Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Kitosan filmlerde ınsan periodontal ligament hücre kürleri oluşumu

5.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/59855

⸱

19 Haziran 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Periodontology, School & Hospital of Stomatology, Tongji University, Shanghai Engineering Research Center of Tooth Restoration and Regeneration, 2Department of Periodontology, Dental Diseases Prevention & Treatment Center of Jiading District, 3College of Materials Science and Engineering, Tongji University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, insan periodontal bağ (PDL) hücre kürleri tarafından kitosan filmleri ile ilgili protokoller sunuyoruz. Üç boyutlu (3D) hücresel küreler kültürü geleneksel doku kültürü Polistiren (TCPS) kültür sistemine bir alternatif sağlar.

Özet

Periodontal bağ (PDL) hücreleri periodontal doku rejenerasyonu için büyük söz tutun. Geleneksel olarak, PDL hücreleri doku kültürü Polistiren (TCPS) gibi iki boyutlu (2D) substratlar üzerinde kültürlü. Ancak, In vitro kültürü sırasında PDL hücrelerinin karakteristik değişiklikleri gözlenmiştir. Bu fenomen muhtemelen 2D TCPS in vivo üç boyutlu (3D) mikroortamdan farklıdır çünkü. 2B substratlar üzerinde kültürlü hücrelere kıyasla, bir 3D mikroortamda yetiştirilen hücreler in vivo hücrelere daha fazla benzerlik sergiler. Bu nedenle, 3D hücre kültürü modelleri geleneksel 2D Tek tabakalı hücre kültürü için umut verici bir alternatif sağlar. Geleneksel PDL hücre kültürü modellerini geliştirmek için, son zamanlarda kitosan filmleri üzerinde PDL hücrelerinin küroid oluşumuna dayanan bir 3D hücre kültürü yöntemi geliştirdik. Burada, kitosan filmlerine dayanan detaylı hücre kürü kültürü protokolleri sunuyoruz. PDL hücresel kürenin 3D kültür sistemi, geleneksel 2D Tek tabakalı hücre kültürüyle ilgili bazı sınırlamaların üstesinden gelmekte ve böylece gelecekteki periodontal doku rejenerasyonu için gelişmiş bir terapötik etkinliğine sahip PDL hücrelerini üretmek için uygun olabilir.

Giriş

Periodontitis, esas olarak dental plak1ile başlatılan, periodontal bağ (PDL), alveoler kemik ve Periodontitis için mevcut tedaviler genellikle aktif hastalığın ilerlemesini önlemede başarılı olmaktadır, ancak kayıp periodontal dokularda rejenerasyon klinik bir zorluk olarak kalır. Son zamanlarda, periodontal doku rejenerasyonu için hücre tabanlı yaklaşımlar mevcut tedaviler2,3,4dezavantajları aşmak için önemli ilerleme yapılmıştır.

Önceki sistematik incelememiz, PDL hücrelerinin periodontal rejenerasyon için büyük bir potansiyel gösterdiğini göstermiştir5. Geleneksel olarak, PDL hücreleri doku kültürü Polistiren (TCPS) gibi iki boyutlu (2D) substratlar üzerinde kültürlü. Ancak, In vitro Culture6sırasında PDL hücrelerinin karakteristik değişiklikleri gözlenmiştir. Bu fenomen muhtemelen 2D TCPs in vivo üç boyutlu (3D) mikro7farklıdır çünkü. 2B substratlar üzerinde kültürlü hücrelere kıyasla, bir 3D mikroortamda yetiştirilen hücreler in vivo hücrelere daha fazla benzerlik sergiler8. Bu nedenle, 3D hücre kültürü modelleri geleneksel 2D Tek tabakalı hücre kültürü için umut verici bir alternatif sağlar.

Konvansiyonel 3D kültür yöntemi hücreleri 3D Biyomalzemeler kapsüller. 3D biyomalzemelerde kapsüllenmiş hücreler ile karşılaştırıldığında, hücresel küreler daha yakından In vivo durumu taklit, çünkü kürüler yabancı maddelerin ücretsiz büyüyen hücrelerin toplamları vardır9,10,11, 12. hücresel KÜRLERIN msc biyofaaliyetlerini fibronektin ve laminin13dahil olmak üzere, ekstrasellüler matriks (ECM) bileşenlerinin korunması yoluyla tanıtılmasıdır. Geleneksel PDL hücre kültürü modellerini geliştirmek için, son zamanlarda kitosan filmler14PDL hücrelerinin küroid oluşumuna dayalı BIR 3D PDL hücre kültürü yöntemi geliştirdik. Küroid oluşumu PDL hücrelerinin Self-yenilenme ve osteogenik farklılaşma kapasitelerini artırmıştır14. Burada, kitosan filmlerine dayanan ayrıntılı PDL hücre kürü kültür protokolleri sunuyoruz. PDL hücresel kürenin 3D kültür sistemi, geleneksel TCPS hücre kültürüyle ilgili eksikliklerin bazılarını aşmak ve böylece gelecekteki periodontal doku rejenerasyonu için gelişmiş bir terapötik etkinliğine sahip PDL hücrelerini üretmek için uygun olabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Çalışma protokolü, Tongji Üniversitesi, okul ve Stomatoloji Hastanesi Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Tüm hastalar yazılı bilgilendirilmiş onay sağladı.

1. PDL hücre yalıtımı

  1. PDL hücrelerinin kültürü için proliferasyon ortamı yapın: α-MEM orta% 10 FCS ve 100 U/mL kalem/strep ile desteklenmektedir.
  2. İzole üçüncü Molars aktarmak için buz ile bir kap hazırlayın.
  3. Cerrahi aletleri otoklav kullanarak sterilize edin.
  4. Okul ve hastane stomatology, Tongji Üniversitesi Diş Kliniği 'nde yetişkinlerden (18-28 yaş) normal insan etkilenen üçüncü azı özü.
  5. Üçüncü azı 'ı proliferasyon ortamına yerleştirin ve 4 °c ' de laboratuara aktarın.
  6. Çıkarılan dişleri steril 100 mm Petri çanağına yerleştirin ve Biohazard laminar akış kaputu içinde çalışır.
  7. Çıkarılan dişleri yıkamak için 10 mL PBS ekleyin. Yıkama adımını iki kez tekrarlayın.
  8. Steril bir neşter kullanarak PDL 'i kökten yavaşça ayırın.
    Not: PDL diş eti veya apikal dokulardan kontaminasyonları önlemek için kökünün orta üçüncü bölümünden kazınmış olmalıdır.
  9. Sterilize edilmiş bir neşter bıçağı yardımıyla 1-2 mm 'lik parçalara Mince PDL.
  10. 3-4 mL proliferasyon ortamı ile dolu bir T-25 kültür Flask, PDL parçaları yerleştirin.
  11. 37% 5 CO2 ' de nemlendirilmiş hava ile bir kuluçte örneklerine kültür.
  12. PDL hücrelerinin gelişimi gözlemlendikten sonra kültür ortamını değiştirin. Genellikle PDL hücrelerinin gelişimi için 1-2 hafta sürer. PDL hücrelerinin ters faz kontrast mikroskobu ile gelişimini gözlemlemek.
  13. Kültür ortamını her hafta sonra iki kez değiştirin.
  14. PDL hücreleri konfluence ulaştığında, 1:4 oranı (geçiş 1) alt kültür hücreleri.
  15. Günlük hücre büyümesini gözlemlemek ve haftada iki kez kültür ortamı değiştirin.
  16. Hücreler% 80 konfluence ulaştıktan sonra 1:4 oranı her sonraki geçiş gerçekleştirin. Hücre tohumlama için üçüncü-beşinci nesil PDL hücrelerini kullanın.

2. kitosan filmlerin hazırlanması

  1. 1% (v/v) asetik asit çözeltisi hazırlanması için, temiz bir cam Beaker çift distile su 495 mL asetik asit 5 mL ekleyin.
  2. 1% w/v kitosan çözeltisi hazırlanması için, 5 g kitosan tozu (ortalama moleküler ağırlık 400 kDa,% 85 asetilasyon derecesi) tartım ve 495 mL 1% (v/v) asetik asit çözeltisi ekleyin.
  3. 60 °C ' de karıştırma çubuğu ve manyetik karıştırma plakası ile 24 saat boyunca hazırlanmış çözümü karıştırın.
  4. Kitosan tamamen çözünmesini sağlamak için hazırlanan solüsyonu autoclave.
    Not: deneme bu aşamada duraklatılabilir.
  5. Kitosan filmleri oluşturmak için 0,25 mL/cm2' de doku kültürü Polistiren (TCPs) yemeklerine% 1 w/v kitosan çözeltisi ekleyin. Örneğin, 0,5 mL 'ye 1% w/v kitosan solüsyonu bir iyi 24 – kuyu plakasına ekleyin.
  6. 60 °C ' de fırın içinde kuru TCPS yemekleri 24 saat boyunca kitosan filmleri oluştururlar.
  7. Hazırlamak 0,5 N sodyum hidroksit (NaOH). Karıştırın 10 g NaOH, bir defada biraz, manyetik karıştırın çubuğu kullanarak çift distile su büyük bir hacim içine, ve daha sonra 0,5 L yapmak için çözüm seyreltilen.
    Not: su NaOH Ekle-katı NaOH su eklemeyin. NaOH dokunmayın! Kimyasal yanıklara neden olabilir.
  8. 0,5 N NaOH ile kitosan filmleri nötralize eder. Ekle 0,5 mL 0,5 N NaOH çözüm için bir iyi 24-kuyu plaka 2 saat.
  9. Çift damıtılmış su ile üç kez yıkama kitosan filmler.
    Not: deneme bu aşamada duraklatılabilir.
  10. Hücre tohumlama öncesinde, oda sıcaklığında gecelik% 70 alkol içinde kitosan kaplı 24-kuyu plakaları sterilize.
  11. Oda sıcaklığında PBS ile üç kez kitosan kaplı plakaları durulayın.
  12. Oda sıcaklığında bir gecede ultraviyole ışık altında tedavi ile kitosan kaplı plakaları sterilize.

3. hücre tohumlama

  1. Ön sıcak proliferasyon orta PBS çözeltisi ve Trypsin/EDTA solüsyonu 37 °C ' ye kadar.
  2. T-75 hücre kültürü Flask gelen süpernatant atın.
  3. 10 mL PBS çözeltisi ile confluent PDL hücrelerini yıkayın.
  4. PBS çözümünü atın.
  5. T-75 hücre kültürü Flask için Trypsin/EDTA çözüm 1 mL ekleyin.
  6. 37 °C ' de 3 dakika boyunca Trypsin/EDTA çözeltisi olan hücreleri inküat.
  7. T-75 hücre kültürü Flask proliferasyon orta 3 mL ekleyerek tripsin sindirim sürecini sonlandırmak.
  8. Hazırlanan hücre süspansiyonunu 15 mL konik Santrifüjlü tüpüne aktarın.
  9. Süspansiyon 300 x g ve oda sıcaklığında 5 dakika Santrifüjü.
  10. 15 ml konik Santrifüjlü tüpten süpernatant atın ve 500 μL proliferasyon Orta hücre Pelet yeniden askıya.
  11. Bir hemokytometer ile say PDL hücreleri.
  12. 0,5 x 10 4, 1 x 104, 3 x104ve 6 x 104 hücreli/cm2yoğunluklarında tohum PDL hücreleri.
  13. 37 °C ' de% 5 CO2 ' de nemlendirilmiş hava ile kuluçari filmlerinde kültür PDL hücreleri.
  14. Kültür ortamını her hafta sonra iki kez değiştirin.
  15. 1, 2, 3, 4 ve 5 günlerde, ters faz kontrast mikroskobu ile günlük hücre morfolojisi gözlemlemek.

4. hücre hayatta kalma

  1. 1, 3 ve 6 günlük kültürden sonra, ticari bir viability/sitotoksisite kiti kullanarak hücrelerin hayatta kalmasının belirlenmesi.
  2. 15 ml 'lik bir tüpte, 5 s için vortekslenir ile 2 mm calcein-am ve 4 mm etidium homodimer PBS taze bir çözelti 2 ml hazırlayın.
    Not: işlemi karanlıkta tutun.
  3. Kültür ortamını çıkarın ve PBS 'de küreler yıkayın.
  4. Karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 2 mm calcein-am ve 4 mm etidyum homodimer içeren PBS 'deki küreler içinde inküye yapın.
  5. Küreler PBS 'de iki kez durulayın. 24 kuyu plakasının bir kuyusu olan küreler için her seferinde 2 mL PBS kullanın.
  6. 10X veya 20X büyütme kullanarak floresan mikroskobu kullanarak örneklere uyun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Mevcut protokol kullanılarak, uygulanabilir PDL hücre kürleri başarıyla oluşturuldu. Şekil 1 , bağlı hücreler yerine askıya alınan hücrelerin veya kürlerin çoğunlukla kitosan filmlerinde gözlemlendiği görülmüştür. 0,5 x 104 hücreli/cm2' nin tohumlama yoğunluğu için, ekli PDL hücreleri bazen 1 ve 3 gün bulundu ve PDL hücre kürleri nadiren gözlenen. Aksine, 3 x 104 ve 6 x 104 hücreli/cm2' nin tohumlama yoğu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada, geleneksel 2D Tek tabakalı hücre kültürü ile ilgili bazı sınırlamalar aşmak için bir 3D hücre kültür sistemi tanıttı. Protokole göre PDL hücresel kürüler, kitosan filmlerinde kültür hücreleri tarafından başarıyla oluşturuldu. Önceki çalışmamızda, küresel oluşumunun PDL hücrelerinin Self-yenilenme ve osteogenik farklılaşma kapasitelerinin artması bildirildi14. TCPs gelen hücreler hasat için bir enzim kullanmak yerine, PDL hücre küreler sadece orta birkaç kez14p...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu çalışmada Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (NSFC 81700978), orta üniversiteler için temel araştırma fonları (1504219050), Şangay doğal Bilim Vakfı (17ZR1432800) ve Şangay Medikal keşif projesi ( 17411972600).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
α-MEMGibco11900-073
asetik asit Sigma-Aldrich64197
Hücre kültürü şişesi 25 cm2Corning430639
Hücre kültürü şişesi 75 cm2Corning430641
KitosanHeppe Medikal  Chitosan GmbH/molekül ağırlığı 500 kDa, deasetilasyon derecesi% 85
FCSGibco26140-079
Canlı / Ölü Canlılık / Sitotoksisite KitiMoleküler ve nbsp; ProblarL3224
NaOHSigma-Aldrich1310732
PBSKeyGen Biotech 
kalem/strepGibco15140-122
Tripsin/EDTA KeyGen Biyoteknoloji 
15 mL konik santrifüj tüpüCorning430790
24 kuyulu plakaCorning3524
KGB5001KGM25200

Kaynaklar

  1. Albandar, J. M. Epidemiology and risk factors of periodontal diseases. Dental Clinics of North America. 49 (3), 517-532 (2005).
  2. Bartold, P. M., McCulloch, C. A., Narayanan, A. S., Pitaru, S. Tissue engineering: a new paradigm for periodontal regeneration based on molecular and cell biology. Periodontology 2000. 24, 253-269 (2000).
  3. Chen, F. M., Jin, Y. Periodontal tissue engineering and regeneration: current approaches and expanding opportunities. Tissue Engineering Part B Review. 16 (2), 219-255 (2010).
  4. Yu, N., et al. Enhanced periodontal tissue regeneration by periodontal cell implantation. Journal of Clinical Periodontology. 40 (7), 698-706 (2013).
  5. Yan, X. Z., Yang, F., Jansen, J. A., de Vries, R. B., van den Beucken, J. J. Cell-Based Approaches in Periodontal Regeneration: A Systematic Review and Meta-Analysis of Periodontal Defect Models in Animal Experimental Work. Tissue Engineering Part B Review. 21 (5), 411-426 (2015).
  6. Itaya, T., et al. Characteristic changes of periodontal ligament-derived cells during passage. Journal of Periodontal Research. 44 (4), 425-433 (2009).
  7. Zhang, J., Li, B., Wang, J. H. The role of engineered tendon matrix in the stemness of tendon stem cells in vitro and the promotion of tendon-like tissue formation in vivo. Biomaterials. 32 (29), 6972-6981 (2011).
  8. Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).
  9. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
  10. Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
  11. Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
  12. Kabiri, M., et al. 3D mesenchymal stem/stromal cell osteogenesis and autocrine signalling. Biochemical and Biophysical Research Communications. 419 (2), 142-147 (2012).
  13. Lee, J. H., Han, Y. S., Lee, S. H. Long-Duration Three-Dimensional Spheroid Culture Promotes Angiogenic. Activities of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & therapeutics. 24 (3), 260-267 (2016).
  14. Yan, X. Z., van den Beucken, J., Yuan, C., Jansen, J. A., Yang, F. Spheroid formation and stemness preservation of human periodontal ligament cells on chitosan films. Oral Diseases. 24 (6), 1083-1092 (2018).
  15. Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. , (2012).
  16. LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors. Cancer Research. 64 (5), 1621-1631 (2004).
  17. Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Engineering Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
  18. Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 9176357(2016).
  19. Tong, J. Z., Sarrazin, S., Cassio, D., Gauthier, F., Alvarez, F. Application of spheroid culture to human hepatocytes and maintenance of their differentiation. Biology of the Cell. 81 (1), 77-81 (1994).
  20. Lee, W. Y., et al. The use of injectable spherically symmetric cell aggregates self-assembled in a thermo-responsive hydrogel for enhanced cell transplantation. Biomaterials. 30 (29), 5505-5513 (2009).
  21. Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
  22. Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
  23. Miyagawa, Y., et al. A microfabricated scaffold induces the spheroid formation of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and promotes efficient adipogenic differentiation. Tissue Engineering Part A. 17 (3-4), 513-521 (2011).
  24. Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
  25. Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential. Cell and Tissue Research. 347 (3), 701-711 (2012).
  26. Rabea, E. I., Badawy, M. E., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Periodontal Ligament HücreleriSferoid Oluşumu3D Hücre KültürüHücre Ekim YoğunluğuProliferasyon MedyumuTrypsin EDTAFaz Kontrast MikroskobuCanlılık AnaliziOsteojenik Diferansiyasyon
Kitosan filmlerde ınsan periodontal ligament hücre kürleri oluşumu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.