Yöntem makalesi

Insan kanı mutasyonel yük ve Clonal bileşimi karakterize

9.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/59846

⸱

11 Temmuz 2019

 ,  ,  , 
1Princess Máxima Center for Pediatric Oncology

Bu makalede

Özet

Hücrelerdeki somatik mutasyon desenleri önceki mutajenik pozlamayı yansıtır ve gelişimsel soy ilişkilerini ortaya çıkarabilir. Burada sunulan bir metodoloji Katalog ve bireysel hematopoetik kök ve Progenitör hücrelerde somatik mutasyonları analiz etmektir.

Özet

Hematopoetik kök ve progenitör hücreler (hspcs), lösemi gibi yaşlarla ilişkili hastalıklara katkı sağlayan bir ömür süresince DNA mutasyonları giderek birikir. Mutasyon birikimi karakterize yaşlılık ilişkili hastalıkların etiyolojisi anlayışını artırabilir. Burada sunulan bireysel hspcs içinde somatik mutasyonlar Katalog için bir yöntemdir, tüm genom sıralamaları dayanmaktadır (WGS) klonal primer hücre kültürlerinin. Orijinal hücrede bulunan mutasyonlar, klonal kültürdeki tüm hücreler tarafından paylaşılır, ancak hücre sıralamadan sonra in vitro olarak elde edilen mutasyonlar hücrelerin bir alt kümesinde bulunur. Bu nedenle, bu yöntem, yaşam sırasında biriken bireysel HSPCs genomları mevcut somatik mutasyonların doğru tespiti için izin verir. Somatik mutasyonların bu katalogları, hematopoetik dokuda aktif olan mutasyonel süreçlere ve bu süreçlerin lötekjenlere nasıl katkıda bulunmasına ilişkin değerli öngörüler sağlayabilir. Buna ek olarak, aynı bireyin birden çok HSPCs arasında paylaşılan somatik mutasyonları değerlendirerek, klonal soy ilişkileri ve kan nüfuslarının nüfus dinamikleri tespit edilebilir. Bu yaklaşım tek hücrelerin in vitro genişlemesine dayandığı için, yöntem yeterli çoğalan potansiyele sahip hematopoetik hücrelerle sınırlıdır.

Giriş

Hematopoetik kök ve progenitör hücrelerinin (hspcs) endojen veya ekstrensek mutajenik kaynaklara maruz kalması,1ömrü boyunca DNA 'daki mutasyonların kademeli olarak birikmesine katkıda bulunur. Hspcs1 ' deki kademeli mutasyon birikimi, lösemi-sürücü mutasyonları taşıyan hspcs tarafından tahrik edilen semptomatik olmayan bir durum olan yaşla ilgili klonal hematopoezinin (Arch)2,3' te sonuçlanabilmektedir. Başlangıçta, kemer ile bireylerin lösemi için artan bir risk olduğunu düşünülmektedir2,3. Ancak, son çalışmalar eski bireyler4arch% 95 bir insidansı göstermiştir, malignite daha az net ile dernek yapma ve neden Arch ile bazı bireyler sonunda ya da malignite geliştirmek değil neden soru yükselterek. Yine de, HSPCs 'deki somatik mutasyonlar ciddi sağlık riskleri teşkil edebilir, Miyelodisplastik bozukluklar ve lösemi belirli kanser sürücüsü mutasyonlarının varlığı ile karakterize edilir.

Mutasyonel süreçleri tanımlamak ve kan klonallık incelemek için, bireysel HSPCs mutasyon birikimi karakterize edilmesi gerekir. Mutasyonel süreçler genom, sözde mutasyon imzalarında karakteristik desenler bırakmak, hangi tespit edilebilir ve mutasyonlar genom genelinde koleksiyonları nicelik5. Örneğin, UV ışığa maruz kalma, alkilleyici ajanlar, ve DNA onarım yolları kusurları her biri farklı bir mutasyonel imza ile ilişkilidir,6,7. Buna ek olarak, mutasyon birikiminin Stokastik doğası nedeniyle, elde edilen mutasyonların çoğu (değilse) hücreler arasında benzersizdir. Mutasyonlar aynı bireyin birden çok hücre arasında paylaşılır, bu hücrelerin ortak bir üst8paylaştığı gösterir. Bu nedenle, paylaşılan mutasyonları değerlendirerek, Lineage ilişkileri hücreler arasında tespit edilebilir ve bir gelişimsel soy ağacı şube tarafından inşa edilebilir. Ancak, fizyolojik olarak normal hücrelerdeki nadir somatik mutasyonları kataloglama, sağlıklı dokularda poliklonal doğası nedeniyle Teknik olarak zordur.

Burada sunulan bir yöntem doğru tanımlamak ve bireysel HSPCs genomları somatik mutasyonlar belirlemek için. Bu, HSPCs in vitro yalıtım ve klonal genişleme içerir. Bu klonal kültürler orijinal hücrenin genetik makyajını yansıtmaktadır (yani orijinal hücredeki mutasyonlar kültürdeki diğer tüm hücreler tarafından paylaşılacaktır). Bu yaklaşım, tüm genom sıralamaları (WGS) için yeterli DNA elde etmemizi sağlar. Daha önce klonal kültürü sırasında in vitro olarak birikmiş mutasyonların hücrelerin bir alt kümesi tarafından paylaşılacak olduğunu gösterdik. Bu, tüm in vitro mutasyonların filtrelenmesini sağlar, çünkü in vivo elde edilen mutasyonlar9' a kıyasla daha küçük bir parça okunacak. Önceki yöntemler tüm genom amplifikasyon (WGA)10kullanarak WGS için tek bir hücreden yeterli DNA elde etmiştir. Ancak, WGA ana dezavantajı genom nispeten hata eğilimli ve dengesiz amplifikasyon olduğunu, hangi allel bırakma neden olabilir11. Bununla birlikte, bu yaklaşım tek hücrelerin in vitro genişlemesine dayanır gibi, WGA bağımlı yöntemler için değil, yeterli çoğalan potansiyel ile kan hücreleri ile sınırlıdır. Klonal kültürlerin sıralanması önceki çabaları tek hspcs12klonal amplifikasyon sağlamak için besleyici katmanları kullanarak güvenerek. Ancak, besleyici katmanlardan DNA potansiyel olarak klonal kültürlerin DNA 'sını kirleterek, sonraki mutasyon çağırma ve filtreleme işlemini karıştırabilir. Burada sunulan yöntem sadece CL, tek HSPCs genişletmek için belirtilen orta dayanır ve bu nedenle DNA kontaminasyonu sorununu önler. Bugüne kadar, bu yöntem insan kemik iliği, kordon kanı, viably dondurulmuş kemik iliği ve periferik kan üzerinde başarıyla uyguladıysanız.

Protokol

Numuneler uygun etik protokollerine uygun olarak elde edilmelidir ve bağışçılar prosedürden önce bilgilendirilmiş onay vermelidir.

1. örnek malzemenin hazırlanması

Not: Taze elde edilen malzeme ile çalışırken, adım 1,1 ile başlayın. Dondurulmuş malzeme ile çalışırken, adım 1,2 ile başlayın.

  1. Taze kemik iliği, kordon kanı veya periferik kan hazırlanması
    1. Üreticilerin talimatlarını izleyerek yoğunluk gradyan ayrımı kullanarak numunenin mononükleer kesir izole ( malzeme tablosunabakın), ve bir hemocytometer kullanarak mononükleer hücreleri saymak. Mononükleer hücrelerin yalıtım sonra adım 1,3 ile devam edin.
    2. Isteğe bağlı: HSPCs tam bir 384 iyi plaka sıralamak için gerekli hücrelerin önerilen sayısı 1 – 2 x 107' dir. Yoğunluk degrade santrifüjleme sırasında daha fazla hücre yalıtılmış ise, sıvı nitrojen hücrelerin fazlalığı saklayın.
    3. 1 x 107 hücre başına 500 ΜL imdm +% 10 FBS hücrelerinde yeniden resuspend ve 1 ml ımdm + 20% FBS + 10% DMSO 'da 1x 107 hücrenin askıya alınmasını sağlamak için% +% 30 FBS +% 20 DMSO 'lik bir eşit hacmine Drop-by-Drop ekleyin.
    4. Hemen mononükleer hücreleri 1 mL kriyojenik şişeler ve donma hücreleri-80 ° c kontrollü-Rate hücre donma konteyner gecede. Sonraki gün daha fazla işleme üzerine sıvı azot depolama için hücreleri aktarın.
  2. Dondurulmuş mononükleer hücreler kemik iliği, kordon kanı veya periferik kan hazırlanması
    1. 50 mL 'Lik Iscove 'un modifiye kartal Orta (ıMDM) ve 5 mL fetal sığır serumu (FBS) ile 45 mL içeren hücre çözme ortamını hazırlayın ve 37 °C ' lik su banyosundan sıcak alın.
    2. Numune içeren şişeyi sıvı nitrojen deposundan alın, numuneyi kuru buza aktarın ve 37 °C ' lik su banyosunda mümkün olduğunca çabuk çözüler.
    3. Örnek neredeyse çözülmüş olduğunda,% 70 etanol ile şişe silin ve bir 50 mL konik tüp içeriğini aktarmak. Kalan hücreleri toplamak için 1 mL ön ısıtılmış ıMDM +% 10 FBS ile şişeyi durulayın ve bu çözelti damlalı (damla başına 5 s) çözünen numuneye hafifçe tüp yuvarlanırken ekleyin.
    4. Ek bir ön ısıtılmış ekleyin 15 ml ımdm + 10% FBS dropwise örnek yavaşça tüp dönen ederken.
    5. 350 x g'de 5 dakika santrifüjleme ile hücreleri Pellet.
    6. Supernatant ancak ± 3 mL kaldırın. Geri kalan süpernatant ve seyreltici hücrelerinde 20 ml ımdm + 10% FBS damla-by-Drop ile hafifçe tüp sallayarak yeniden resuspend.
    7. Hücre sayımı için 10 μL hücre süspansiyonunu alın. Bu 10 μL 'ini% 20 μL% 0,4 tripan mavi çözelti ekleyerek seyreltin ve hücreleri hemokytometer kullanarak sayabilirsiniz. Çözme işleminden sonra% 50 ' e kadar hücre kaybı ile, hücre numarası Çözüleme üzerine azalabilir. Hücre canlılığı% 70 ve% 90 arasında değişir.
  3. Kemik iliği veya göbek kordon kan hücreleriyle çalışıyorsanız, MSC kültürü için 5 x 106 mononükleer hücre alın (adım 2,1). Periferik kan ile çalışıyorsanız, T-Cell izolasyonu için 2 – 5 x 106 hücre alın (adım 2,2)
  4. Pellet kalan hücreler 5 dk 350 x g ve pelletini 3 ml FACS tampon (0,05% BSA + 1 mm EDTA PBS).
  5. 1 x 105 hücresi, Akış sitometrisi (adım 3,8) için negatif bir kontrol olarak hizmet verecek ve buz üzerinde tutmak, 200 ΜL FACS tampon ile dolu bir mikrotüp aktarın.

2. hücre kültürü

Not: Somatik olarak elde edilen mutasyonların kataloglarını elde etmek için, donöre özgü germline varyasyonunun filtrelenmesi gerekir. Kemik iliği biyopsileri veya göbek kordon kanı ile başlayarak, mezenkimal stromal hücreler (MSCS) germline varyasyonu için filtre uyumlu kontrol olarak kullanılabilir. Bu durumda, 2,1 bölümünü izleyin. (Seferber) periferal kan kullanırken adım 2,2 yalıtmak ve T-hücreleri eşleşen kontrol örneği olarak germline varyasyonu için filtre kullanmak için izleyin (Şekil 1). Toplu T hücresi popülasyon aynı Lineage ilişkiyi HSPCs olarak paylaşır.

  1. MSC kültürü
    1. Hazırlamak 50 mL MSC orta içeren 45 mL DMEM/F12 orta, 10% FBS, 500 μL tripsin veya tripsin alternatifi, ve 500 μL penisilin/streptomicin çözeltisi.
    2. Plaka yaklaşık 5 x 105 mononükleer hücreler 1,5 ml msc orta başına iyi. % 5 CO2Ile 37 °c ' de nemlendirilmiş bir kuluçte hücreleri yerleştirin.
    3. 24 saat sonra orta değiştirin ve daha sonra tüm hematopoetik hücrelerin yıkanır sağlamak için her 3 günde bir orta değiştirin. Konfluency% 100 kadar kültüre devam edin.
    4. MSCS confluent ise, 1 ml PBS ile hücreleri yıkayın ve 200 μL tripsin veya tripsin alternatifi ekleyerek MSCS hasat iyi. 37 °C ' de 5 dakika boyunca hücreleri kulyın. 800 μL MSC orta ekleyin ve hücreleri kuyu plakasını gevşetmek için yukarı ve aşağı pipet.
    5. MSCs 'i mikrosantrifüjten tüpe aktarın ve 350 x g'de 5 dakika santrifüj yoluyla hücreleri Pelet. Süpernatant çıkarın ve DNA yalıtımı ile devam edin veya daha sonra DNA yalıtımı için-20 °c Pelet saklayın (Bölüm 4).
  2. T hücresi yalıtımı
    Not: (Seferber) periferik kan kullanıldığında, T-hücreleri izole edilebilir ve germline kontrol olarak kullanılabilir.
    1. 100 μL Anti-CD3 boyama çözeltisi (1:100 FACS tampon Anti-CD antikor seyreltme) içinde hücre Pelet resuspend.
    2. 1 mL FACS tampon ekleyerek hücreleri yıkayın. 350 x g 'de 5 dakika santrifüjleme ile hücreleri Pellet ve 300 μL FACS tampon içinde pelletini.
    3. 1 mL FBS ile önceden dolu 5 mL polistiren tüpte bir FACS-Sıralayıcı kullanarak en az 5 x 105 CD3 + hücreleri yalıtın.
    4. Sıralı hücreleri 350 x g'de 5 dakika santrifüjleme kullanarak Pelet, supernatant çıkarın ve doğrudan DNA yalıtımı (Bölüm 4) ile devam edin veya daha sonra DNA yalıtımı için-20 °c ' de Pelet saklayın.

3. HSPC yalıtım, sıralama ve kültür

  1. 1 – 2 x 107 mononükleer hücrelerde 5 dakika 350 x g ve pelletini içinde 50 μL FACS arabelleğinde Döndür (bkz. Adım 2.2.1). Hücreleri mikrosantrifüjler tüpüne aktarın.
    Not: > 2 x 107 hücrelerle sıralama yaparken, antikor karışımı ve FACS tampon hacimlerini buna göre artırın.
  2. Tablo 1' de görülen reçeteye göre 50 μL 2x HSC boyama karışımı hazırlayın.
Antikorses düzeyi [μL]
BV421-CD345
FITC-Lineage Mix (CD3/14/19/20/56)5
PE-CD382
APC-CD900,5
PerCP/Cy 5.5-CD45RA5
PE/Cy7-CD49f1
FITC-CD161
FITC-CD115
FACS tampon25,5

Tablo 1: HSC sıralama karışımı. Gösterilen, HSCs 'yi sıralamak için kullanılan antikorların seyreltilmeleri gösteren bir tablodir.

  1. Mix 50 μL hücre çözeltisi ile hazırlanan HSC boyama karışımı ve hücreleri 15 dakika oda sıcaklığında (RT) veya 1 saat buzda bağlamak için antikor için inküsleme.
  2. 350 x g'de 5 dakika santrifüpleme ile 1 ml FACS tampon ve Pelet ekleyerek hücreleri yıkayın.
  3. 300 μL FACS buffer hücrelerinde yeniden resuspend ve hücre süspansiyonu bir 35 μm hücre süzgeci-capped 5 mL polistiren tüp aracılığıyla filtre floresan-aktif hücre sıralama (FACS) önce hücre kümeleri kaldırmak için.
  4. Hazırlamak 25 mL HSPC kültür orta, oluşan 1x SFEM orta ile tamamlayıcı 100 ng/mL SCF, 100 ng/ml Flt3, 50 ng/ml TPO, 10 ng/ml Il-3, 20 ng/mL Il-6, ve 100 ng/ml antibiyotik formülasyonu (bkz. malzeme tablosu).
  5. Her kuyunda 75 μL HSPC kültür ortamı ile 384 iyi hücre kültürü plakasını doldurun.
    Not: Dış kuyularda orta buharlaşma önlemek için, 75 μL steril su veya PBS ile dış kuyuları doldurun ve hücre sıralama için bu kuyuları kullanmayın.
  6. Tek HSPCs sıralama
    1. HSPC sıralamanın kapılarını, lekelenmeli bir denetime (adım 1,9) ve lekelenmiş örnekteki 10.000 hücrelere göre ayarlayın. Kapı ayarı için temsili bir sonuç Şekil 1' de tasvir edilir. Doğrusal FSC-yüksekliği vs FSC-alan kesir etrafında bir kapı çizerek tek hücreler kapısı. Lineage- kesir için kapı çizmek için lekelenmiş kontrol kesir kullanın. CD34+ hücreler için kapılar ÇIZIN ve CD38- CD45RA- hücreler için belirli bir kapı ayarlayarak bu alt kümesini daha fazla karakterize edilir.
    2. 384 iyi plakayı FACS makinesine yükleyin ve tek hücreleri sıralayın.
      Not: FACS-Machine için geçerliyse, sıralanmış hücrelerin yeniden izlemeyi etkinleştirmek için Dizin sıralama verilerini tutmak için seçeneğinde geçiş yapın.
  7. Tek sıralı HSCs 'nin çeşitlenmesi
    1. 384 iyi plakayı,% 5 CO2ile nemlendirilmiş 37 °c inkükoye doğrudan aktarın.
      Not: Kültür sırasında buharlaşma önlemek için, Şeffaf Polietilen Wrap 384 iyi kültür plaka (kapak ile) sarın.
    2. Görünür klonlar görünene kadar 3 – 4 hafta boyunca 384 iyi plakayı kuluçta tutun. Klonal kültürün temsili görüntüleri Şekil 2' de tasvir edilir. Giriş malzemesinin durumuna göre% 5 – sıralanmış hücrelerin% 30 ' unu klonal olarak genişletecektir.

4. HSPC klonlar hasat

  1. 4 haftalık kültür sonrası, hangi kuyuların% 30 veya daha yüksek bir konflukans olduğunu belirleyin.
  2. Pre-Fill (her klonal büyüme için) 1,5 ml mikrotüpler ile 1% 1 ml BSA PBS ve etiket karşılık gelen iyi göre tüp.
  3. Pipet ucuna yapışan hücrelerin sayısını en aza indirmek için PBS 'de% 1 BSA ile Pipet ucunu önceden ıslatın.
  4. Bir 200 μL pipet (75 μL olarak ayarlanmış) ile iyi şiddetle (en az 5 kez) orta yukarı/aşağı Pip ve kuyunun altındaki hücreleri gevşetmek için iyi alt kazımak ve etiketli mikrotüp iyi karşılık gelen hücre süspansiyonu toplamak.
  5. PBS 'de 75 μL 'ye kadar taze 1% BSA alın ve hücrelerin maksimum alımı için kuyunun içinde tekrar pipetleme yapın.
    Not: CL, kültürlü hücreler iyi altına yapışabilir. Tüm hücrelerin toplanan olup olmadığını sağlamak için standart ters ışık mikroskobu kullanarak kuyuları inceleyin.
  6. >% 30 ' lık tüm kuyular hasat edilmiş ise, 384 iyi plakayı geri kuluçte yerleştirin. Clonal kültürler 5 haftaya kadar çoğalabilir.
  7. 350 x g'de 5 dakika boyunca hücre süspansiyonunu aşağı döndürün. Küçük bir Pelet görünür olmalıdır.
  8. Yaklaşık 5 μL supernatant ama dikkatle kaldırın. Hücre pelalları-20 °C ' de dondurulabilir ve DNA yalıtımı öncesinde birden çok ay boyunca saklanır.

5. DNA yalıtımı

  1. Aşağıdaki ayarlamalar ile üreticinin talimatına göre mikro ölçekli DNA yalıtım kiti kullanarak HSPC ve MSC/T-Cell DNA 'Sı yalıtın:
    1. 2 μL RNase A ek arabellek AL Bölüm 2 sırasında ekledikten sonra ekleyin. Proteinaz K eklenmeden önce 2 dakika boyunca inküye yapın.
    2. 10 dakika yerine 56 °C ' de 30 dakika boyunca Inküye yapın.
    3. Düşük EDTA (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA) ile 50 μL TE tampon ile sütunu yükleyerek DNA 'Yı elute. Optimum elüsyon için, tekrar sütun ve spin tekrar yıkantıdaki yeniden.
  2. Kopya başına 2 μL ölçüm DNA 'sı kullanarak DNA konsantrasyonu belirleyin. DNA verimi genellikle 0,5 – 3 ng/μL arasında değişmektedir.

6. sıralama

  1. Jager ve al.13 tarafından AÇıKLANDıĞı şekilde DNA sıralaması gerçekleştirin

7. haritalama ve somatik mutasyon arama

  1. Sıralamanın çıktısını (FASTQ dosyalarının) referans genomuna eşleştirin ve Jager ve al.13 ' te açıklandığı gibi mutasyonlar çağırın
  2. Denetim-freec14gibi bir kopya numarası analiz aracını kullanarak sıralı klon ve toplu verilerdeki anormal karyoktifik değişikliklerin verilerini inceleyin. Şimdiye kadar, karyotifik aberrances ile herhangi bir HSPCs rapor değil.
  3. Daha önce13' ün açıklandığı gibi, kendi numune kümesine göre filtreleme amacıyla benzersiz normal örneklerin bir panelinden oluşan bir kara liste oluşturun veya aşağıdaki yüklenen Blacklist 'i kullanın: < https://Data.Mendeley.com/datasets/9y4yhwt5rp/3 >.
  4. SNVFı < https://github.com/toolsvanbox/snvfı > kullanarak tek nüklemotid varyasyonları filtreleyin.
    1. Önceden belirlenmiş SNVFI. config dosyası, yardımcı işlevlerin tüm yolları doğrudur.
    2. SNVFı, ek dosya 1 ' de (snvfı. ini) görülen ayarlara göre yapılandırılan. ini dosyasını çalıştırın. İn vitro indüklenen mutasyonları dışlamak için biz bir VAF ≥ 0,39filtre.
  5. Snvfı 'nin varyant allel fraksiyonu (VAF) çıkışını kontrol edin (Şekil 4). Yoğunluklu Plot Peak 0,5 yakın olup olmadığını kontrol edin, örnek klonal olduğunu gösterir.
  6. Isteğe bağlı: Filtreleme sırasında kapsanan genomun bir kısmını belirlemek için, germline boyunca çağrılabilir bölgeleri belirleyin ve GATK (genom analiz Toolkit) ' den callableloci kullanarak kontrol yapın:
    Java-Jar GenomeAnalysisTK. jar \
    -T CallableLoci \
    -R referansı. fasta \
    -Ben myreads. bam \
    -Özet Table. txt \
    -o callable_status. yatak
  7. Isteğe bağlı: Callable bölgeleri callableloci çıktısının almak ve örnekleri ve Python komut dosyası CallableLoci_processor. py mevcut https://github.com/ToolsVanBox/CallableLoci_processor adresindeki kullanarak toplu arasında ikili kavşak gerçekleştirin . Elde edilen yatak dosyaları, snvfı çıkışını daha fazla filtrelemek ve Bölüm 9 ' daki mutasyonal profilini incelemek için kullanılabilir:
    CallableLoci_processor. py dir_in dir_out sample_name bulk_name – örnekler sample1 sample2 sample3

8. INDEL arama

  1. Tüm eklemeler ve silmeleri (ındels) GATK SelectVariants kullanarak raw_variants. vcf dosyasında seçin:
    Java-Xmx12G \
    -jar GenomeAnalysisTK. jar \
    -T SelectVariants \
    -R reference_genome. fasta \
    -V raw_variants. vcf \
    -o raw_INDELs. vcf \
    -selectType ıNDEL
  2. INDELFI < https://github.com/ToolsVanBox/INDELFI > kullanarak Filter raw_INDELS. vcf listesi:
    Perl INDELFI.pl-i Input. vcf (adım 8,1) \
    -s sütun test örneği \
    -c sütun kontrol örneği

9. mutasyonel profil kontrolü

  1. Genomik mutasyonal profilini çözümlemek için adım 7,6 (veya isteğe bağlı çağrılabilir loci analizi ile adım 7,9) gelen snvfı çıktısının elde edilen. vcf dosyalarını kullanın, mutationalpatterns15: < http://biyoconductor.org/packages/Release/bioc/HTML/mutationalpattern.html > R paketini kullanarak müsimat türleri ve imza analizi. 96-trinucleotide mutasyonel spektrum gibi elde edilen. vcf dosyası ile üretilebilen temsili çıkış için bkz: Şekil 5.

10. temel değişimler kullanarak gelişimsel soy ağacının inşaatı

  1. Gelişimsel bir soy ağacı oluşturmak için, klonlar arasında paylaşılan mutasyonları algılayın. İlk dalları içinde mevcut mutations Lineage ağaç da subcl, toplu örnek (MSCs/T-hücreler) mevcut olabilir. Daha sonra dallanma soy yalnızca hspc klonlar tarafından paylaşılan mutasyonlar tarafından tanımlanır.
  2. Klonlar ve subcl, toplu olarak mevcut bir alt kümesinde bulunan mutasyonlar tanımlamak için aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
  3. Klonlar arasında paylaşılan somatik mutasyonları filtrelemek için filterSomatic.py komut dosyasını Unix tabanlı bir terminalde çalıştırın. Script https://github.com/ToolsVanBox/filterSomaticadresinde bulabilirsiniz. Bu komut dosyasını çalıştırmadan önce, yolları ayarlamak ve diğer parametreleri ayarlamak için filterSomatic. ini dosyasını düzenleyin ( ek dosya 2' ye bakın).
  4. Run filterSomatic.py (python3 filterSomatic.py-i filterSomatic. ini).
  5. Subcl, Determine_lowVAF_bulk kullanarak toplu olarak mevcut mutasyonlar için filtre. Unix tabanlı bir terminalde R komut dosyası. Script https://github.com/ToolsVanBox/Identify_lowVAF_bulk_mutsadresinde bulabilirsiniz. Bu, paylaşılan ve benzersiz SNVs için ayrı. vcf dosyaları oluşturur:
    Rscript Determine_lowVAF_bulk. R
    --VCF Path/to/Filter_somatic_output. vcf
    --toplu bulk_name
    --sample_name örnek-adı
    --cinsiyet [M | F
    --out_dir out_dir
  6. Tüm mutasyonlar, tüm mutasyon pozisyonları (sütun 1 ve 2 SNVFı çıktısı bitişik) çakışan tarafından toplu örnekte mevcut olmayan klonlar arasında paylaşılan belirleyin.
  7. 10,5 ve 10,6 adımlar sırasında elde edilen yanlış pozitivleri ıGV16kullanarak manuel muayene ile hariç tutun. Mutasyonlar mevcut değilken yanlış olarak kabul edilir, mutasyon germline varsa veya kötü eşleştirilen bölgelerde mevcut olduğunda, Şekil 7' ye bakın.
    Not: Biz son derece bağımsız olarak hedeflenen veya Sanger sıralama kullanarak tüm paylaşılan loci yeniden sıralamayı öneririz.
  8. 10,1 ve 10,2 adımlar sırasında elde edilen paylaşılan mutasyonlar ile sıralı klonlar karşı ikili bir tablo oluşturmak için kullanın, 0 ile mutasyon mevcut olmadığını gösteren ve 1 mutasyonun varlığını gösteren.
  9. R kullanarak hücreler arasında Lineage ilişkileri gösteren bir dendrogram ile birlikte bir heatmap olarak mutasyon ikili tablo çıktı. Heatmap her hücre için mutasyonlar durumunu gösterir. Bu işlevin çıktısına bakın (Şekil 6).
            
    Klonlar < okuma. Table ("yol/to/BinaryTable")
            
    my_palette <-colorRampPalette (c ("#cccccc", "#333333")) (n = 2)
    col_breaks <-c (0, 0,5, 1)
            
    Heatmap. 2 (klonlar, distfun = fonksiyon (x) Dist (x, yöntem = ' ikili '),
    hekilde Fun = fonksiyon (x) hclust (x, yöntem = Ortalama),
    dendrogram = "sütun", Rowv = F,
    Col = my_palette, Breaks = col_breaks,
    Trace = "yok", yoğunluk. Info = "none")

Sonuçlar

Deneysel prosedür
Deneysel iş akışı Şekil 1' de tasvir edilir. Giriş malzemesi tipine göre farklı adımlarla takip edilmelidir. Şekil 2 ' de bir kordon kan hücresi Sıralamalı bir akış cytometrik çıkış tasvir edilir. İlk olarak, tüm Monositik hücreler bu nüfusun etrafında gevşek bir kapı çizerek seçilir. Ardından, tekli doğrusal FSC-h/FSC-a oranı olan hücreler için seçerek izole edilir, daha düşük bir FSC-h/FSC-a oranı olarak ceketleri veya hücre kümeleri içerir. Lekelenmiş denetim örneği Lineage-, CD34+, CD38-, CD45RA-için hücre sıralama kapıları tanımlamak için kullanılır. Ayrıca, CD90 ve CD49f progenitör hücreleri veya kendini yenileyen kök hücreleri17 (Şekil 2) arasında ayırt etmek için kullanılabilir. Dizin sıralama, bireysel hücrelerin Re-Tracing sağlar ve sıralanmış hücreler kahverengi noktalar olarak tasvir edilir. Hücre kültürü sırasında, bireysel klonlar farklı bir hızda genişletebilir, bazı klonlar içinde genişleyen ile 3 hafta, diğer klonlar sadece tamamen kültür beşinci haftası kadar genişletilir iken. Bkz. Şekil 3A, B temsili koloni gelişimi için. Bir temsili resim kaplama sonra 11 gün içinde neredeyse confluent MSC toplu kültürü gösterilir (Şekil 3c).

Sıralama ve mutasyon analizinden sonra kalite kontrolü
Gösterilen kopya numarası değişiklikleri (Şekil 4) kontrol etmek için Control-freec14 tarafından oluşturulan kopyalama sayısı analizinin bir örnek çıktıdır. Karyoktifik bilgiler, SNVFI çalışması sırasında hangi kromozomların dışlandığını gösterebilir (adım 7,6). Snvfı tarafından oluşturulan VAF Arsa (Şekil 5) örnekteki varyant allel frekansları bir histogram olduğunu. 0,5 de yoğunluk arsa bir zirve örnek klonal olduğunu gösterir. Mutasyonların arkasındaki biyolojik nedenlerden daha fazla bilgi almak için, bunlar R paketi MutationalPatterns15kullanılarak analiz edilebilir. Burada tasvir bir 96-trinucleotid Arsa üreten tipik bir analiz (Şekil 6). Farklı mutasyon türlerinin ölçülmesini ek olarak, bu araç ile imza çıkarma da gerçekleştirilebilir.

Gelişimsel bir soy ağacı oluşturmak
Klonlar arasında paylaşılan mutasyonlar veya bir klon içinde mevcut (ve düşük VAF) germline kontrol ıGV kullanılarak doğrulanır. Mutasyonlar, numune içinde mevcut olduğunda ve germline (şekil 7a) yüksek VAF düzeylerinde değil, gerçek olarak kabul edilir. Kötü eşleştirilen bölgelerde (şekil 7b) meydana gelen IGV 'de bulunmadığı zaman mutasyonlar yanlış olarak kabul edilir. Diğer durumlarda, SNVFı tarafından algılanan olaylar cevapsız germline mutasyonlar (Şekil 7C). Seçilen klonlar için bu mutasyonlar için hedeflenen yeniden sıralamayı kullanarak mutasyonların bağımsız yeniden sıralamaları oldukça önerilir.  Klonlar arasında paylaşılan somatik mutasyonların algılanması sonrasında, ikili matris oluşturulur (adım 10,8). Bir heatmap, paylaşılan mutasyonlar A-M içeren ve içermeyen hücreler içeren inşa edilir. Bu heatmap üzerinde gelişimsel soy ağacı belirtilir (Şekil 8).

figure-results-1
Şekil 1: giriş malzemesine dayalı deneysel prosedürü tasvir eden akış şeması. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2: hücre sıralama stratejisi. İlk olarak, küçük mononükleer hücrelerde gating gerçekleştirilir. İkinci olarak, tek hücreler doğrusal kesir seçimi ile Gated. Lineage negatif hücreler Gated. Tüm CD34+ CD38- CD45- hücreler tek hücreli-sıralanır. Kahverengi hücrelerin kesir, sıralanan hücreler seçeneği "Dizin sıralama" tarafından vurgulanan olan, unutulmamalıdır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 3: temsilci hücre kültürü sonuçları. Temsilci HSPC klonlar bir 384 iyi plaka at (a) 2 hafta kaplama sonra ve (B) 4 hafta kaplama sonra. (C) msc kültürü 2 hafta sonra orta değiştirme. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

figure-results-4
Şekil 4: karyotipler. (A) clonal HSPC kültürü ve (B) msc toplu örnek. Karyotürleri okuma-derinlik analizi ile belirlendi. Her iki grafik de karyotypically normal bir örnek gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

figure-results-5
Şekil 5: varyant allel frekansları histogram. Snvfı (VAF > 0.3) son filtreleme adımına önce bir klon varyantların varyant allel frekansları histogram. VAF 'da bir zirve = 0,5 örnek clonal olduğunu gösterir. Düşük VAF ile subclonal mutasyonlar SNVFı (VAF > 0.3) son filtreleme adımı sırasında hariç tutulur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

figure-results-6
Şekil 6: HSPC örneğinde somatik mutasyonların temsili mutasyonel spektrum analizi. Tasvir, her trinükleotid değişikine (orta üssün mutasyona uğramış olduğu) Toplam spektrumuna göreceli katkı oluşturmaktadır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

figure-results-7
Şekil 7: ıGV16kullanarak mutasyonların manuel olarak incelenmesi. (A) mutations klonlama ve toplu örnek içinde mevcut olduğunda doğru olarak kabul edilir. (B) mutations kötü eşleştirilen bir bölgede mevcut olduğunda yanlış pozitis olarak kabul edilir. (C) mutasyonlar, germline denetiminde mevcut olduğunda yanlış pozitif olarak kabul edilir. Dikey çizgi, adlandırılan mutasyonun konumunu gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

figure-results-8
Şekil 8: gelişimsel soy ağacının inşası. Tasvir bir dendrogram gelişimsel kökleri geliştirme sırasında bölme gösteren olduğunu. Dendrogram altında heatmap farklı klonlar içinde mutasyonların varlığını gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Tartışma

Burada sunulan, bireysel hkms 'de yaşam sırasında birikmiş mutasyonları tespit etmek ve bu mutasyon verilerini kullanarak erken gelişimsel soy ağacı oluşturmak için bir yöntemdir.

Bu işlemleri başarıyla gerçekleştirmek için birkaç kritik gereksinim karşılanması gerekir. İlk olarak, numunenin canlılığı sağlanmalıdır. Numunenin hızlı işlenmesi, prosedürün verimliliğini sağlamak için anahtardır. İkinci olarak, büyüme faktörü gücü kaybı HSPCs 'in klonal genişlemesini olumsuz yönde etkileyecektir. Yüksek büyüme faktörü potens sağlamak için, donma-çözülme döngüleri önlemek ve tek kullanımlık aliquots hazırlamak önemlidir. Üçüncü, WGS yaptıktan sonra, mutasyon arama ve filtreleme, klonal kültürün klonallık doğrulamak için çok önemlidir. Kültürün klonallık onaylamak için, mutasyonların VAF etrafında küme olmalıdır 0,5 karyotypically normal bir örnek (Şekil 3). Kordon kanı HSPCs gibi düşük mutasyonel yükü olan hücrelerde, düşük mutasyon numaraları nedeniyle klonallık belirlemek daha zordur.

Yaklaşımımız WGS için izin vermek için tek hücrelerin in vitro genişlemesine dayanır. Bu nedenle, yaklaşımımız, HSPCs gibi genişletmek için çoğallandırıcı potansiyele sahip hücrelere sınırlıdır. Bizim elimizde, tüm tek sıralı hücrelerin yaklaşık% 5-30% yeterince genişletmek edebiliyoruz. Azaltılmış büyüme oranları olası bir seçim önyargı neden olabilir. Daha önce de anlatıldığı gibi, bu teknik hücrelerin genişlemesine güvenmiyorsa, WGA kullanan Yöntemler bu seçim önyargı üstesinden gelebilir. Ancak, WGA kendi eksiklikleri vardır, ve klonal amplifikasyon doğru tüm genom içinde allelik bırakma ve genom boyunca eşit kapsama olmadan mutasyonların sayısını belirlemek için tek yöntem kalır, özellikle düşük gerçek somatik örnekleri mutasyon numaraları.

Bu yaklaşım kullanılarak oluşturulan veriler, tek hücrelerde algılanan mutasyonlar, Şekil 6' da tasvir edilen hücre sırlarını incelemek için kullanılabiliyor olduğu için, hematopoetik sistemin phylogenlerini belirlemek için kullanılabilir. Tipik olarak, bir veya iki mutasyon sağlıklı bir bağışçı1her şube tanımlayabilir. Bu yana, ilk dalları tanımlayan mutasyonlar, germline türevleri1,18,19filtreleme için kullanılan eşleşen normal örnekteki düşük VAF ile de mevcut olacaktır. Bu durumda, onlar hematopoetik sistemden gelişimi sırasında çok erken ayırmak için bekleniyor olarak MSCs gibi olmayan-hematopoetik hücrelerin kullanımı, tercih edilir. T-hücreler hematopoetik Orijin olduğu için, bu hücrelerin, germline türevleri filtrelemek için eşleşen normal bir örnek olarak kullanımı, bu nedenle gelişimsel soy ağacının en erken dallanma yapımında konabilir. Belirli olgun kan nüfusa şube özgü mutasyonların subclonal varlığı, hangi hedeflenen derin sıralamayı ile ölçülebilir, bu şube gençliğinde bu olgun hücre türüne yol verebilir gösterecektir. Buna ek olarak, yaklaşımımız, mutajisik pozlama içinde vivo ve sonuçta bunun lösemi gelişimine nasıl katkıda bulunabileceği mutasyonel sonuçları değerlendirmek için izin verir.

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu çalışmada Hollanda bilimsel araştırmalar Örgütü (NWO) (No. 016. vidi. 171.023) için R. v. B 'ye ait bir VIDI hibe tarafından destekleniyordu.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.20 ve mikro; m şırınga filtresiCorning431219
50 mL Şırınga, Luer kilidiBD613-3925
Sığır Serum Albümini (BSA)Sigma-AldrichA9647-50G
CD11c FITCBioLegend301603Klonu 3.9
CD16 FITCBioLegend302005Klonu 3G8
CD3 BV650Biolegend300467Klonu UCHT1
CD34 BV421BioLegend343609561
CD38 PEBioLegend303505Klon HIT2
CD45RA PerCP/Cy5.5BioLegend304121Klon HI100
CD49f PE / Cy7BioLegend313621Klon GoH3
CD90 APCBioLegend328113Klon 5E10
Hücre Süzgeci 5 mL tüpCorning
CELLSTAR plaka, 384w, 130 & L, F-alt, TC, kapakGreiner781182
Kriyojenik flakonCorning430487
Dimetil sülfoksit (DMSO)Sigma-AldrichD2650
DMEM / F12ThermoFisher61965059
EDTASigma-AldrichE4884-500G
Fetal Sığır SerumuThermoFisher10500
GlutaMAXThermoFisher25030081
İnsan Flt3-Ligand, birinci sınıfMiltenyi Biotech130-096-479Tek kullanımlık alikotlarda yeniden yapılandırma (25 μ L) 100 &mu'da; PBS'de %0.1 BSA'da g / mL
İnsan Rekombinant IL-3 (E. coli eksprese edilmiş)Kök Hücre Teknolojileri78040.1Tek kullanımlık alikotlarda yeniden yapılandırma (2.5 μ L) 100 &mu'da; PBS'de% 0.1 BSA'da g / mL
İnsan Rekombinant IL-6 (E. coli eksprese edilmiş)Kök Hücre Teknolojileri78050.1Tek kullanımlık alikotlarda yeniden yapılandırma (5 μ L) 100 &mu'da; PBS Human SCF'de% 0.1 BSA'da g / mL
, birinci sınıfMiltenyi Biotech130-096-695Tek kullanımlık alikotlarda yeniden yapılandırma (25 μ L) 100 &mu'da; PBS Human TPO'da% 0.1 BSA'da g / mL
, birinci sınıfMiltenyi Biotech130-095-752Tek kullanımlık alikotlarda yeniden yapılandırma (12.5 μ L) 100 &mu'da; PBS
Integrative Genomics Viewer 2.4'te %0.1Broad Institutehttps://software.broadinstitute.org/software/igv/download
Iscove'un Modifiye Eagle's MediumThermoFisher12440061
Soyu (CD3/14/19/20/56) FITCBioLegend348701Klonları: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56
LenfoppKök Hücre Teknolojileri# 07861Yoğunluk gradyan ayırma
PBSiçin kullanılır Enstitünün tesisinde üretilmiştir. Ticari olarak temin edilebilen PBS ayrıca kullanılabilir
Penisilin-StreptomisinThermoFisher15140122
PrimosinInvivogenant-pm-1Antibiyotik formülasyonu
QIAamp DNA Mikro KitiQiagen56304
Qubit 2.0 florometreThermoFisherQ32866
Qubit dsDNA HS Test KitiThermoFisherQ32854
RNAse AQiagen19101
SH800S Hücre SıralayıcıSonySH800S
StemSpan SFEM, 500 mLKök Hücre Teknolojileri9650
TE TAMPON PH 8.0, DÜŞÜK EDTAG-Biosciences786-151
TrypLE ExpressThermoFisher12605-10
352235 BSA'da g/mL

Kaynaklar

  1. Osorio, F. G., et al. Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis. Cell Reports. 25, 2308-2316 (2018).
  2. Genovese, G., et al. Clonal Hematopoiesis and Blood-Cancer Risk Inferred from Blood DNA Sequence. New England Journal of Medicine. 371, 2477-2487 (2014).
  3. Jaiswal, S., et al. Age-Related Clonal Hematopoiesis Associated with Adverse Outcomes. New England Journal of Medicine. 371, 2488-2498 (2014).
  4. Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. Clonal haematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults. Nature Communications. 7, 1-7 (2016).
  5. Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., Wedge, D. C., Campbell, P. J., Stratton, M. R. Deciphering Signatures of Mutational Processes Operative in Human Cancer. Cell Reports. 3, 246-259 (2013).
  6. Alexandrov, L. B., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500, 415-421 (2013).
  7. Alexandrov, L., et al. The Repertoire of Mutational Signatures in Human Cancer. bioRxiv. , (2018).
  8. Behjati, S., et al. Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes. Nature. 513, 422-425 (2014).
  9. Blokzijl, F., et al. Tissue-specific mutation accumulation in human adult stem cells during life. Nature. 538, 260-264 (2016).
  10. Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: Current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17, 175-188 (2016).
  11. Dong, X., et al. Accurate identification of single-nucleotide variants in whole-genome-amplified single cells. Nature Methods. 14, 491-493 (2017).
  12. Welch, J. S., et al. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia. Cell. 150, (2012).
  13. Jager, M., et al. Measuring mutation accumulation in single human adult stem cells by whole-genome sequencing of organoid cultures. Nature Protocols. 13, 59-78 (2018).
  14. Boeva, V., et al. Control-FREEC: A tool for assessing copy number and allelic content using next-generation sequencing data. Bioinformatics. 28, 423-425 (2012).
  15. Blokzijl, F., Janssen, R., van Boxtel, R., Cuppen, E. MutationalPatterns: Comprehensive genome-wide analysis of mutational processes. Genome Medicine. 10, 1-11 (2018).
  16. Thorvaldsdóttir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): High-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14, 178-192 (2013).
  17. Notta, F., et al. Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment. Science. , (2011).
  18. Lee-Six, H., et al. Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations. Nature. 561, 473-478 (2018).
  19. Behjati, S., et al. Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes. Nature. , (2014).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Hematopoetik K k H crelerT m Genom DizilemeKlonal K lt rSomatik MutasyonlarH cre Ay klamaAk SitometrisiVaryant Alel FrekansMutasyonel mza AnaliziIntegrative Genomic Viewerkili Matris
Insan kanı mutasyonel yük ve Clonal bileşimi karakterize
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.