Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Rekombinant Drosophila , lipid karıştırıcılar Için lipozomlar halinde deterjan destekli yeniden yapılanma

7.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/59867

⸱

3 Temmuz 2019

 , 
1Department of BioSciences, Rice University

Bu makalede

Özet

Biyolojik membran füzyon özel füzyon proteinleri tarafından katalizlenmiş. Proteinlerin fusogenik özelliklerinin ölçülmesi lipid karıştırma özellikleri ile elde edilebilir. Biz rekombinant Drosophila atlastin arındırılması için bir yöntem sunuyoruz, ER homotypic füzyon aracılık bir protein, önceden biçimlendirilmiş lipozomlar için reconstituting, ve füzyon kapasitesi için test.

Özet

Membran füzyon ökaryotik hücrede önemli bir süreçtir. Özel proteinler füzyon katalizörler için gereklidir. Atlastins, er 'in homottifik füzyon içinde bulunan endoplazmik retikulum (er) yerleşik proteinleridir. Biz detay burada bir glutatyon S-transferase (GST) ve Poly-histidin temizleyerek için bir yöntem benzeşme Kromatografi iki tur tarafından Drosophila atlastin etiketlenmiş. Füzyon reaksiyonları içinde vitro eğitim, lipid bilayer içine yerleştirilmek üzere arıtılmış füzyon proteinlerini gerektirir. Lipozomlar ideal model membranlara sahiptir, lipid bileşimi ve boyutu ayarlanabilir. Bu amaçla, biz önceden biçimlendirilmiş lipozomlar içine Drosophila atlastin için deterjan kaldırma ile bir reanayasa yöntemi açıklanmaktadır. Çeşitli reanayasa yöntemleri mevcut iken, deterjan kaldırma ile reanayasası atlastins ve diğer benzer proteinler için uygun hale getirmek çeşitli avantajları vardır. Bu yöntemin avantajı, reconstituted proteinin yüksek reanayasa verimi ve doğru yönünü içerir. Bu yöntem diğer membran proteinleri ve proteoliposomes gerektiren diğer uygulamalar için uzatılabilir. Ayrıca, membran füzyon ölçümü olarak kullanılan proteoliposomların bir FRET bazlı lipid karıştırma tahlili açıklanmaktadır.

Giriş

Membran füzyon birçok biyolojik reaksiyonda kritik bir süreçtir. Biyolojik koşullarda, membran füzyon spontan değildir ve bu tür reaksiyonlar katalizleştirmek için özel füzyon proteinleri gerektirir1. ER homotipik membran füzyon, Dynamin ile ilgili GTPase atlastin2' ye göre hayvanlarda aracılık edilir. Homotipik füzyon atlastin rolü periferik er üç yönlü kavşak için temel, hücre boyunca uzatmak tübüllerin büyük bir bağlantılı ağ oluşturmaktadır. Atlastins, büyük bir GTPase, üç sarmal paket orta etki alanı, hidrofobik membran çapa ve kısa sitoplazmik C-Terminal kuyruğu3' ten oluşan bir korunması alan morfolojisine sahiptir. İn vitro çalışmalar rekombinant Drosophila atlastin ile lipozomlar için reconstituted, onun fusogenic özelliklerini korur göstermiştir. İnsan homologlar da dahil olmak üzere diğer atlastins, Fusion in vitro reapitulate mümkün olmamıştır. Biz burada bir GST ve poli-histidin etiketli rekombinant Drosophila atlastin arındırmak için bir metodoloji tarif, lipozomlar için reconstituting, ve füzyon iddia.

Membran füzyon içinde vitro eğitim fusogenik proteinler genellikle bir membran çapa sahip olarak bir meydan okuma sunar. Onları incelemek için, onları model lipid bilayers içine yeniden oluşturmak için gereklidir. Büyük unilamellar veziküller (LUV) lipid protein etkileşimlerini incelemek için yararlı bir araçtır. Biz burada bir sistem protein reanayasası ve füzyon assays için farklı lipid bileşimleri LUVs yapmak için sunuyoruz. Integral proteinlerin luvs içine yeniden oluşturulması da dahil olmak üzere çeşitli yöntemlerle elde edilebilir, organik solvent aracılı reanayasa, mekanik mekanizmalar, veya deterjan destekli sulandırma4. Biz burada bir yöntem sunuyoruz Drosophila atlastin ön biçimlendirilmiş lipozomlar içine deterjan kaldırma. Bu reanayasa yönteminin avantajları yüksek reanayasa verimi ve lipid bilayer içinde atlastin uygun oryantasyonu içerir. Ayrıca, bu yöntem sayesinde, protein kurutulmaz veya organik çözücülere maruz kalmaktadır, böylece yapı ve fonksiyon sürdürüyor. Dezavantajları arasında, deterjanların varlığı tüm proteinler için ideal olmayabilir ve son proteoliposomların lipid bilayer içinde bazı entegre deterjan olabilir. Daha fazla diyaliz daha fazla deterjan ortadan kaldırmak için kullanılabilir. Ancak diyaliz uzun sürebilir ve bu nedenle protein aktivitesinin kaybına neden olabilir.

Atlastin 'in füzyon aktivitesinin değerlendirilmesi, daha önce açıklandığı gibi lipid karıştırma kavramında belirlenir2. Burada, biz N-(7-nitrobenz-2-Oxa-1, 3-diazol-4-il (NBD)/Lissamine Rhodamine-B sülfonil (Rhodamine) etiketli lipidler yoluyla atlastin aracılı füzyon ölçmek için bir yöntem betimlemek. Bu tahlil donör (etiketli) proteoliposomes ve Acceptor (etiketlenmemiş) proteoliposomes füzyon gerektirir. Bir donörün seyreltmesi olarak reaksiyon sırasında bir FRET sürümü ölçülebilir – membran füzyon sırasında lipid karıştırma sonucunda "etiketli" lipozomlar "etiketlenmemiş" liderecede ' den alıcı çifti (Şekil 1)5. Bu tahlil membran füzyon için bir vekil olarak hizmet ederken, membran füzyon ve hemifüzyon arasında ayırt sınırlıdır, bir devlet nerede sadece dış broşürler karışımı. Bu sorunu gidermek için, alternatif olarak NBD 'nin dithionite tarafından dış broşür giderici olduğunu. NBD/Rhodamine lipid karıştırma gibi aynı metodoloji takip, dış broşürün füzyon tarafından herhangi bir NBD FRET serbest Quenching üzerine iç broşür karıştırma8nedeniyle olacaktır.

Alternatif füzyon iç sulu içerik karıştırma adresi tam füzyon sadece5tarafından görülmektedir. Bu örnekler Terbiyum (TB)/dipicolinik asit (DPA) deneyleri ve aminonaphthalene trisulfonik asit (karıncalar)/p-Xylene bis (pyridinium) bromür (DPX) deneyleri. TB/DPA 'da, kapsüllenmiş TB olan lipozomlar havuzu karışık ve kapsüllü DPA ile lipozomlar ile kaynaşıyor; Füzyon üzerine, floresans [TB (DPA)3]3- şelasyon kompleksi6içinde DPA 'dan TB 'ye dahili enerji aktarımı ile artar. Buna karşılık, ANTS/DPX için, ANTS floresans DPX7tarafından söndürülün. Bu sistemler iç içeriği karıştırırken, lipozomların daha derinlemesine hazırlanması, kapsüllenmeyen reaktiflerin kaldırılması ve fluorophorlerin istenmeyen etkileşimi için gereklidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. GST-DAtl-His8 arıtma

  1. Protein ifadesi ve lysate hazırlığı
    1. BL21 (DE3) E. coli 'yi PGEX4-T32 ' de GST-Datl-His8 yapısı ile dönüştürün ve bir ampikilin plakasını seçin.
    2. 14 mL 'Lik bir kültür tüpünde 5 mL LB + ampisilin (5 μL 100 mg/mL ampisilin) olarak tek bir transformant seçin ve 6-8 h için 200 rpm 'de sallayarak 25 °C ' de inkük et.
      Not: Sızdırmaz ifade nedeniyle, yüksek sıcaklıklarda inkübe etmek tavsiye edilmez. 25 °C ' de büyüme, bu büyüme döneminde protein toplamayı azaltır.
    3. 5 mL kültürden 1 mL 'Lik LB + ampisilin 200 mL 'yi ınoculate ve 25 °C ' de gecede (~ 15 – 18 h) inkük edilir.
    4. Ertesi sabah, santrifüjleme ile hücreleri hasat (2.000 x g 10 dk) ve pelletini içinde 5 ml lb.
    5. Inoculate 4 L LB + ampisilin ve ölçüm OD600 (0.05 – 0.15). Titreyerek 25 °C ' de inküye.
      Not: Bakteri eklemeden önce OD600 ölçümleri için boş olarak hizmet vermek için bazı medya rezerv.
    6. Ölçüm OD600 her saat 0.4 – 0.5 arasında bir od ulaşır kadar. Bu noktada, sıcaklığı 16 °C ' ye azaltın.
    7. 0,2 mM ıPTG (800 μL 1 M stokta) ile birlikte, 10 dakika sonra kuluçkörü 16 °C ' ye ulaşır. Bir gecede (~ 15 – 18 saat) 16 °C ' de inküytir.
      Not: Düşük sıcaklık atlastin toplama azaltarak fonksiyonel protein verimi artırır.
    8. Ertesi sabah, 4 °C ' de 7.500 x g santrifügleme ile hücreleri hasat.
    9. 200 mL A200 (25 mM HEPES (pH 7,4) ve 200 mM KCl) hücrelerinde yeniden resuspend.
    10. 11.000 x g 'de hücreleri 4 °c ' de 5 dakika santrifüjler.
    11. (A200 artı 10% gliserol, 2 mm 2-mercaptoethanol, 4% Triton X-100 (TX100), 40mm imidazol ve bir EDTA-ücretsiz proteaz inhibitörü kokteyl tablet) kırma tampon 40 ml Pelet resuspend.
      Not: Baloncuklar ve köpük üretme önlemek için resuspending sonra TX-100 ekleyin.
    12. Bir 18 G iğne üzerinden geçmek ve üç kez bir hücre bozucu üzerinden hücreleri çalıştırmak ~ 10.000 psi.
    13. 1 saat için 125.000 x g 'de özü Santrifüjü.
      Not: İsteğe bağlı olarak pelet 1:2 (w:v) 8 M Urea ve oda sıcaklığında gecede nutate çözülür. Bir denaturant olarak Urea SDS-PAGE analizi için yavaşça çözünebilir peletli protein çözünür. SDS-PAGE ve Coomassie leke analizi için 1 μL tasarruf edin.
    14. Bakteri ve büyük bakteriyel enkaz kaldırmak için 0,45 μm selüloz nitrat steril membran filtre aracılığıyla ekstresi filtre.
      Not: Isteğe bağlı olarak, SDS PAGE ve Coomassie leke analizi için 1 μL kaydedin.
  2. Benzerliği kromatografi ile protein arıtma
    1. Süzülmüş lysate, ni2 +ile şarj edilmiş immobilize metal benzeşimi Kromatografi (IMAC) reçine sütun üzerine yükleyin, düşük imidazol tampon ile önceden equilibrated (A100 artı 10% gliserol, 2 mm 2-mercaptoetanol, 1% TX-100, 40 mm imidazol) bir hızda 1 ml/ min 4 °C ' de.
    2. Sütunu 25 mL A100 artı% 10 gliserol, 2 mM 2-mercaptoetanol, 0,1% Anapoe X-100, 40 mM imidazol ile 4 °C ' de 1 mL/dak hızında yıkayın. 40 mM 'den 500 mM 'ye kadar imidazol 30 mL doğrusal gradyan ile proteini elute ve 500 mM 'de son 5 mL yıkama.
    3. Havuz birlikte zirve fraksiyonları ve 1 h 4 °C ' de şişmiş GSH-Agarose boncuk ile, daha önce suda şişmiş ve% 10 gliserol, 2 mM 2-mercaptoethanol, 0,1% Anapoe X-100 ve 1 mM EDTA ile A100 içinde dengelenmiş.
      Not: GSH-Agarose boncuklar önceki gün 50 mL su içinde şişebilir ve 4 °C ' de veya RT 'de 1 h 'de bir gecede inküte edilir. Su ve dengeleme tamponunu kaldırmak için, 500 x g 'de 1 dakika frensiz olarak sallanan kova rotorunda santrifüjler. 26 G iğne ile süpernatant aspirate.
    4. Pellet GSH-agarose boncuk 500 x g frensiz bir sallanan kova rotor santrifüjleme ve 26 g iğne ile aspirasyon ile lysate süpernatant çıkarın.
    5. Boncukları 10 mL polyprep sütununa aktarın ve 5 mL Dengeleme tamponu ile beş kez yıkayın (A100% 10 gliserol, 2 mM 2-mercaptoetanol, 0,1% Anapoe X-100 ve 1 mM EDTA), 500 X g 'de santrifüpleme yaparak .
    6. 10 mm azaltılmış glutatyon ile takviyalı 1 – 1,5 ml dengelemesinden tampon ile protein elute. Sıvı nitrojen içinde aliquot elüe protein ve flaş dondurulması. Protein-80 °C ' de süresiz olarak depolanabilir.
      Not: 7,4 için elüsyon tampon pH ayarlayın.
    7. Amonye siyah protein assay tarafından protein konsantrasyonu ölçmek9 ve SDS-sayfa ve Coomassie boyama tarafından saflık değerlendirmek.

2. rekombinant Atlastin lipozomlar içine reanayasası

  1. Ekstrüzyon yöntemiyle Liposome üretim 10 ' dan fazla
    1. Kloroform (10 mM toplam lipid) lipid karışımı stokları olun. Gerekli lipidler 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glisero-3-fosfokolin (POPC), 1, 2-dioleoyl-sn-glisey-3-phospho-L-serine (DOPS), 1, 2-dioleoyl-sn-glisey-3-fosfoetolidin-N-(7-Nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il) (NBD-DPPE), ve 1, 2- Dipalmitoyl-sn-gliserol-3-fosfoetolin-N-(lissamine rodamin B sülfonil) (RH-dppe). Acceptor lipozomlar POPC oluşur: DOPS (85:15 molar oranı) ve POPC donör lipozomlar: DOPS: RH-PE: NBD-PE (83:15:1.5:1.5 molar oranı).
      Not: POPC: DOPS lipid karışımları geleneksel olarak in vitro lipid karıştırma işlemleri için kullanılırken, alternatif lipid bileşimleri farklı Deneysel amaçlar için uyarlanabilir. POPC: DOPS lipozomlar çok kararlı ve sigortalı zor, bu nedenle füzyon için çok sıkı bir sistemdir.
    2. 1 Μcı/mL L-α-Dipalmitoyl-Fosfatidilkolin (Kolin metil-3H) lipid karışımlarına, daha sonraki adımlarla sıvı scintilasyon sayımı ile lipid konsantrasyonlarını belirlemek için ekleyin. Bu stokta en az 8 μL rezerve et.
    3. İstenilen miktarda lipid karışımları, çakmaktaşı cam tüplere aktarın.
    4. Daha fazla kloroform görülene kadar N2 gazının yumuşak bir akışı altında lipid karışımların kuru.
    5. 30 dakika vakumlama ile bir kurutucu içinde daha fazla lipid filmi kuru.
    6. Yeterli sulu A100 ekleyin 10% gliserol, 2 mM 2-mercaptoetanol, ve 1 mM EDTA lipid film ve 10 mM konsantrasyon geri getirmek. Oda sıcaklığında 15 dakika hafifçe vortekslenir tarafından lipid filmi resuspend. Flint cam tüpler barındırabilir bir vorteks tavsiye edilir.
    7. Sıvı azot on kez nemlendirici lipidler dondurmak-çözüyor. Sıvı nitrojen içinde dondurulduktan sonra, solüsyonun 30 s için oda sıcaklığında oturmasına izin vererek lipozomları çözün, daha sonra daha hızlı çözme için suya aktarın. Bu donma-çözülme bisiklet çok amellar veziküller en aza indirir.
      Dikkat: Onlar 0,5 mL 'den büyük birimler içeriyorsa ve doğrudan suya sıvı azot formu aktarıldığında tüpler çatlak olabilir.
    8. Mini Extruder kullanarak 100 Nm gözenek boyutu 19 kez Polikarbonat filtreleri ile lipid geçirin.
    9. Skintilasyon sayımı ile lipozomların toplam lipid konsantrasyonu belirlenmesi
      Not: Bazı lipid cam tüpler ve mini-Extruder geride bırakılabilir.
      1. 3 mL scintilasyon kokteylinde 4 μL lipid stokları ve lipozomlar ekleyin.
      2. Stok ve lipozomlar için dakika başına ortalama sayar (CPMA) ölçün. Ve aşağıdaki formül ile lipozomlar konsantrasyonu hesaplayın:figure-protocol-1
    10. Lipozomları 4 °C ' de bir haftaya kadar saklayın. Lipozomlar zaman ile toplu olabilir olarak daha uzun depolama tavsiye edilmez, reanayasa verimlilikleri azalan.
  2. Önceden biçimlendirilmiş lipozomlar içine deterjan destekli kuruluş ile Reconstitution
    1. Birlikte karıştırılacak tampon, protein, lipozomlar ve ekstra deterjan miktarını hesaplayın:
      1. İstenen toplam hacmi belirleyin. Bu hacim, 10% gliserol, 2 mM 2-mercaptoetanol ve 1 mM EDTA ile A100 tampon oluşur. 250 μL 'den küçük birimler 0,5 mL mikrosantrifüj tüplerde iyi karışmaz.
      2. Yaklaşık 1 mM son lipid konsantrasyonu vermek için gerekli lipozomların hacmini hesaplayın. Birim arabellek biriminden çıkarın.
      3. İstenen protein lipid molar oranı (genellikle 1:400) vermek için gerekli protein hacmini hesaplayın. Arabellek hacmini buna göre azaltın.
      4. 0.64 – 0.8 arasında etkili bir deterjan için lipid oranı (Reff) hedefleyen lipozomları doyurmak için ne kadar ekstra deterjan eklenmesi gerektiğini belirleyin. Protein ile eklenen deterjan düşünün unutmayın. (Reff figure-protocol-2 ) denklem ile belirlenir dToplam toplam deterjan konsantrasyonu ve dsu MONOMERIK deterjan konsantrasyonu (0,18 mm TX-100 ve anapoe X-100 deterjan varlığında)4, 11' den itibaren.
    2. Çözümleri birlikte bir 0,5 mL tüpte aşağıdaki sırada karıştırın: tampon, deterjan, protein ve lipozomlar. Hızla lipozomlar ekleyin ve karışımı homojenize 5 s için hemen girdap.
    3. 4 °C ' de 1 h için bir çatlak içinde reaksiyonu kuluçsa.
    4. Su içinde 0,2 g/ml apolar polistiren adsorban boncuk "bulamaç" olun.
      Not: Adım 2.2.3 yılında önceki 1 h inkübasyon sırasında polistiren adsorban boncuk "bulamaç" olun.
    5. Polistiren adsorban boncuk 0,2 g tartmak ve bir mikrosantrifüj tüp transfer.
    6. Tüp ve karışımı 1 dk için metanol 1 mL ekleyerek boncuklar Degas. gaz edilmiş boncuk batırılır.
    7. Metanol aspirate ve boncuk su ekleyin. Boncuk 5 dakika su ile karıştırın, sonra su Aspire edelim. Dört kez tekrarlayın, sonra su ile 1 ml hacmine polistiren adsorban boncuk "bulamaç" getirmek ve 0,2 g/ml son konsantrasyon.
      Not: Boncuklar hala tüpün altına yerleşmeli. Yoksa, tekrar Degas. Boncuk metanol ve su Aspire için 21 G veya daha yüksek iğne kullanın.
    8. Her numunenin tüm deterjan absorbe etmek için gerekli polistiren adsorban boncuk miktarını hesaplayın. 1 gr polistiren adsorban boncuklar 70 mg TX-100 emer. Her reaksiyon için gerekli polistiren adsorban boncuk Bulamaç hacmi hesaplamak için, reaksiyonda toplam deterjan Böl (adım 2.2.1.4) tarafından 70 mg, ve sonra boncuk Bulamaç konsantrasyonu (0,2 g/ml (adım 2.2.7).
    9. Transfer hesaplanan miktarı polistiren adsorban boncuk Bulamaç için bir 0,5 ml tüp ve Aspire su.
      Not: Boncukları aktarmak için 20 – 200 μL ucunun sonunu kesip, boruyu pipetleme işleminden hemen önce yerleştirerek yerleşmiş boncuklar yeniden pelletini.
    10. Örnekleri eklemek 0,5 ml tüp polistiren adsorban boncuklar içeren ve örnek nutating için 1 h 4 °c ' de kuluçkmak.
    11. Tekrar iki kez eski boncuk geride bırakarak ve taze boncuklar için örnek transfer tekrarlayın.
    12. Numuneyi taze boncuklarla dördüncü bir tüpe ekleyin ve gece (~ 15 – 18 saat) 4 °C ' de inküye yapın.
  3. Sabah, 4 °c ' de 16.000 x g 'de 10 dakika santrifüpleme yapılarak polystyren adsorban boncuk ve Pelet çözünmez protein topaklardan numuneyi çıkarın.
  4. Süpernatant kurtarmak ve sıvı scintıtma sayma ile son lipid konsantrasyonu belirlemek (adım 2.1.9.2 bakın). İsteğe bağlı olarak, protein konsantrasyonu, siyah protein assay tarafından belirlenebilir9.
    Not: Proteoliposomes atlastin için, enzimatik asdalar taze lipozomlar ile yapılmalıdır. 4 °C ' de uzun depolama veya donma, atlastin aktivitesinde önemli bir kaybına yol açar.

3. lipid karıştırma Assays

  1. % 10 gliserol, 2 mM β-mercaptoetanol, 1 mM EDTA ve 5 mM MgCl2ile her biri A100 'de 0,15 mm konsantrasyonuna donör ve alıcı proteoliposomları getirin. Her reaksiyon (50 μL) floresans okumaları için uygun düz beyaz 96 iyi plaka bir kuyu eklenmesi gerekir. Bir triplicate ve No-GTP negatif kontrol dahil olmak üzere en az 4 reaksiyonlar hazırlayın.
  2. Plakayı 37 °C ' de önceden ısıtılmış bir plaka okuyucuya yerleştirin. Ölçüm NBD floresans (Excitation 460 nm ve emisyon 535 Nm) için 5 dk her dk.
  3. 5 mM GTP (5 μL 50 mM GTP) ekleyerek füzyon yaratın.
  4. 1 saat için her dakika NBD floresans ölçmek.
  5. Proteoliposomları çözmek ve maksimum NBD floresans ölçmek için 5 μL 2,5% w/v n-Dodecyl β-D-maltoside ekleyin. NBD floresans her dakika 15 dakika okuyun.

4. ıohexol diskontinü gradyan12 Liposome floatation

  1. isteğe bağlı 13. floatasyon ile reanayasanın verimliliğini analiz edin.
  2. 10% gliserol, 2 mM 2-mercaptoetanol ve 1 mM EDTA ile A100 'de% 80 ve% 30 w/v iohexol hazırlayın. Iohexol kolayca çözülür, bu yüzden bu gece 4 °C ' de nutating bir gün önce hazırlanmalıdır.
  3. 80% iohexol ile 150 μL proteoliposomes numunesi ile 150 μL 'i iyice karıştırın ve% 40 iohexol 'e getirin. Bu Ekle 5 x 41 mm2 Ultra-Clear tüp kaçınarak kabarcıklar.
  4. Layer 250 μL% 30 iohexol stok yavaşça numunenin üstünde bir orta tabaka yapmak için. Herhangi bir kabarcıklar kaçının ve alt katman rahatsız. Orta tabakanın üst kısmında, 2 mM 2-mercaptoetanol ve 1 mM EDTA ile yavaşça 50 μL A100 ekleyin.
  5. 220.000 x g 'de 4 °c ' de yavaş ivme ve mola olmadan sallanan kova rotorunda gradyan Santrifüjü.
  6. Gradyan katmanları hasat ve SDS-PAGE ve Coomassie leke tarafından analiz, ölçüme densitometri tarafından yapılabilir. Reconstituted protein üst katmana yüzer, protein ve lipid agregaları alt veya Orta katmanda tortu olacak iken.

5. Trombin proteolizi ile yeniden şekillendirilmiş proteinin oryantasyonu Analizi

Not: Burada bildirilen atlastin yapısı, N-terminal GST etiketinin sonu ve atlastin başlangıcı arasında bir Trombin kesim sitesi vardır. Doğru yönde atlastin bu kesim sitesi proteaz erişilebilir olacak, yanlış yönde protein lipid bilayer tarafından korunacaktır iken.

  1. Proteoliposome oryantasyon atlastin tahlil için, en az 8 μL taze reconstituted proteoliposomes rezerv.
  2. 8 μL proteoliposomes ve 1 μL 1 U/μL Trombin ekleyin. 37 °C ' de 1 saat boyunca inküye yapın.
  3. 1 μL 5 mg/mL EDTA-ücretsiz proteaz inhibitörü kokteyli ile proteaz giderin ve 37 °C ' de 30 dakika boyunca inküye yapın.
  4. SDS-PAGE ve Coomassie lekesi ile numuneyi analiz edin. Kırpılmış ve uncleaved protein oranı densitometri ile belirlenebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Atlastin reanayasasının verimliliği Şekil 2' de sunulmuştur. Reconstituted proteoliposomes bir ıohexol kesintisiz gradyan içinde süzülmüştü. Unıncorporated protein alt katmanda (B) veya Orta katmanda (M) posalı oldu. Reconstituted protein üst katmanda (T) yüzer. Gradyan örnekleri, SDS-PAGE ve Coomassie boyama tarafından hasat edilmiş ve analiz edilmiştir. Jelin densitometri ile ölçülmesi, ihmal edilebilir kaybeder ile reanayasanın çok yüksek bir verimliliğini gösterir; Toplam proteinin% 96 '...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Buradaki Yöntemler, rekombinant atlastin 'in füzyon aktivitesini arındırmak, reconstituting ve ölçmek için verimli bir yöntem tarif ederler. Bazı kritik adımlarla fonksiyonel atlastin yüksek verim sağlamak için dikkate alınmalıdır. Atlastin ifadesi, toplama işleminden kaçınmak için düşük sıcaklıklarda (16 °C) yapılmalıdır ve bir adet 0.4 – 1.5 mg/mL arasında son bir konsantrasyon hedeflemelisiniz. Çok seyreltilmiş protein bir 1:400 protein lipid oranı en iyi şekilde reconstituted olmayacaktır. Reanayasa verimliliği, bura...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Dr. Michael Stern ve laboratuvarına, atlastin ile ilgili projelerdeki görüşleri ve geribildirimlerine teşekkür ederiz. Bu çalışma ulusal genel Tıp Bilimleri Enstitüsü [R01GM101377] ve nörolojik bozukluklar ve Inme Ulusal Enstitüsü tarafından destekleniyordu [R01NS102676].

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10 mL poli-prep kromatografi kolonlarıBiored731-1550
10 mm x 75 mm Çakmaktaşı cam tüplerVWR608225-402
47 mm çap, 0,45 & mu; M gözenekli Whatman steril membran filtreleriWhatman7141 104
96 kuyu beyaz plakaNUNC437796
Anapoe X-100Anatrace9002-931-1
Hücre bozucuAvestinAvestin Emulsiflex C3
DOPS (1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfo-L-serin (sodyum tuzu))Avanti840035P-10mgDOPS
EDTAAraştırma organikleri a.ş.6381-92-6Etilendiamintetraasetik asit
EDTA içermeyen proteaz inhibitörü kokteyliRoche11873580001Komple proteaz inhibitörü
EkstruderSigma AldrichZ373400 Liposofast Temel Ekstruder
GE Akta Prime sıvı kromatografi sistemiGE Pharmacia8149-30-0006
Glutatyon agaroz boncuklarıSigma aldrichG4510-50ml
GliserolEMDGX0185-5
GTPSigma Aldrich36051-31-7Guanozin 5 'trifosfat sodyum tuzu hidrat
HEPES, asitsizOmnipur5330
İmidazolfluka5670
İmmobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) reçine sütunuGE Healthcare170408011 mL HiTrap Şelatlama HP immobilize metal afinite kromatografi kolonları
IohexolDoğru kimyasal ve bilimsel şirketAN 7050 BLKAccudenz/Nycodenz
IPTGAraştırma ürünleri uluslararası corp.I56000-100.0IPTG, dioksan içermeyen
L-Glutatyon azaltılmışSigma-AldrichG4251-5g
Magnezyum klorürFisher7791-18-6
MetanolOmnisolvMX0488-1
NBD-DPPE (1,2-dipalmitoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-(7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4-il) (amonyum tuzu))Avanti236495NBD-DPPE
n-Dodesil ve beta;-D-maltosideChem-Impex International21950
Polar olmayan polistiren adsorban boncuklarBioRad152-3920SM2 Biobeads
Nüklepore iz-aşındırma polikarbonat 19 mm 0.1 & mu; m gözenek zarıWhatman800309
Optima LE80K Ultra santrifüjBeckman Coulter
Fosfatidilkolin, L-&alfa;-dipalmitoil [kolin metil-3H]ARCART0284Titriasyonlu lipitler
Plaka okuyucuTECANTECAN sonsuz M200 plaka okuyucu
POPC (1-palmitoil-2-oleoil-glisero-3-fosfokolin)Avanti850457C-25mgPOPC
Potasyum klorürMP151944
Rh-DPPE (1,2-dipalmitoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-(lissamin, rodamin B sülfonil) (amonyum tuzu))Avanti236495Rh-DPPE
Sintilasyon KokteyliUlusal TeşhisLS-272Ecoscint XR Sulu veya susuz numuneler için sintilasyon çözeltisi
Parıldama şişelerBeckman592928Hızlı dönüş kapağı Mini Poly-Q Flakon
TrombinSigmaT1063-1kUİnsan plazmasından trombin
Triton X-100FisherBP151-500
Ultra şeffaf santrifüj tüpleri 5 mm x 41 mmBeckman344090
Vorteks 9 ila 13 mm Tüp TutucuVWR58816-138Çakmaktaşı cam tüpleri
girdaplamak için uçVorteks Ekleme TutucuVWR58816-132Vorteks tüp tutucusu için gerekli
tutucu VortexerVWR2.235074Vortex Genie 2 modeli G560
ve beta; -merkaptoetanol moleküler biyoloji sınıfıCalbiochem444203

Kaynaklar

  1. Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M. Mechanics of membrane fusion. Nature Structural and Molecular Biology. 15, 675-683 (2008).
  2. Orso, G., et al. Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin. Nature. 460, 978-983 (2009).
  3. McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F. GTP-dependent membrane fusion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 529-550 (2013).
  4. Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).
  5. Düzgüneş, N. Fluorescence Assays for Liposome Fusion. Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).
  6. Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents. Biochemistry. 19, 6011-6021 (1980).
  7. Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes. Biochemistry. 24, 3099-3106 (1985).
  8. Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).
  9. Schaffner, W., Weissmann, C. A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution. Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).
  10. MacDonald, R. C., et al. Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles. Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).
  11. Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate. Biochemistry. 27, 2668-2677 (1988).
  12. Scott, B. L., et al. Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines. Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).
  13. Zhang, W., et al. Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association. PNAS. 114, 8550-8555 (2017).
  14. Parlati, F., et al. Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the α-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain. PNAS. 96, 12565-12570 (1999).
  15. Sugiura, S., Mima, J. Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p. Scientific Reports. 6, 20407(2016).
  16. Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543, 257-260 (2017).
  17. Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer. Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Lipozom Rekonstit syonuDeterjan Uzakla t rmaFRET Lipid Kar mMembran F zyon AnaliziProteolipozom Olu umuLipid ift Katman ModeliAfinite KromatografisiSDS PAGE AnaliziNBD Floresans
Rekombinant Drosophila , lipid karıştırıcılar Için lipozomlar halinde deterjan destekli yeniden yapılanma
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.