Davranışsal deneylerde kullanım için Jumping örümcekler renk desenleri manipülasyon

Özet

Bu protokol amacı cinsel seçim, cinsel yamyamlık, predation, aposematism veya hayvan renklendirmesi herhangi bir diğer alan ile ilgili sorular çalışmak için boya ile örümcekler ve diğer çok küçük eklemropod atlama renk desenleri manipüle etmektir.

Özet

Davranış ekoloji alanında, birçok deney cinsel seçim ve predation bağlamında renkli özelliklerin evrimsel amaçları araştırmak için tasarlanmıştır. Yöntemleri çeşitli ama çoğunlukla farklı Colorants olan bireylerin renk desenleri değiştirerek oluşur. Bu tür teknikler, özellikle kuşlar, birçok vertebrat taxa arasında kullanılmıştır, ancak etkili küçük organizmaların renk manipülasyon zorluk nedeniyle omurgasızlar için az geliştirilen kaldı. Bunun yerine, omurgasızlar görünümünü işlemek için, bilim adamları genellikle belirli dalga boylarını filtrelemek için aydınlatma ortamını değiştirdi. Ancak, böyle bir yöntem sadece ilgi fenotip özelliği ancak bireyin tüm görünümünü ve çevreleyen etkiler. Burada, daha önce renkli kuşlar üzerinde kullanılan teknikleri aşağı ölçekleme, biz, eşit sembolik ama underokudu türler kullanarak küçük eklemropod renklerini manipüle yollarını sunuyoruz: renkli atlama örümcekler.

Giriş

Hayvanlar genellikle cinsel karşılaştığında, agonistik karşılaşmalarda veya predation caydırmak için görüntülemek ayrıntılı renk desenleri vardır. Bu özellikler bir montaj ilişkisi¹, bir rakip²veya lezzeti bir av madde³olarak yetenek mücadele olarak signaler 'ın bireysel kalite gibi alıcıları bilgi iletebilir. Renkli özelliklerin adaptif amaçlarını anlamak için, araştırmacılar çeşitli şekillerde renkleri manipüle içeren deneyler tasarladık. Bazı araştırmacılar modelleri^4,5,6,7,8, fotoğraflar⁹veya videolar^10,11gibi renkli yem uyaranlara kullandık ¹² davranış deneylerinde alıcılara sunulmaktadır. Diğerleri, özellikle omurgasızlar kullanırken, canlı bireylerin renklerin görünümünü etkilemek için aydınlatma ortamını manipüle var^{13,14,15,16, 17}. tüm bu manipülasyonlar, ustaca iken, potansiyel olarak önemli doğal davranış kaldırma ve/veya çok ilgi özelliği daha etkileyen dezavantajı var. Büyük omurgalar, kuşlar gibi, araştırmacılar çok sık doğrudan canlı hayvanlar üzerinde renk manipüle (Hill ve McGraw, 2006¹⁸) olarak incelenir. Bireysel tüyler veya gagaları doğrudan işaretçileri ile renkli olmuştur^{2,19,20,21,22,23,24}, Hidrojen peroksit içeren boyalar genellikle saç lighteners kullanılan^25,26,27, veya oje dahil olmak üzere çeşitli boyalar²⁸. Invertebrates, bu tür çalışmalar doğrudan canlı hayvanlar üzerinde renk desenleri manipüle nispeten nadirdir ama hala fonksiyon ve renk evrim içine muazzam bir fikir sağladı^{29,30,31 ,32,33,34,35,36,37,38,39}. Hatta artthropod çalışmalar daha kolay ele ve boyalı olabilir büyük takson doğru önyargılı gibi görünüyor, çok küçük türlerin renk desenleri bırakarak nispeten az okudu.

Burada, çok küçük hayvan taxa için geliştirilen hassas bir renk manipülasyon tekniği tarif. Özellikle, bu yöntem Mate seçimi ve cinsel yamyamlık bağlamında böyle renkli özelliklerin önemini araştırmak için bir mikroskop altında erkek atlama örümcekler yüz renklendirmesi manipülasyon içerir. Bu durumda, Habronattus pyrrithrix 'ı (PHOENIX, az, USA 'dan) bir model türü olarak kullandık (Şekil 1). Biz deneysel çalışma sonuçları başka bir yerde^38,39, bu tekniklerden bazılarını kullanarak yayımlandı, ama burada biz daha önce yapılmış daha ayrıntılı olarak yöntemleri açıklamak, onları başkalarına erişilebilir hale getirmek bir şekilde onları çoğaltmak veya diğer çok küçük taxa üzerinde kullanılmak üzere adapte teşebbüs. Bu tür protokoller en sembolik kuşlar kadar renkli olabilir ama genellikle az okudu hayvanlar üzerinde deneysel fırsatlar açmak gerekir.

Protokol

1. ekipman hazırlama

1. Uygun boyaları seçin.
   1. Başarılı uygulama için, hızlı kurutulması ve ince ile kolayca manipüle edilmiş bir dokuya sahip boyalar kullanın. Başarıyla kullanılan ürünler, su ile inceltilebilir olmayan su geçirmez eyeliners ve emaye ince (malzeme tablosu) ile inceltilebilir emaye boyalar içerir.
   2. Örümcekler boyama zaman, çoğu türün karapas yumuşak karın genellikle uzanır ve besleme⁴⁰ile daralan sertleştirilmiş bir dış iskelet olduğunu düşünün.
      1. Emaye boyalar boyalı yüzeyde sağlam, sertleştirilmiş bir kaplama üretir; Bu nedenle, onları manikür sert parçaları (örneğin, Carapace, bacaklar, pedipalps) uygulayın. Bu tür emaye kaplamalar, örümceğin karının beslenme ile şeklini değiştirdikleri gibi örümceği soymak için daha az etkilidir.
      2. Buna karşılık, eyeliners sertleştirilmiş bir kaplama üretmeyin, ama daha ziyade renkli vücut ölçekler içine anlaşılmak; gibi, hem sert ve yumuşak vücut parçaları (Örümcek ağakalar dahil) kullanın.
         Not: yaklaşan adımlarda, en hassas tekniği örümcekler yüz ve örümceğinin boyama oluşur sunulmuştur; Emaye boya kullanılabilir, emaye boya renk çeşitliliği nedeniyle en genelleştirilebilir yöntemi kullanılır.
   3. Canlı hayvanlar üzerinde boya testi yapmadan önce, mümkünse, ilk olarak boya spektral özelliklerini ölçmek (sadece kağıt veya başka bir yüzeye uygulanan) spektrumunda herhangi bir istenmeyen UV zirveleri olmadığından emin olmak için bir UV-VıS yansıtma spektrofotometre kullanarak insanlar için görünmez olurdu, ama muhtemelen okudu türler görülebilir.
2. Dokümantasyon ve artan çoğaltabilirlik (malzeme tablosu) için manipülasyon sonucunun resimlerini daha kolay çekmek için bir kamera ve bilgisayara bağlı bir diseksiyon mikroskop kullanın.
   1. Kamera girişini işleyen mikroskop, bilgisayar ve yazılımları açın.
   2. Son resmin alınacağı ilgili yakınlaştırmayı seçin.
   3. Sopa bir böcek montaj pin veya küçük bir çivi (kafa ile dışarı işaret) olmayan sertleşme modelleme kil (yaklaşık bir üzüm büyüklüğü) bir top içine. (Boyanacak canlı örümcek geçici olarak aşağıdaki adım 3,1 bu pin kafasına monte edilecektir). Onlar kabaca pin (nerede örümcek monte edilecek) başı odaklanmak böylece hedefleri ayarlamak için mikroskop altında modelleme kil ve pin yerleştirin.
   4. Hedeflerin ressamın gözleri için doğru mesafeden olduğundan emin olun ve fotoğraf makinesinin resim sırasında vizyon alanını engellemesine dikkat edin (kamera oculardan birine monte edildiğinden, derinlik algısını engelleyen).
3. Bir temiz plastik Snap-Cap şişe içine örümcek aktarmak (yaklaşık 12 DRAMs, herhangi bir dokuma veya ölü av olmadan).
4. Montaj ve boyama ekipmanlarını hazırlayın.
   1. Ek bir ince böcek montaj pin olmayan sertleştirme modelleme kil bir topu içine (adım 1.2.3 kullanılan ek olarak) ve mikroskop sol tarafında (sağ elle insanlar için) yerleştirin. Bu pin, boyama sırasında örümceğin bacaklarının ve pedipalların (gerektiği gibi) konumlarını nazikçe ayarlamak için kullanılacaktır.
   2. (Bir kağıt havlu gibi), beyaz yazıcı kağıt bir parça emici kağıt küçük bir parça olsun, boya (burada, emaye boya), boyama (her renk artı bir şeffaf ve temiz tutulan), ayrı kaplar, her renk için bireysel mikro fırçalar uygulamak için (bkz. malzeme tablosu), ve sadece temiz tiner ile kullanılmak üzere bir mikro fırça, tüm (sağ el insanlar için) mikroskop sağında düzenlenmiş bir moda konumlandırılmış.
   3. Bir kürdan kullanarak, açık bir plastik çanak (küçük bir petri çanak veya bir şişe kap gibi) boya bir damla ekleyin ve küçük bir şırınga ile Örneğin, boya tiner ekleyin. Bir mikro fırça ile beyaz yazıcı kağıt üzerinde test ederek doğru tutarlılık (boya tamamen homojenleştirilir, ama çok runny değil) kürdan ile iki karıştırın.
      Not: bazı durumlarda, boya hızlı bir şekilde kurur, uygulama için istenen daha biraz daha fazla sıvı ile hazırlayın ve fırçalar daha sonra kullanımına kadar boya tiner pot emmek izin (adım 4).
   4. Yazıcı kağıdın bir köşesine su bazlı tutkal (bkz. malzeme tablosu) bir bezelye büyüklüğünde damla koyun.
      Not: Bu preparatın son aşaması olmalıdır ve sonraki adım hemen bundan sonra gerçekleşmesi gerekir, böylece tutkal kurumaz.

2. örümceği anestezizasyon

1. Şişedeki örümcek ve bir el kaçış önlemek için açılışta kapladı ile, yavaşça CO₂ gaz bacak Spider 'ın üçüncü çifti kadar 180 derece uzanır ekleyin.
2. Tür ve bireysel örümceğin ortalama boyutuna bağlı olarak, 1,5 dakika için yaklaşık 20 saniye CO₂ maruz kalma süresini kullanın. Biz H. pyrrithrixanestezi uygun düzeyde güvenilir bir göstergesi olarak bacaklar üçüncü çifti uzantısı bulduk, ama bu büyük olasılıkla türler arasında değişir. Bu teknikleri ilk kez farklı bir türle kullanırsanız, ilk önce anestezisini birkaç örneklemek için yanıtlarını değerlendirmek için test edin.
3. Az CO₂ olarak örümcekler vermek mümkün anestezi gerekli seviyeye ulaşmak için. Anestezi kısa dönemleri burada açıklanan iken hiçbir mortalite (ve anestezi olmayan örümcekler hiçbir fark davranışsal farklar) üretilen, anestezi (Sham kontrolleri dahil) bir deney eşit düzeylerde tüm hayvanları vermek.
4. Anestezi altında örümcek korumak için CO₂ ekledikten sonra şişe kapalı tutun; Bu nedenle, bu zaman ne kadar örümcek CO₂maruz zaman hesaplanmasında içerir.
5. Örümcek renk manipülasyon başlamak için şişe kaldırıldı sonra, tam olarak yaklaşık 1 ila 2 dakika anestezize kalacak; Bu nedenle, aşağıdaki adımları (Bölüm 3-6) hemen yapın. Bu sınırlı zaman penceresi nedeniyle, canlı örümcekler boyamaya çalışmadan önce (uygulama için) ilk ölü numuneler ile aşağıdaki boyama yöntemini deneyin.

3. örümcek mikroskop altında montaj

1. Mikroskop vizyonu alanında hazırlanan modelleme kil montaj pin veya çivi başı üzerine tutkal çok az miktarda ekleyin.
   Not: i) örümcek (çok fazla tutkal kullanılırsa) kuş beyinli kapalı slayt değil emin olmak için yerinde örümcek bakımını sağlar tutkal en küçük miktarda kullanın ve ii) örümcek uyanma sonra kendini serbest yönetir.
2. Anestezi yapan örümceği, ventral yan yukarı ile masaya hafifçe kaydırın.
   Not: örümceklerin karınlarının yumuşak olduğu için, bu yaralanmalara neden olabileceğinden örümcekleri masaya dokunun veya bırakmayın.
3. Spider 'ın sternum (Örümcek bacaklarının vücuda iliştirdiği merkez alan) örümcek biraz sıçrama ve uygulanan küçük basınç altında bacaklarını uzatmak gibi nazikçe (tutkal ile) kuş beyinli basın. Uygulanan basıncın ekstra kontrolü için, her iki elin de masaya sıkıca sabitlenmeleri ile modelleme kil her iki eliyle tutun.
4. Boya alanı yukarı ve odağı karşı karşıya böylece mikroskop altında modelleme kil yeniden konumlandırın.

4. örümcek boyama

1. Boyama fırçasını örümceğe dokunmadan önce boya tutarlılığını değerlendir.
   1. Boya tutarlılığı yeniden sınayın (onlar tiner muhafaza edildi Eğer fırçaları silmek için emici kağıt kullanın), gerekirse tekrar ayarlayın, ve her zaman ilk fırça kılları bulunan boya miktarı kontrol etmek için yazıcı kağıdı üzerinde boya uygulama deneyin.
   2. Sağ el ile ve mikroskop bakarak, görme alanında fırça ucunu getirmek ve emin olun (ikinci kez) fırça kılları çok fazla boya içermez, bu durumda yazıcı kağıdı üzerine bazı silin.
2. Örümceğin boya tutarlılığı test edin.
   1. Üzerine boyanması gereken en büyük alanda fırça ile örümceğe dokunun. Bu boya tutarlılık ve miktar doğru olup olmadığını ressamı bilgilendirecektir (yani, nezaman boya biraz ve yavaşça saç içine/örümceğin ölçekler içine soaks).
      1. Hiçbir boya uygulanırsa, fırça boya içine emmek ve prosedürü tekrarlamak için adım 4,1 dönün.
      2. Eğer boya ile kaplı olmamalıdır bir alan üzerine hızla ve dökülmeler içinde boyama, ve dökülme minimal olduğunu ve bireyin hala denemede yer alabilir varsayarsak, emici kağıt üzerine fırça silin ve adım 4,1 geri dönmek için tekrar işlem.
         Not: Bu tür sıvı dökülme düzeltilemez. Eğer dökülme keliser veya gözler, ya da kişi için ölümcül ya da toksik olabilir diğer parçalar ulaştığında, hemen dondurucuya onu uyanır ve deneme örümcek hariç önce ötenize için örümcek yerleştirerek düşünün.
3. 4,1 ve 4,2 adımlarını izleyerek renklerin ihtiyaç duydukları tüm alanları boyayın.
   1. Eğer örümcek yüzünü boyamak, ön bacaklar ve örümceğinin aşağı tutmak için sol el ile ekstra ince pin kullanın (böylece onlar Paintbrush yolu dışında olacak). Bu en iyi örümcek eklentiler zarar önlemek için mikroskop bakarak yapılır. Ayrıca, Eğer örümcek yüzünü boyamak, ve boya için kullanılan fırçalara bağlı olarak, gözleri arasında merkezi parçayı boyamak için çalışmadan önce yüzün her iki tarafını boyama düşünün-hem boyalı alanlar örümcek yüzüne paralel fırça tutarak katılabilir ve kapiller eylem inducing.
      Not: Örümcek yüzü boyama zaman, ilk baskın el en yakın yan boya en kolay ve daha sonra diğer tarafı boyamak için mikroskop altında etrafında kil topu (monte örümcek ile) döndürmek, orta izledi.
   2. Ne zaman boyama örümceğinin veya bacaklar, herhangi bir eklem dokunmak için emin olun boya bir sertleştirme biridir (gibi emaye boya), ve erkek sperm teslim organlarına boya uygulamak için emin olun (örümceğinin distal segmentin alt).

5. örümceğin resmini çekmek

1. Hedefi kamera moduna geçin.
2. Bir ölçek çubuğu eklenebilir, böylece zoom çekilen bir mikroskop üzerinde seçilmiş olduğundan emin olun, bilgisayar yazılımını kullanarak bir resim çekin.

6. örümcek pin veya tırnak serbest

1. Örümcek hareket etmeye başladığında, örümceğin ön bacaklarının örümceğin şişeye dokunmasını sağlayan Pini tutun.
2. Örümcek kendini serbest bırakın, ve gerekirse, hafifçe örümceğin kurutulmuş tutkal uzakta kendini çekmek için pin eğim.
   1. Eğer örümcek boyama tamamlandıktan önce uyanırsa, örümceğin en az 15 dakika daha anestezize edilmeden önce kurtarmasına izin verin. Bu işlem yapılırsa, tüm grupların aynı anestezi düzeylerini (Eğer uygunsa, sahte tedavi edilen bireyler dahil) elde etmesini sağlayın.
      Not: örümcekler (< 15dk) manipülasyon sonra hızlı bir şekilde normal davranışlarını devam etmek için görünür ama biz bir davranış testi örümcek kullanmadan önce 12 saat dinlenme süresi standartlaştırmak öneririz.

7. örümceğin davranışlarının Analizi

1. Uygulamanın olası toksisitesi (belirli boya tipi, renk, uygulama alanı ve çalışma türlerine göre değişebilir) değerlendirmek için manipüle edilmemiş, sahte tedavi edilen ve işlenmiş konuların davranışını karşılaştırın. Karşılaştırmak için ilgili davranış, aktivite oranı, gerçekleştirilen aktivite türü, belirli etkinlikleri gerçekleştirirken başarı (örn. av yakalama) vb. dahil olabilir.
   1. Deneysel tasarımın bir parçası olarak (örneğin, görünür olmayan bir alanda boya uygulamasını alarak veya aynı alanlara uygulanan nötr renkli boyalara sahip), sadece bireyin rengini değiştirmek için kontrol ederken diğer faktörler (Örn. kullanım süresi, koku, yüzey dokusu, vb.).
      Not: Eğer bacaklar veya pedipalps boyama, bu duyusal saçlar (Örümcek bacaklar ve pedipalps üzerinde yaygın etkilenebilir olasılığını düşünün, Foelix 2010⁴⁰) görmek ve, bu durumlarda sahte işlenmiş erkeklerde nötr renkli boya uygulanan olmalıdır Aynı alanlarda kontrol edilir.
   2. Yeni yöntemler geliştirirken, renk manipüle bireylerin hala normal davranır olup olmadığını değerlendirmek için manipüle edilmemiş örümcekler ile boyalı örümcekleri karşılaştırın.

8. boyalı konuda renk manipülasyonunun yansıma özelliklerini ölçme

1. Bir kez ötenize (örümcekler bir deney veya özellikle bu amaçla ötenize dahil edildi sonra, bkz: aşağıda Not), standart bir taşınabilir UV-VıS spektrofotometre kullanarak renk manipülasyon spektral özelliklerini ölçmek (malzeme tablosu ), özellikle çapı 1 mm 'den büyük alanlar için.
2. Daha küçük alanlarda, daha kolay ve daha hassas ölçümler için özel yapılı bir mikrospektrofotometre (mikroskop üzerinden yönlendirilen bir UV-VıS spektrofotometre) kullanın, ancak mikroskobun optik UV ışığını kesmesine karşın, ölçümlerin görünür (bakınız Taylor ve ark. 2011⁴¹).
3. Renk manipüle edilen alanların son derece küçük olduğu ve UV yansıma verilerinin gerekli olduğu durumlarda, ticari olarak kullanılabilir UV-VıS mikrospektrofotometreleri kullanın (bkz. Taylor ve ark. 2014⁴²).
   Not: UV-VıS spektrofotometrelerin ışık kaynağı UV ışığı içerir ve hayvanların gözleri (bizimki de dahil olmak üzere) için tehlikeli olabilir, böylece spektral önlemler sadece hayvanların ötenize edildikten sonra ve sadece anestezi yapılmamalıdır. Emaye boyalı örümcekler için, bu örümcekler denemelerde boya kapalı giymez beri kullanıldıktan sonra yapılabilir (aşağıdaki temsili sonuçlara bakın). Bazen gün veya hafta sonra solabilir su bazlı boya için, örümcekler bir dizi zaman onların meslektaşı bir deney dahil olacağını zaman ölçüm için feda olabilir (kullanılan gerçek renk manipülasyon yansıtan veri yakalamak için deneyin). Boyaların spektral özelliklerinin raporlanması, renk manipülasyonunu çoğaltmak isteyen diğer araştırmacılar tarafından çoğaltılmasına izin verecektir, ancak aynı belirli boya ürünlerine erişemez.

Sonuçlar

Renk manipülasyon etkinliği

Bu teknikleri kullanarak, renk manipülasyon çeşitli dereceleri tamamen veya azaltarak veya yoğunluğu artırılması renkleri gizlemek dahil etkilidir. Bu hem fotoğraf hem de spektral yansıma ölçümlerinden (Şekil 2, Şekil 3ve Şekil 4) belirgindir. Burada renk manipüle erkek Habronattus pyrrithrix doğal kırmızı yüzlü erkeklerde karşılaştırıldığında gösterir. Spektral Özellikler UV-VıS spektrofotometresi kullanılarak ölçülmüştür (bkz. malzeme tablosu), çapı 1mm gibi küçük renkli alanları hassas bir şekilde ölçebilir. Ölçümler, diffce bir yansıma beyaz standardına göre alınmıştır (bkz. malzeme tablosu).

Nadir durumlarda (5 dışarı 108 erkek siyah eyeliner ile boyalı 1 ( malzeme tablosunabakın) yüzünde), su ile çözünür eyeliner örümcekler ' yüzleri kapalı giymek başladı bir hafta ya da iki. Bu, diğer eyeliner markası için gözlemlenmemiştir (eyeliner 2; bkz. malzeme tablosu). Her iki durumda da örümceğin kafesleri haftada üç ila beş kez su ile püskürülür. Farklı bakım koşulları su bazlı boya aşınmasını etkileyebilir. Emaye boya hala tüm işlenmiş erkekler için bozulmamış (n = 221), hatta hala hayatta olanlar için 6 ay sonra.

Renk manipülasyon olası toksisitesi

Bir örümceğin gözleri üzerinde boya alma önlemek gerekir böylece onların vizyonu engellemek için değil, ne de onların Chelicerae, ağız parçaları ve diğer orifices, ve muhtemelen diğer yumuşak vücut parçaları olası yutulması ve zehirlenme önlemek için. Bir de boya eklem veya duyusal saçlar (bacaklar ve pedipalps gibi) içeren parçaları ile dikkatli olmalıdır böylece onların hareketlilik veya duyusal sistemi kısıtlamak için değil. Ancak, bu vücut bölgelerinde bu tür renk manipülasyonları gerekli ise, ya da ince olumsuz etkileri olasılığı hakkında herhangi bir şüphe varsa, o zaman tüm tedavi kategorilerinde kişilere boya uygulamak için en iyisidir. Bu şekilde, bir istemeden sadece tedavilerden birine karşı önyargılı olabilir şekillerde bireylerin duyusal sistemlerini manipüle kaçınacaktır. Örneğin, Şekil 4' te gösterilen manipüle edilen erkekleri kullanan bir deneyde, Kur sırasında erkekler tarafından görüntülenen kırmızı yamaların sayısını artırmak ve azaltmak amaçıydı. Bazı erkekler gri emaye boya ile gizli onların doğal kırmızı yüzleri elde edeceğini (gösterilen kırmızı miktarını azaltmak için), hangi biz kırmızı yüz korumak istedim diğer erkekler gri yüzlü olarak aynı ürün ile doğal kırmızı yüz üzerinde kırmızı boyanmış Erkek. Benzer şekilde, biz kırmızı renk yamalar gösterilen miktarını artırmak için belirli erkeklerde pedipalp kırmızı yamalar eklemek istedim beri, gri boya tüm erkekler bu hassas alanda boyalı olacaktır, böylece diğer erkeklerin pedipalp kapsayacak şekilde kullanıldı (bkz. Şekil 4) . Tercih edilse de, bu strateji her zaman uygulanabilir olmayabilir. Örneğin, başka bir denemede, kırmızı renklenme, erkeğin altta yatan manikür olarak aynı spektral özelliğe sahip bir siyah eyeliner kullanılarak çıkarıldı, diğer erkek renkleri bozulmamış ve doğal bırakarak (Şekil 2). Bu durumda, doğal görünümlü erkekler için, eyeliner aynı miktarda sadece onların anterior Median gözleri arkasında onların karapas üst alana uygulanan (açıkça kadınlarda görünür olmayan bir alan), potansiyel koku veya genel toksisitesi için kontrol etmek Ürün. Ancak, boya uygulandığı konum örümcekleri farklı etkileyebilir. Bu nedenle, şekilde veya boya uygulandığı yerde ince farklar değerlendirmek için örümcek bütünlüğü üzerinde olabilir, bizim hipotezler ilgili bir bağlamda erkek her iki tür davranışı (Mate seçimi ve cinsel yamyamlık göreli) karşılaştırıldı. Erkek bir dişi varlığı iki-by-iki koydu ve biz aktif olmak için onların gecikme karşılaştırıldığında, onların gecikme Kur, ve genel doğrusal karışık efekt modelleri ile Kur harcanan toplam süresi (R paketi ile fonksiyon lmer kullanarak lme4⁴³ R sürümünde 3.5.2⁴⁴ kadın kimliği ile rasgele bir etki olarak ve p-değerleri elde etmek için maksimum olasılık kriteri kullanılarak). Bu durumda, tüm karşılaştırmalar tedaviler arasında hiçbir fark ortaya (Tablo 1 bakın) ve bu nedenle biz bir veya diğer tedavi kategorisi lehine bir önyargı tanıtmak vermedi sonucuna vardı.

Her iki durumda da, çok benzer tedavi kategorilere sahip olduğunda (Şekil 4), ya da sadece Sham tedavi bireyler (Şekil 2 ve Şekil 3), araştırmacılar nasıl onların model türlerinin kullanımı boya etkilenir değerlendirmek gerekir ve emin olun Hala benzer ve ekolojik olarak ilgili bir şekilde davranır. Biri, örneğin tedavi ve manipüle edilmemiş bireyler arasındaki aktivite oranlarını karşılaştırarak, mümkün olduğu kadar toksisite olası etkilerini değerlendirmek için veri kaydedebilirsiniz. Şekil 4 ' te olduğu gibi emaye boya ile boyanmış Örümceklerimiz başka özdeş bağlamda manipüle edilmemiş erkeklere kıyasla. Özellikle, erkek bir kadın kafesi ve onların gecikme şişe bırakmak için tek başına tanıtıldı, Kur ve Kur oranı gecikme (önce copulation, ve önce saldırıya veya cannibalized) karşılaştırıldı. Hiçbir fark bulunamadı (yukarıdaki gibi benzer doğrusal karışık efekt modelleri kullanırken) ve bu nedenle bizim boyalı erkek doğal davrandığı sonucuna (Tablo 2).

Son olarak, bu deneylerde herhangi bir örümcek (genellikle kadın) bu cannibalized renk manipüle erkek olumsuz etkileri muzdarip ortaya çıkmadı dikkat etmek önemlidir. Örümcekler kendi avlarını dışarıdan sindirirler, genellikle manikür 'ın boyalı alanlarını geride bırakırlar. Ancak, renk manipüle hayvanların tüketilen diğer sistemler için bu yöntemi uyarlayarak, bir toksisite olası riskleri değerlendirmek gerekir.

Şekil 1 . Yetişkin erkek Habronattus pyrrithrix kendi renkli vücut bölgeleri ne kadar küçük gösteren. Lyle Buss tarafından fotoğraflandı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 2 . Deneysel renk manipülasyon Habronattus pyrrithrixkırmızı yüz renklendirmesi gizlemek için kullanılır. (A) renk manipülasyon önce sağlam kırmızı yüz renklendirmesi. (B) siyah eyeliner ile doğal kırmızı renklenme gizleyen sonra aynı erkeğin yüz renklendirmesi 1. (C) doğal kırmızı yüz, doğal altta yatan siyah manikür ve siyah eyeliner 2 ile boyalı kırmızı yüz için temsili yansıma spektrum. Taylor ve McGraw 2013³⁹değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 3 . Deneysel renk manipülasyon erkek Habronattus pyrrithrix kırmızı yüz yama boyutunu ve kızarıklık azaltmak için kullanılır. (A) renk manipülasyon önce sağlam kırmızı yüz renklendirmesi. (B) yüzünüzün ön kısmına seyreltilmiş siyah eyeliner (kentsel çürüme) uygulamadan sonra aynı erkeğin yüz renklenme ve kırmızı alanın boyutunu azaltmak için yüz yama kenarları boyunca olmayan seyreltilmiş siyah eyeliner. (C) Nüfus ortalaması (n = 57) ve önceki bir çalışma⁴¹' den 10 drabbest erkek ile karşılaştırıldığında, Şam tarafından işlenmiş kontrol erkeklerin spektral eğrileri (n = 21) ve renk manipüle edilmiş erkek (n = 21). Şekil Taylor ve ark. 2014³⁸. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 4 . Deneysel renk manipülasyon erkek kırmızı yüz yama rengini değiştirmek için kullanılan Habronattus pyrrithrix. Habronattus pyrrithrix erkek (A) kırmızı, (B) kırmızı ve gri ve (C) gri emaye onların doğal kırmızı yüz ve doğal krem renkli pedipalps üzerinde boya ile boyalı. (D) manipüle edilmemiş erkekler için spektral eğriler (n = 9) ve yüzü kırmızı emaye boya ile kaplı erkek (n = 9). Örümceğin yüzüne daha parlak bir kırmızı uygulayarak, kırmızı yüz renklerini etkili bir şekilde geliştirdik. Çünkü emaye boya tam altta yatan ölçekler kapsar, renk de tamamen değiştirilebilir, gri emaye ile durumda olduğu gibi. (E) Bu denemede, kırmızı ve gri emaye boyalar toplam parlaklık için eşleştirilmek üzere seçilmiştir (Bu örümcekler tarafından görülebilir dalga boyu aralığında toplam yansıma). D ve E 'deki Y eksenlerinin ölçeğinde farklılıklar, kağıt üzerindeki renk örneklerini (E) vs. Spider (D) karşısında renklerin doğrudan ölçümlerini ölçmek için farklı tekniklerden (örneğin ölçülen alanların boyutuna ve büyüklüğüne kadar uzaklık) kaynaklanmaktadır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. 

N	Bağımlı değişken	P	T	Kırmızı yüzlü	A-SE	Siyah yüzlü	A-SE	nFID
202b	Erkek gecikme çanak bırakmak için	0,35	-0,93	140,0	23,9	109,8	23,9	102
179c	Erkek gecikme mahkemeye	0,74	0,33	983,4	127,1	1031,0	126,5	95
204a	Erkek Kur çalışması	0,52	0,63	181,2	24,4	203,0	24,4	102
204a	Herhangi bir saldırıdan önce erkek Kur çalışması	0,41	0,68	89,0	15,7	97,5	15,7	102

Tablo 1. Erkek yüz renk manipülasyon davranışının etkisi, siyah eyeliner vs. Sham ile boyalı zaman tedavi (Şekil 2). Her modelin yapısı, her bir tedavi grubu için saniye cinsinden ortalama tahminlerin yanı sıra (± SE) verilir. N = erkeklerin sayısı, p ve t = p-değeri ve erkek tedavisi için t-değeri, Ndıd = rasgele efekt dişi Kimlikteki düzeyler sayısı. ^bir Out 104 erkek testleri gerçekleştirilen, 102 başarılı bir şekilde kaydedildi, 204 benzersiz erkek gözlenen lider. ^b2 erkek hiç Petri çanak çıkmadan önce kadın tarafından cannibalized edildi. ^c25 erkek kadın tarafından hiç dişi kurmadan önce cannibalized edildi.

N	Bağımlı değişken	P	T	Manipüle edilmemiş	A-SE	Boyalı	A-SE
32a	Erkek gecikme çanak bırakmak için	0,87	-0,17	380,8	143,1	345,4	152,4
31b	Erkek gecikme mahkemeye	0,93	-0,09	502,6	105,8	488,1	116,6
31b	Erkek Kur çalışması	0,74	-0,33	2324,3	455,0	2102,1	484,4
31b	Herhangi bir saldırıdan önce erkek Kur çalışması	0,68	0,42	1495,1	450,8	1770,1	479,9

Tablo 2. Erkek yüz renk manipülasyon davranışı üzerinde etkisi, kırmızı veya gri emaye boya ile boyanmış (n = 15, Şekil 4) vs. manipüle edilmemiş erkek (n = 17). Her modelin yapısı, her bir tedavi grubu için saniye cinsinden ortalama tahminlerin yanı sıra (± SE) verilir. N = erkeklerin sayısı, p ve t = p-değeri ve erkek tedavisi için t-değeri. 17 manipüle edilmemiş erkek, deneyimizde tüm boyalı erkeklerin bir alt kümesine kıyasla (n = 221). Özellikle, onlar 15 boyalı erkek (5 kırmızı (Şekil 2a), 5 kırmızı ve gri (Şekil 2B), ve 5 gri (Şekil 2C)) aynı bağlamda (bir dişi varlığı) ve aynı belirli zaman aralığında test karşılaştırıldı. Bu önemli çünkü manipüle edilmemiş erkekler deneme sonuna doğru test edildi (Ağustos ve Eylül 2018), hangi doğal üreme sezonu sonuna karşılık gelir ve erkeklerin genellikle daha az aktif olduğu. Tüm bu diğer değişkenler eşit tutulması bize diğer önyargıları tanıtmadan boyama tedavisi karşılaştırmak için izin verir. ^b Bir erkek (tüm gri) önce hiç dişi Kur cannibalized oldu.

Tartışma

Burada, biz Artropod küçük vücut parçalarının renklerin etkili makyaj ve emaye boyalar gibi Renklendiriciler kullanarak manipüle edilebilir olduğunu göstermektedir.

Bu kadar hassas manipülasyon elde etmek için ilk kritik adım genellikle birinin elinde kısıtlanabilir küçük hayvanları hareketsiz edebilmek için. Burada, Spider 's Face atlama gibi hassas alanları boyamak edebilmek için, biz CO₂ ile bireyler anestezize ve bir pin kafasına monte. Bu, örümcekten daha az stres ile örümceğin gözlerine yakın çalışmayı sağlar, Eğer uyanık olsaydı (boyama işlemi sırasında yüzlerine parlayan mikroskop ışığında).

Yöntem de kaliteli mikro fırçalar almak gerektirir, ve, en eleştirel, uygun boyama maddeleri. Dökülme olmadan boya uygulama en zor adım ama iyi kapsama alanı ile doğru tutarlılık elde etmektir. Bu nedenle, boyama maddeleri kolayca bir ince ile seyreltilmiş olması gerekir, ve kolayca kalınlaşma için kurutulur. Farklı türde boyalar kullanılabilir; burada, sonuçları su çözünür (olmayan su geçirmez) eyeliners ve emaye boyalar ile sunulur. Sigara su geçirmez eyeliners kolayca su ile karıştırıldığında sıvılaştırılmış olma avantajı vardır. Ancak, bu pigmentasyon seyreltme ile kapalı esnaf (hangi olmayabilir veya arzu edilebilir (örnek Şekil 3için bakınız)). Emaye boyalar hala tam kapsama sağlayarak, emaye tiner ekleyerek kolayca kontrol edilebilir bir tutarlılık var. Ancak, bu karakteristik vücut parçasının saç veya ölçek yapısını muhafaza olasılığı ile kapalı esnaf boyalı. Buna ek olarak, emaye boyalar uzun ömürlü. Bunun dezavantajı, emaye boya ve ince uygulama sırasında ve kurutmadan önce güçlü kokular yayar olmasıdır. Boyama maddeleri ile ilgili bir ek zorluk doğru spektral özellikleri ile, sağ gölge bulmak olabilir. Bu örnek zor siyah eyeliner ile paralel olarak kullanmak için kırmızı eyeliner almak için, gibi eyeliners genellikle daha kırmızı daha pembe. Ayrıca herhangi bir Glitter içermeyen makyaj tozu (veya pigmentler) almak zordur (bazen sadece mikroskop altında görülebilir). Birçok makyaj ürünleri de, deneyler için görünmez iken, okudu hayvanların göze çarpan olabilir UV ışığı yansıtır.

Doğrudan vücut parçaları üzerine Renklendiriciler uygulayarak eklemropodların renklendirmesi manipülasyon diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında avantajları ve rahatsızlık ile birlikte gelir. Onun ana sınırlama bir kesinlikle bazı ince toksisite etkileri olasılığını reddeden olduğunu. Ancak, bir tedavi grubuna karşı tüm tedavi kategorilere boya uygulayarak önyargıları tanıtmak için emin olabilir, ve/veya bir boya uygulama ilgi davranışları ile müdahale olup olmadığını test edebilirsiniz. Burada sunulan yöntemler ile, boya uygulamasının olumsuz bir etkiye (Tablo 1 ve Tablo 2) gözardı edilmesine yol açan yeterli kanıt topladık. Bu yöntemin ana avantajı, renk küçük yamalar hedef olabilir, onların renk ' kaldırıldı ' (şekil 2), (şekil3) veya daha parlak (Şekil 4), vücut renklendirmesi ve bireyin geri kalanı izolasyonda yapılmış Ortam. Bu, aydınlatma koşullarını manipüle eden ve böylece tüm bireyin ve çevresinin görsel görünümünü değiştiren en yaygın alternatif yöntem ile kontrast oluşturmaktadır. Aslında, özellikle aydınlatma koşullarını manipüle bile değil, bir başarıyla renk manipüle ve aydınlatma ortamı uygun değilse, bu manipülasyon sınırlı veya hiçbir etkisi³⁹bakın. Bu nedenle, herhangi bir deneylerin gerçekleştirileceği ışık ortamını ölçmek ve dikkate almak önemlidir (yani, irradiance ölçmek) ve doğal aydınlatma koşullarına yakından uyan emin olun (örneğin, taklit tam spektrum ampuller kullanarak doğal ışık zaman esir). Genel olarak, mikro fırçalar ve mikroskop kullanarak, bu protokol daha önce omurgasızlar üzerinde kullanılan diğer diğer doğrudan boyama yöntemleri daha küçük renk yamaları daha hassas manipülasyon sağlar. En önceki çalışmalar, örümcek atlama yüzler (örneğin, kelebek kanat renkler^29,34,35, Yetişkin organları manipülasyon yüzleri kıyasla nispeten büyük renk yamaları ile hayvanları kullandık hemipterans (' true Bugs ')^30,36 ve çekirge³¹, ya da nispeten büyük kurt örümcekleri bacaklar^32,33,37). Burada sunulan yöntemler, küçük boyutlarına göre incelenmiştir takson üzerinde renk yamaları şaşırtıcı çeşitliliği incelemek için fırsatlar açık.

Benzer teknikler immobilize veya anestezize edilebilir diğer eklemropodlara uygulanabilir ve boya hareketlilik veya bireyin sağlığını etkilemez alanlar için (yani, eklem gibi alanlar hariç, saç veya gerekli arolia gibi yapılar uygun lokomotif, ağız parçaları veya solunum yapıları gibi diğer Orifisler için). Bu teknikler de yaygın olarak kullanılabilir boyalar, boyalar, ve makyaj daha büyük bir paleti içerecek şekilde uzatılabilir.

Son olarak, bu hassas teknikler sadece küçük organizmaların rengini manipüle etmek için değil, aynı zamanda nispeten daha büyük organizmalarda desenleri (çizgiler gibi) manipüle etmek için de kullanılabilir. Bu cinsel seçim, iletişim, aposematic av sinyalleri ve hayvanların renk kullanımı diğer bağlamları kendi çalışmalarına bizim yöntemleri adapte olabilir araştırmacılar çok çeşitli yararlı olmalıdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
CO2 tankı	AirGas (Radnor, PA)	#CD 50	ila anestezi örümcekleri
Emaye boya inceltici	Testors (Vernon Hills, IL)	75611792569	ince emaye boya
Düz emaye boya	Testors (Vernon Hills, IL)	kırmızı: 075611115009, siyah: 075611114903, beyaz: 075611116808	emaye boya inceltici ile inceltilebilir
Işık mikroskobu	Zeiss (Jena, Almanya)	Stemi 508	küçük alanları hassas bir şekilde boyamak için
Işık mikroskobu kamera	Zeiss (Jena, Almanya)	için manipülasyondan önce ve sonra fotoğraf çekmek için	Axiocam 105 renk
Işık mikroskobu kamera yazılımı	Zeiss (Jena, Almanya)	Manipülasyondan önce ve sonra çekilen resimleri işlemek için	Zen 2 blue edition
Sıvı astar eyeliner, gölge " Sapıklık"	Urban Decay (Costa Mesa, CA)	(üretilmiyor)	su ile inceltilebilen su geçirmez olmayan eyeliner; eyeliner 2
MegaLiner likit eyeliner, siyah	WetnWild (Los Angeles, CA)	SKU# 871A	su ile inceltilebilen, su geçirmez olmayan eyeliner; eyeliner 1
alanların hassas bir şekilde boyanmasını sağlamak için	MicroMark (Berkeley Heights, NJ)	#84648	fırçalar
Sertleşmeyen modelleme kil	Van Aken International Claytoon (North Charleston, SC)	18165	küçük çivi veya böcek pimi sokmak ve açılarını esnek bir şekilde ayarlamak için
Küçük çivi veya böcek montaj pimleri	BioQuip (Rancho Dominguez, CA)	#1208B7	örümcekleri yapıştırmak ve örümcekleri uzaklaştırmak için Boyamak için alanın önündeki ekler Boya
ve tineri doğru kıvamda karıştırmak için	çıtçıtlı böcek toplama şişeleri	BioQuip (Rancho Dominguez, CA)	#8912
Küçük şırınga	Fisher Scientific	1482910F	az miktarda emaye tineri aktarmak için
Spectralon beyaz standart	Labsphere Inc. (North Sutton, NH)	WS-1-SL	Renklerin spektral özelliklerini ölçmek için
UV-VIS spektrofotometresi	Ocean Optics (Dunedin, FL)	Renklerin spektral özelliklerini ölçmek için	PX-2 (ışık kaynağı) ile USB 2000 (spektrofotometre)
Suda çözünür okul	tutkalı Elmer's (High Point, NC)	#E304	örümcekleri bir çiviye/pime monte etmek için
Ahşap kürdan	Up& Yukarı, Target Corporation (Minneapolis, MN)	# 253-05-0125	emaye boya damlalarını aktarmak için