeni bir mikrosantrifüj tüpte süpernatant toplayın. Bu kesir lysate (tüm hücre ekstresi) karşılık gelir. Hücre membranı enkaz karşılık Pelet atın.
10. Bu kesir bir kısım yeni bir mikrosantrifüj tüp toplamak (yaklaşık 50 μL). Bu kesir “Toplam kesir” veya “hücre lysate” veya “tüm hücre ekstresi” transfekte proteinler Batı Blot tarafından ifade edilir olup olmadığını analiz izin karşılık gelir.
    Not: Bu noktada, örnekler doğrudan Western blot analizleri için kullanılabilir. Laemmli tampon, 5 dakika boyunca 95 °C ‘ de ısıtılan, 5 dakika boyunca 10.000 x g ‘de santrifüçlü ve uygun SDS sayfasına yüklenmiş olan örneğe eklenmelidir. Örnekler de-80 °C ‘ de depolanabilir.

4. immünopaperasyonu

1. Hafifçe pelletini agaroz boncuk uygun antikor ile birleştiğinde: ha (insan grip hemagglutinin), bayrak, veya GFP (yeşil floresan protein) pürüzsüz inversion tarafından.
2. Boncuk ucu girmesine izin vermek için bir mikropipet 200 μL ucunun sonunu kesin. Boncuk doğru hacim almak için emin olmak için ucu doyurmak için birkaç kez boncuk yukarı ve aşağı pipet.
3. 40 bir mikrosantrifüj tüpünde boncuk μL alın.
4. Ekle 500 μL TENET (30 mM Tris-HCl pH 7,5, 120 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100) tampon. İnversion ile karıştırın. 1.000 x g ‘de 4 °c ‘ de 2 dakika Santrifüjü. Dikkatle süpernatant kaldırın ve atın. 500 μL TENET ekleyin. Dönen bir tekerlekten 4 °C ‘ de en az 1 saat boyunca inküye yapın.
   Not: TENET bu pre-inkübasyon adım özel olmayan etkileşimleri azaltmak ve böylece arka plan sinyalini azaltmak için izin verir.
5. 500 μL lizis tampon ile boncukları iki kez yıkayın.
   1. 4 °C ‘ de 1.000 x g ‘de Santrifüjü 2 dak.
   2. Dikkatle süpernatant tampon kaldırın ve atın.
      Not: Bu yıkama adımları sırasında boncuk Aspire değil dikkat edin.
   3. 500 μL lizis arabelleği ekleyin. Tüp ters çevirme ile homojenize.
   4. 4.5.1-4.5.3 arasındaki adımları yineleyin.
6. 1.000 x g ‘de 4 °c ‘ de 2 dakika Santrifüjü. Dikkatle süpernatant tampon kaldırmak ve atın.
7. Geri dönen bir tekerlek üzerinde 4 °C ‘ de 2 ila 4 saat için 3,9 adımından lysate ile boncuklar inkübe.
8. İmmünopmanite edilen boncukları yıkayın.
   Not: Bu noktada, immunoprecip, boncuk lizis tampon ile beş kez yıkanabilir ve sonra laemmli tampon ile elüe. Batı Blot analizlerinde veya-80 °C ‘ de depolanabilir. Alternatif olarak, boncuklar lizis tampon ile iki kez yıkanabilir ve sonra 3 kez kinaz tampon ile γ [³²P] ATP etiketleme gerçekleştirmek için.

5. coimmunooprecipitation analizleri

1. Imiz tamponu ile adım 4,7 immünoprecip, boncuk yıkayın.
   1. 4 °C ‘ de soğutulmuş santrifüjde 2 dk 1.000 x g ‘de Santrifüjü.
   2. Dikkatle supernatant kaldırmak ve atın.
   3. 500 μL lizis arabelleği ekleyin. Tüp ters çevirme ile homojenize.
   4. Dört kez 5.1.1-5.1.3 arasındaki adımları yineleyin.
2. Elüsyon
   1. 4 °C ‘ de soğutulmuş santrifüjde 2 dk 1.000 x g ‘de Santrifüjü.
   2. Dikkatle supernatant kaldırmak ve atın. Boncuk aspirasyonu önlemek ve süpernatant atmak için bir Hamilton şırınga ile süpernatant son damla çıkarın.
   3. Eklemek 40 μL-in 4X Laemmli tampon (200 mM Tris/HCl pH 6,8, 4% SDS, 40% gliserol, 0,5 M β-mercaptoetanol, 0,02% bromophenol mavi). Hafifçe tüp dokunarak homojenize.
   4. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inküye yapın.
   5. 10.000 x g ‘de oda sıcaklığında 5 dk Santrifüjü.
   6. Bir Hamilton şırınga ile, süpernatant çıkarın ve yeni bir mikrosantrifüj tüp içinde toplamak. Bu kesir,-80 °C ‘ de depolanabilir veya Batı Blot tarafından doğrudan analiz edilen “eluate” e karşılık gelir.

6. kinase tahlil

1. Kinaz tamponunu hazırlayın: 50 mM HEPES-NaOH pH 7,5 (HEPES 4-(2-hidroksiilil) -1-piperazineethanesulfonik asit), 150 mM NaCl, 5 mM MgCl_2,5mm MNCL₂, 50 mm NAF, 1 mm na₃VO₄, 20 mm β-glisofosfat, 1 μg/ml leupeptin ve 1 mM PMSF. Yaklaşık 2 ml kinaz tampon her immünopresipitasyon durumu için gereklidir.
2. 500 μL lizis tampon ile iki kez adım 4,7 immunoprecip, boncuk yıkayın.
   1. 4 °C ‘ de soğutulmuş santrifüjde 2 dk 1.000 x g ‘de Santrifüjü.
   2. Dikkatle supernatant kaldırmak ve atmak. 500 μL lizis arabelleği ekleyin. İnversion tarafından homojenize.
   3. Adım 6.2.1 ve 6.2.2 yineleyin.
3. 500 μL kinaz tamponu ile üç kez immünopmanite boncukları yıkayın.
   1. 4 °C ‘ de soğutulmuş santrifüjde 2 dk 1.000 x g ‘de Santrifüjü.
   2. Dikkatle supernatant kaldırmak ve atmak. 500 μL kinaz arabelleği ekleyin. İnversion tarafından homojenize.
   3. 6.3.1 ve 6.3.2 iki kez adımları yineleyin.
4. 4 °C ‘ de soğutulmuş santrifüjde 2 dk 1.000 x g ‘de Santrifüjü.
5. Dikkatle supernatant kaldırmak ve atmak. Boncuk aspirasyonu önlemek ve süpernatant atmak için bir Hamilton şırınga ile süpernatant son damla çıkarın.
6. İmmunoprecip, boncuklar için 40 μL kinaz tampon ekleyin. Hafifçe tüp dokunarak boncuk resuspend.
7. İçin mix hazırlayın γ [³²P] ATP etiketleme (son hacim 22,5 μL, kinaz tampon ile komple) güvenli bir kilit-tüp.
   1. 22,5 μL son hacmine ulaşmak için gerekli kinaz tampon hacmini ekleyin.
   2. Bir mikropipet 20 μL ucunun sonunu kesin. Birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleme tarafından adım 6,6 immunoprecip, boncuk resuspend. Bu boncukların 10 μL ‘ sini güvenli kilit tüpüne toplayın.
   3. 50 mM final konsantrasyonuna ulaşmak için 10 μM stokta ATP ekleyin. Tedavi numunesi sayısına göre, kinaz tamponunun ATP stok çözeltisi bir seyreltme hacmi doğru olduğundan emin olmak için, 1 ila 2 μL pipet izin önerilir.
   4. 2,5 μg substrat (cofilin veya myelin temel protein, MBP mevcut çalışma durumunda) ekleyin.
8. Reaksiyonu başlatmak için 5 Μcı γ [³²P] ATP (3.000 ci/mmol) ekleyin. Yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme ile karıştırın.
   DIKKAT: Bu noktadan Itibaren, çalışma, dikkatli önlemler, özel korumaları ve uygun kontroller (radyoaktif kalkanları, Geiger sayacı, spesifik atık toplama, kişisel meme ile radyoaktivite manipülasyonları için adanmış bir güvenlik yerinde yapılmalıdır ve parmak rozetleri radyoaktif pozlama, filtre ipuçları) algılamak için.
9. 30 °C ‘ de 20 dakika boyunca inkübe.
10. 6 μL 5x Laemmli tampon ile reaksiyonu durdurun.
11. 95 ° C ‘de ısı 5 dk.
12. Oda sıcaklığında 5 dakika 10.000 x g Santrifüjü.
13. SDS SAYFASıNA yükleyin. Geçiş işlemine devam edin.
    Not: ücretsiz γ [³²P] ATP ön hattı göç tankının kontaminasyonunu önlemek için jel çıkmaması dikkat edin.
14. Jeli oda sıcaklığında lekeleyin.
    1. Jeli cam plakalardan çıkarın.
    2. Oda sıcaklığında suda üç banyo ile devam edin.
    3. Oda sıcaklığında Coomassie mavi ile jel gece leke.
    4. Oda sıcaklığında su ile çeşitli yıkama banyoları ile jel destain.
15. Jel plastik wrap ile sarın.
16. Bir gece veya daha fazla bir fosforör ekranında açığa.
17. Etiketli bantları algılamak için bir fosforör üzerinde ekranı okuyun.

Representative Results

Discussion

Burada, moleküler düzeyde yeni bir protein olan LIMK2-1 ‘ e göre, dizisine ve homologlarında, LIMK2a ve LIMK2b²⁰‘ ye dayanan bir kinaz olduğuna inanılan sağlam biyokimyasal araçlar kullandık.

Öncelikle, biz belirli bir antikor ile Batı Blot analizi kullanarak protein düzeyinde LIMK2-1 varlığını göstermiştir. Bunun ardından, LIMK2-1 homologlarını LIMK2a ve LIMK2b düzenleyen bilinen upstream kinaz rock1 ile etkileşimi değerlendirildi. Son olarak, LIMK2-1 ‘ i s vitro γ [³²P] ATP etiketleme ve belirli bir fosho-antikor kullanarak Batı Blot tarafından selülit içinde potansiyel kinaz aktivitesini değerlendirdik.

Lysis tampon kompozisyon
Batı Blot tarafından onları analiz etmek için proteinleri okurken, özel bakım liziz tampon kompozisyon açısından gereklidir. Çeşitli parametreler dikkate alınmalıdır: (i) deterjan tipi ve konsantrasyon²¹, ve (ii) proteaz inhibitörleri.

Lizis tampon kompozisyon mümkün olduğunca ayıklamak ve Batı Blot tarafından tespiti için izin vermek için onun yakın tam çözünme kolaylaştırmak için hedef protein adapte edilmelidir. Çözünür proteinler için, hafif koşullar (örneğin, düşük konsantrasyonda hafif bir deterjan) bunu başarmak için genellikle yeterlidir. Membran proteinleri için daha güçlü koşullar genellikle gereklidir. Deterjanlar farklı kategoriler var: (ı) sodyum Dodesil sülfat (SDS), cetyltrimethylammonium bromür (CTAB), (II) Polietilen glikol hexadecyl eter (Brij), Triton, octylglukoz (OG), dodecylmaltoside (DDM) gibi iyonik olmayan (ı) İyonik ve ( III) Zwitteriyonik gibi 3-[(3-cholayidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (Chaps) veya zwitterbaylar. Güçlü deterjanlar etkileşimleri ve kompleksler kaybolabilir bozabilir. Dahası, immünopresipitasyon deneyler için, antikorlar ciddi koşullara duyarlı olabilir. Benzer şekilde, enzim aktivitesi, araştırılmış proteini açığa çıkabilir veya denebilir deterjanlar varlığı ile rahatsız olabilir. Kullanılan deterjan tipi ve miktarı, bir proteinin özelliklerini ve etkinliğini etkileyebilmektedir. Bazı proteinler için, proteinin aktivitesini korumak için çok kısıtlı bir deterjan konsantrasyonu tolere edilir. Bu aralığın altında protein çözünmez kalır, ancak bu konsantrasyon aralığının üstünde, protein artık aktif değildir.

Endojen proteinler tarafından hedef protein bozulması önlemek için liziz tampona proteaz inhibitörleri eklenmesi gerekir. Proteaz inhibitörü kokteylleri ticari olarak mevcuttur. Bir çalışmanın başlangıç noktası olarak kullanılabilir. Sorunlara rastlandığı takdirde,-20 °C ‘ de saklanan stok çözümlerinden oluşan inhibitörlerin karışımı kullanımı göz önünde bulundurulabilir. Bu inhibitörler serin ve sistein proteazları hedef gerekir. PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluorid) yaygın olarak kullanılır, ancak sulu çözelti çok kararsız ve ekstraksiyon hemen önce eklenmesi gerekir. Metalloproteazlar da inhibitör olmalıdır: metal şelat reaktifler, örneğin EDTA (etilen glikol-bis (2-aminoetylether)-Tetraacetic asit), hangi bind mg^{2 +}, bu amaçla kullanılır. Proteini fosforilated ve böylece aktif formda tutmak için, ayrıca liziz tampona fosfataz inhibitörleri eklemenizi tavsiye edilir. Bu inhibitörler alkalin, asit, serin, threonin ve Tirozin fosfatazlar hedef gerekir. Proteoliz hızını yavaşlatmak için düşük sıcaklıkta (4 °C) çalışma da önerilir.

Hedef proteinler
Burada, epitope etiketli proteinlere odaklandık. Etiketler (bayrak, ha, cmyc, Gfp, vb) tespit ve proteinleri arındırmak için çok yararlıdır, antikorlar ve antikor birleştiğinde boncuklar ticari olarak mevcuttur ve kolayca tekrarlanabilir malzemelerdir. Ancak, boyut ve etiket konumu bu etkinlik, yerelleştirme veya hedef protein^6,7,8işlevini etkileyebilir olarak dikkate alınmalıdır. Endojen proteinlerle çalışmak da mümkündür. Bu durumda, bu belirli proteini hedefleyen antikorlar kullanılmalıdır. Onlar boncuklar (protein A veya protein G) kovalently (Cross-link) ya da lysate ve sonra boncuklar ile inkütesli olabilir birleştiğinde olabilir. Gen bir Plasmid üzerinde ifade edilen etiketli proteinler ile çalışırken, bu proteinin mutasyona uğramış bir sürümüne genin Mutagenezi ile geçmek kolaydır. Daha sonra biyolojik fonksiyonları değerlendirmek için farklı mutantlar üzerinde çalışmak mümkündür.

İmmünopresipitasyon
Imantioprecipitation hedef protein ortakları izole etmek için çok güçlü bir tekniktir⁵. Lizis tamponun bileşimi (özellikle deterjan) etkileşimleri korumak için dikkatle kurulmalıdır (yukarıya bakın). Tanımlanan iki protein arasındaki etkileşimi algılamak mümkündür. Endojen proteinleri veya aşırı ifade edilen proteinler olabilir. Proteinlerin düşük bolluk olarak ifade edildiğinde, daha güçlü sinyaller için onları overexpress gerekli olabilir. Özellikle etkileşimsiz proteinleri veya kontaminantları kaldırmak için immünopmanite edilen boncuk geniş yıkımlarda gereklidir. Önce immünopresipitasyon verimliliği veya Co-immunoprecip, ortak varlığı belirlenmesi, farklı ortaklar iyi ifade edilir ve tüm hücre lysate veya Batı tarafından giriş fraksiyonu analiz ederek lysate mevcut kontrol etmek önemlidir Leke. Ayrıca, immünopresipitasyon deneyler kullanarak, bir hedef protein yeni ortakları belirlemek ve yeni kompleksleri izole etmek de mümkündür. Bu yeni ortaklar kütle spektrometresi ile tanımlanabilir.

Bu tür ortaklar, daha fazla biyolojik testler için tam etkinliğini sağlayan hedef proteinin aktibiyörleri olarak önemli bir rol oynayabilirler. Öte yandan, copurified istenmeyen proteinler bir argüman olarak iki tanımlanan ortaklar arasında doğrudan bir etkileşim değildir, ancak bunun yerine Co-immünoprecipitation tarafından algılanan etkileşim başka bir bilinmeyen ortak nedeniyle kullanılabilir olabilir. Bu özel durumda, doğrudan etkileşimden emin olmak için, bakterilerden arındırılmış mammalin proteinleri üzerinde çalışmak gibi başka bir deneysel cihaz gereklidir.

Kinase etkinliği
Kinase aktivitesi farklı tekniklerle değerlendirilebilir. Burada, biz in vitro analiz tarafından γ [³²P] ATP etiketleme ve belirli bir fosho-antikor kullanarak Batı Blot tarafından tüm hücre özü Analizi odaklı. γ [³²P] ATP etiketleme, zayıf kinaz aktivitesinin algılanmasını sağlayan çok hassas ve nicel bir tekniktir¹⁵. ATP ‘den hedef substrat ‘a radyoaktivite eklenmesi, doğrudan enzim aktivitesinin yapılması için bir tedbir sağlar. Farklı hedefleri üzerinde okudu protein kinaz etkinliğini değerlendirmek için farklı substratlar ile çalışmak mümkündür. Protein aşırı ifade edildiğinde onları mutasyon tarafından kinaz aktivite için önemli amino asitler tanımlamak da mümkündür. Kinaz aktivitesi, kinaz tamponunun içinde bulunmak zorunda olan mg^{2 +}gibi bir divalent kıt gerektirir.

Bu yaklaşımın önemli dezavantajı, deneyler için özel tesisler ve atıkların toplanması için gerekli olan radyoaktivitenin işlenmesi. Örneğin ADP (adenozin difosfat)¹⁶gibi reaksiyonda yan ürünleri algılayan floresan veya Işıksaçan setleri gibi alternatif yöntemler var. Protein fosforilasyon da kütle spektrometresi tarafından incelenebilir, ancak bu analizler için daha büyük miktarda malzeme gereklidir. Bizim durumumuzda, biz verimliliğinizi artırmak için kapiller Elektroforez kullanarak LIMK2 kinaz etkinliğini değerlendirmek için çalıştık ama bu maalesef başarısız oldu.

Fosforöz antikorlar, bir proteinin fosforilasyon incelemek için bir başka araçtır. Geniş genel Anti-phospho serine ve Tirozin antikorlar var, herhangi bir protein phospho-ser veya phospho-Tyr tanımak mümkün. Son yıllarda, bir hedef protein belirli bir fosho-site hedefleyen antikorlar yaygın olarak geliştirilmiştir ve genellikle fosho grubu ve çevreleyen amino asitler hem de tanıyacaktır. Bu tür antikorlar ile çalışmaya başladıktan sonra özel bakım gereklidir, örneğin fosho sitesinde mutasyona uğramış hedef protein gibi negatif bir kontrol ile kendi özgüllüğü kontrol edilmelidir. Bir anti-phospho antikor ile bir leke yoklama zaman, bu antikor ile etkileşime girebilir fosfoproteinler içerir gibi engelleme çözümü, süt olmamalıdır. Sığır serum albumin (BSA) tavsiye edilir ve fosfataz inhibitörleri, fosfat salınımı önlemek için engelleme çözeltisi eklenebilir. Numuneler dondurulmuş ve çözülmüş olmamalıdır, ancak-80 °c ‘ de tutulan plakaya olarak hazırlanmıştır. Nitekim, Fosfo modifikasyonları vardır.

Materials

Antibody anti-actin	Sigma-Aldrich	A1978	for Western Blot
Antibody anti-c-Myc	Invitrogen	MA1-21316	for Western Blot
Antibody anti-cofilin	Cell signaling Technology	3312/5175	for Western Blot
Antibody anti-GFP	Santa Cruz	sc-9996	for Western Blot
Antibody anti-HA	Roche Applied Science	11687423001	for Western Blot
Antibody anti-phospho-cofilin	Cell signaling Technology	3313	for Western Blot
Antibody Anti-PP1i	Eurogentec	designed for this study	for Western Blot
Aprotinin	Euromedex	A-162B	for lysis buffer
ATP	Invitrogen	PV3227	for γ[<sup>32</sup>P] labeling
γ[<sup>32</sup>P] ATP	Perkin Elmer	NEG502A	for γ[<sup>32</sup>P] labeling
BES buffered saline	Sigma-Aldrich	14280	for transfection
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422	for lysis and kinase buffer
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	for Laemmli
BSA	Sigma-Aldrich	A3059	for blocking buffer
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B0126	for Laemmli
CaCl<sub>2</sub>	Sigma-Aldrich	C3881	for transfection
Centrifuge	Sigma	111-541
Collagen R	Pan Biotech	P06-20166	for transfection
Control siRNA	Ambion	AM4611	for PP1i antibody specificity
Coomassie PageBlue Protein Staining Solution	Thermo-Fisher	24620	for gel staining
EDTA	Sigma-Aldrich	3690	for lysis buffer
Electrophoresis Unit	Biorad	Mini-Protean	for Western Blot
EZview Red anti-HA affinity gel	Sigma-Aldrich	E6779	for immunoprecipitation
GeneSys software	Ozyme		for Western Blot acquisition
GeneTolls software	Ozyme		for Western Blot quantification
GFP-trap beads	Chromtek		for immunoprecipitation
Glycine	Euromedex	26-128-6405	for transfer buffer
GST-cofilin	Upstate Cell signaling	12-556	for γ[<sup>32</sup>P] labeling
Hamilton syringe 100 mL	Hamilton	710	to remove carefully supernatant from beads without aspirating them
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	for kinase buffer
ImageQuant TL software	GE Healthcare		for radioactivity acquisition and quantification
LIMK2 siRNA	Ambion	s8191	for PP1i antibody specificity
Leupeptin	Sigma-Aldrich	SP-04-2217	for lysis and kinase buffer
MBP	Upstate Cell signaling	13-173	for γ[<sup>32</sup>P] labeling
MgCl<sub>2</sub>	Sigma-Aldrich	M8266	for kinase buffer
MnCl<sub>2</sub>	Sigma-Aldrich	244589	for kinase buffer
NaCl	Euromedex	1112	for lysis and kinase buffer
NaF	Sigma-Aldrich	S-1504	for lysis and kinase buffer
Okaidic acid	Euromedex	0-2220	for lysis buffer
PMSF	Sigma-Aldrich	78830	for lysis and kinase buffer
p-nitrophenylphosphate	Euromedex	1026	for lysis buffer
PVDF membrane Immobillon-P	Merck-Millipore	IPVH00010 pore size 0,45 mm	for Western Blot
Rotating wheel	Labinco		for bead incubation
Safe lock eppendorf	Eppendorf	0030120.086	for kinase assay
SDS	Sigma-Aldrich	5030	for Laemmli and migration buffer
Sodium orthovanadate	LC Laboratories	S8507	for lysis and kinase buffer
Sodium pyrophosphate	Fluka	71501	for lysis buffer
Super Signal West Dura	Protein Biology	34075	for Western Blot
Syngene Pxi	Ozyme		for Western Blot
Tissue extracts<br/> <br/> &nbsp;	Biochain<br/> <br/> &nbsp;	P1234035 Brain<br/> P12345152 Lung<br/> P1234149 Liver<br/> P1234188 Pancreas<br/> P1234260 Testis	for Western Blot analysis<br/> <br/> &nbsp;
Transfer Unit	Biorad	Mini-Trans-Blot	for Western Blot
Tris	Euromedex	26-128-3094 B	for lysis buffer
Tween-20	Sigma-Aldrich	P7949	for blocking buffer
Typhoon FLA9500	GE Healthcare		to read autoradiography
Typhoon Trio	Amersham Bioscience		to read autoradiography
Whatman paper	GE Healthcare	3030-672	for Western Blot